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SEMINARIO 3 |
NUCLEOTIDOS Y ACIDOS NUCLEICOS
1) Una solución de DNA doble cadena es calentada y luego enfriada rápidamente. Explique cómo cambiará la absorbancia a 260 nm durante el enfriamiento, si:
a) La solución fue calentada hasta una temperatura algo menor que Tm.
b) La solución fue calentada hasta una temperatura algo mayor que Tm.
c) Explique lo que esperaría observar si la molécula de DNA utilizada fuera:
c1) Simple cadena, con la secuencia:
CTTGAACCGTCGACGGTTCAAG
c
2) Doble cadena, con la secuencia:
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
En ambos casos el experimento se realiza como en la situación b).
Nota: Suponga que la longitud de los polinucleótidos no tiene incidencia, y que las mismas conclusiones que Ud. obtenga, se aplican igualmente a cadenas mucho más largas.
2) Suponga que Ud. posee una muestra desconocida de ácido nucleico y se le pide caracterizarlo. Se encuentra lo siguiente:
a) Una transición abrupta de la absorbancia con el aumento de temperatura, siendo la hipercromicidad del 30%. Con un enfriamiento rápido se observa una pequeña disminución de la DO.
b) El material no desnaturalizado forma una sola banda en un gradiente densidad de CsCl a 1,77 g/cm
3.c) Luego de desnaturalizarlo por calentamiento y enfriarlo rápidamente (como en a) se recentrifuga, con lo cual desaparece la banda original y aparece una a 1,72 g/cm
3. Dicha banda contiene la mitad del material capaz de absorber UV respecto de la anterior. Si el contenido del tubo se mezcla, luego de lo cual se mantiene a una temperatura intermedia (que permitiría la renaturalización) y se vuelve a centrifugar, la banda de 1,72 g/cm3 desaparece, y reaparece la banda original a 1,77 g/cm3, conteniendo también todo el material capaz de absorber UV observado la primera vez.d) Se repite la secuencia de pasos descripta en (c), excepto que antes de centrifugar, el material es tratado por 1 hora a pH=12,0 y renaturalizado rápidamente a pH=7,0. El resultado de la primera centrifugación es igual al de (c), pero la banda de 1,72 g/cm
3 permanece después de todos los pasos de renaturalización.Interprete cada uno de estos resultados y deduzca la estructura del ácido nucleico problema.
3) Se obtuvo un ácido nucleico parcialmente purificado y se lo sometió a electroforesis en agarosa, resultando una única banda (carril A en la Figura 1.4) Cuado a dicha muestra se la digirió con DNAsa (enzima que hidroliza DNA pero no RNA), se observó la banda del carril B. En otro ensayo, la muestra fue incubada con b -mercaptoetanol, observándose la banda ddel carril C. Si a continuación del tratamiento con b -mercaptoetanol se digiere con DNAsa, se obtiene el resultado del carril D. En el carril E se corrieron los marcadores de peso molecular.
Explique cada uno de los resultados, especificando:
a) ¿A qué macromoléculas se deben?
b) ¿Cuáles son sus pesos moleculares?
c) ¿Qué tipo de interacciones están involucradas?
d) ¿Con qué experimento/s confirmaría su respuesta?
Figura 1.4
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