1) En la Figura 2.13 se muestra el mapa de restricción de una región del genoma de Staphylococcus aureus. Puede observarse la ubicación de los genes hsp 20, hsp 70 y hsp 40, que codifican proteínas de estrés térmico (heat shock proteins). Además, se muestran dos marcos de lectura abiertos (open reading frames): orf 37 y orf 35. Las secuecias nucleotídicas de estos marcos de lectura abiertos se muestran en las Figs. 2.14 y 2.15.

Figura 2.13

Figura 2.14

Figura 2.15

a) Explique qué es un mapa de restricción y cómo se obtiene.

b) Explique qué es un marco de lectura abierto y cómo se lo identifica en una secuencia nucleotídica.

c) Analice los marcos de lectura abiertos orf 37 y orf 35, ubicando en ellos todos los elementos que considere importantes.

d) ¿Cómo haría para identificar a qué proteínas codifican estos orfs?.

e) ¿Cómo haría para confirmar que dichas proteínas se expresan en Staphylococcus aureus?.

J. Bacteriol. 176: 4780-81 Fig. 2 (1994)

2) El desarrollo del tumor de próstata está relacionado con la edad y se cree que progresa por una serie de cambios genéticos y selección de células con carácter crecientemente maligno. En las células epiteliales normales se encuentra un receptor específico para el factor 7 de crecimiento del fibroblasto (FGF-7), que es producido por las células del estroma en respuesta a péptidos como el andrógeno. La especificidad del mencionado receptor epitelial se debe al splicing alternativo de uno de los tres exones que codifican el extremo carboxilo terminal del dominio extracelular en el gen del receptor del FGF-7, llamado FGF-R2 (Fig. 2.16). Si este splicing alternativo se produce erróneamente, el FGF-R2 poseerá el exón IIIc en vez del IIIb, con lo cual dejará de reconocer al FGF-7, perdiéndose así el control del crecimiento y la proliferación del tejido epitelial (desencadenamiento de tumor maligno). Esto se comprobó mediante la generación de una sonda de DNA que hibrida específicamente con 159 pb de la región codificante común precedente a los exones alternativos IIIb y IIIc, pero que hibrida además con 19 pb del exón IIIb (Fig. 2.17a). Se extrajo mRNA maduro de células epiteliales normales (NP) o de tumores benignos, que revierten ante un tratamiento con andrógeno (DT, DT-E), células estromales benignas, que carecen de FGF-R2 (DT-S), células malignas (AT3, E, Eo) y células malignas transformadas, que expresaban los dos tipos FGF-R2: con el exón IIIb y con el IIIc (SE). A dichos RNAs se los hibridó toda la noche a 50oC con la sonda marcada radioactivamente, luego se los digirió con RNAsa T1 y A durante 30 minutos a 30oC y los productos de la digestión se separaron por electroforesis en poliacrilamida. Finalmente, la ubicación de las bandas se realizó mediante autorradiografía (Fig. 2.17b; en la primera calle se muestra el resultado de una hibridación de esta sonda contra tRNA y en el panel inferior, un control en el que se usó una sonda contra un fragmento del gen de la b -actina frente a la misma población de mRNAs; en cada reacción se hibridizó un total de 20 m g de RNA).

a) ¿Dónde se produce el splicing alternativo y qué tipo de información genética requiere?

b) Identifique en el esquema de la Fig. 2.16 las regiones que se treducirán en las dos opciones mostradas en la Fig. 2.17a.

c) Explique el resultado de la Fig. 2.17b, incluyendo el rol de los controles.

Figura 2.17

Esquema del gen FGF-R2. Las flechas y las líneas de puntos verticales indican la posición de los intrones. Los números encima de las flechas indican el tamaño de cada intrón en kilobases. Los números debajo de las regiones codificantes, que se encuentran entre las líneas de puntos representan los exones. El tamaño del intrón entre 5 y 6 (IIIa y IIIb) se desconoce. La caracterización de la región marcada en la región 5' del gen aún es incompleta. Líneas cruzadas en el 5': secuencia no traducida; secuencia líder hidrofóbica: rectángulo negro; dominio altamente acídico: rectángulo blanco, secuencia específica para el receptor secretado: línea ondulada; secuencias transcriptas que se transforman en la secuencia 3' no traducida única de los mRNA que codifican la forma secretada del receptor: línea en zig-zag; dominio transmembrana: rectángulo rayado, dominios kinasa 1 y kinasa 2: rectángulos con puntos; secuencias transcriptas que se transforman en la secuencia 3' no traducida específica de transcriptos que codifican formas de membrana del receptor: línea gruesa. Las tres secuencias codificantes alternativas para la segunda mitad del dominio Ig se indican como IIIa, IIIb y IIIc

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