1) Dada la siguiente secuencia nucleotídica en el DNA:

a) ¿Cuál es la dirección de transcripción?

b) Indique cuál es la cadena que se transcribe. Explique cómo llega a esa conclusión.

c) ¿Cuál será la secuencia nucleotídica en el RNA transcripto?

d) ¿Cuántos enlaces P de alta energía se hidrolizan en la síntesis de este RNA?

e) El RNA es un mRNA que codifica para un pequeño péptido:

i) Indique cuál será la señal de iniciación y terminación de la traducción.

ii) Escriba la secuencia de aminoácidos del péptido (utilice la tabla con el código genético que figura en sus apuntes)

iii) Indique cuál será el aminoácido N-terminal y cuál el C-terminal del péptido.

2) Dada la siguiente secuencia de ADN:

a) ¿Qué productos obtendría por transcripción?

b) ¿Dónde deberían ubicarse los promotores para obtener los productos mencionados por Ud. en (a)?

c) Señale todos los marcos de lectura abiertos que encuentre.

d) ¿Qué productos obtendría por traducción de los marcos de lectura abirtos mencionados por Ud. en (c)?.

e) ¿Cuál de los productos encontrados por Ud. en (d) será más insoluble?

f) ¿Cómo será la Tm de esta doble cadena respecto del promedio de un organismo que vive en ambientes templados?

3) Entre los tRNA de Escherichia coli uno muy poco abundante es el tRNAArg con el anticodón UCU, el cual reconoce el codón AGA. Cuando se analizó el gen que codifica para este tRNA se observó que en las posiciones -10 y -35 se encuentran las mismas secuencias consenso que en los promotores de los otros tRNAs, más abundantes. La baja proporción de este tRNA podría deberse entonces a secuencias moduladoras que se encontrarían hacia el 5' o hacia el 3' de la región comprendida entre las secuencias consenso a -35 y -10. En dichas regiones podrían encontrarse elementos de secuencia que disminuyan la fuerza del promotor.

Para investigar esto, diversas regiones de DNA que comprenden el promotor del gen correspondiente de E. coli, llamado argU, más ciertas regiones hacia el 5' y hacia el 3' se clonaron en el plásmido pKK232-8. Un esquema de dicho plásmido se muestra en la Figura 2.11. Dicho plásmido lleva el gen CAT (cloramphenicol amino transferasa). La actividad cloramphenicol amino transferasa es fácilmente cuantificable. El gen CAT se ha insertado sin promotor, encontrándose el extremo 5' de su región codificante inmediatamente hacia el 3' del polylinker. Además, entre el polylinker y el AUG del gen CAT hay codones de terminación para los tres marcos de lectura posibles. El plásmido lleva también el gen Ampr, que codifica para la b -lactamasa y un origen de replicación deel plásmido pBR322. Este último es un plásmido de alto número de copias en E. coli.

Las actividades CAT y b -lactamasa obtenidas de clones que contienen diversas regiones de DNA del gen argU comprendiendo su promotor se muestran en la Tabla 2.2. Se indica, en la segunda columna comenzando de la izquierda ("argU region") cuáles son las regiones comprendidas, siendo +1 la posición de la primera base del transcripto. Como controles, se incluyeron clones llevando el plásmido pKK232-8 sin inserto o el plásmido ptac1, que es el plásmido pKK232-8 al que se insertó el promotor del operón lactosa.

Se realizaron además dos mutaciones puntuales: A-7® T y C-8® A, que significa que la adenina en la posición 7 fué cambiada a timina y la citosina en la posición 8 fué cambiada a adenina. Las actividades CAT y b -lactamasa de clones conteniendo diversas regiones de DNA del gen argU con estas mutaciones también se dan en la Tabla 2.2, en las últimas cinco filas. Además, la Figura 2.12 muestra la secuencia de la región comprendida entre -3 y +28 indicándose dónde se encuentran las mutaciones.

a) Describa qué es un promotor y respecto de sus secuencias, explique:

a1) ¿Qué son "secuencias consenso"?.

a2) ¿Qué particularidad tienen las que se encuentran a -35 y -10 en los promotores procarióticos?.

a3) ¿Cuál es su rol?

b) Dado que el tRNAArg con el anticodón UCU es muy poco frecuente, ¿cree que el codón AGA tambén lo será en el genoma de E. coli?. Si la respuesta fuera negativa, ¿cree que la muy baja relación del tRNA respecto de su codón retrasará la síntesis de proteínas respecto de lo que ocurriría si la relación fuese más pareja?. Si la respuesta fuera afirmativa ¿cree que esto implica que las proteínas de E. coli se caracterizan por poseer en su composición muy poca arginina?. Balancee ambas posibilidades y prediga qué ocurre en la realidad.

c) Explique breve y claramente cómo se clonaron las regiones de DNA conteniendo el promotor del gen argU, indicando si cree necesario que el hospedante sea una cepa de E. coli argU- y qué función cumplen en el plásmido pKK232-8:

c1) El gen CAT.

c2) El gen Ampr.

c3) El polylinker.

c4) Los codones de terminación en los tres marcos de lectura en el 5' del AUG del gen CAT.

c5) El origen de replicación del plásmido pBR322.

d) Interprete, en relación a lo que se está investigando de acuerdo al enunciado del problema, la Tabla 2.2 (excepto los mutantes, últimas cinco filas). Indique qué información le suministran la actividad CAT, la actividad b -lactamasa y la relación de actividad CAT/b -lactamasa (Ratio CAT/b -lactamasa), que se muestran en las tress columnas de la derecha. Indique además qué función cumplen en el experimento los clones que llevan el plásmido pKK232-8 sin inserto y el plásmido ptac1, y qué información obtiene de ellos.

e) Mire atentamente la secuencia de la Figura 2.12. ¿Cuál puede haber sido el efecto de las mutaciones A-7® T y C-8® A y cómo relaciona esto con la actividad observada para estos mutantes en la Tabla 2.2 (últimas cinco filas) respecto del resto?. ¿Cómo mejoraría el experimento para obtener una información más concluyente?