1) La carboxipeptidasa A hidroliza péptidos desde el extremo carboxilo. A partir del sustrato (benzoilglicil-glicil-L-fenilalanina), dicha enzima cataliza la liberación de fenilalanina. La reacción es inhibida por el fenil propionato. Las velocidades observadas, en presencia y en ausencia del inhibidor, para diferentes concentraciones del péptido se representan en la Tabla 3.12.

a) Calcule Km y Vmax.

b) Indique cómo actúa el inhibidor y cuál es el valor de Ki

2) Se estudió la cinética de la reacción catalizada por la amidasa de Pseudomonas aeruginosa:

CH3-CH2-CONH2 + H2O ® CH3-CH2-COOH + NH3

en ausencia y en presencia de urea. Se obtuvieron los resultados de velocidades iniciales de hidrólisis de la amida (en presencia de una concentración constante de enzima) que se muestran en la Tabla 3.13.

a) ¿Cuál es el Km de la amidasa?

b) ¿Qué significado tiene la velocidad de catálisis expresada como velocidad inicial?

c) Calcule cuántas unidades enzimáticas contenía la mezcla de reacción, siendo una unidad igual a la cantidad de enzima que produce 0,1 µmol de NH3 por min.

d) ¿Qué tipo de inhibidor es la urea?. Fundamente analítica y gráficamente.

e) ¿Cómo cambiaría la velocidad inicial (sin urea) si se aumenta cinco veces la cantidad de enzima?

f) ¿Es válido usar el dato de consumo de propionamida en 10 minutos como velocidad inicial cuando la concentración es 20 mM?

3) Se estudia la cinética de una enzima llamada esterasa, cuya función consiste en catalizar la hidrólisis de ciertos ésteres. Para ello se mide la cantidad de ácido resultante por valoración con NaOH 0,01 N. La reacción se lleva a cabo a pH constante en 10 ml de mezcla de reacción, con distintas concentraciones de éster, a distintos tiempos y con una dada concentración de esterasa. En paralelo, se estudia el efecto que produce la presencia de cierto polipéptido del que se sabe que actúa como inhibidor, en las mismas condiciones, y con una concentración de polipéptido de 4,5 mM. En la Tabla 3.14 se muestran los resultados del experimento:

a) ¿Cree necesario realizar una curva de calibración?. Si su respuesta fuera afirmativa, ¿Cómo la haría?.

b) Calcule la actividad de la esterasa presente, en "unidades de esterasa", definidas como la cantidad de enzima que en 1 min es capaz de hidrolizar 1 µmol de éster en 10 ml de mezcla de reacción.

c) Encuentre qué tipo de inhibidor es el polipéptido agregado, y calcule su Ki.

4) Se realizaron determinaciones de la actividad de la b -galactosidasa utilizando cantidades coonstantes de enzima y concentraciones variables de sustrato. Los datos obtenidos cuando se realizaron las incubaciones a 35oC se muestran en la Tabla 3.15.

Las determinaciones a otras temperaturas dieron por resultados las Vmax que figuran en la Tabla 3.16

a) Determine los Vmax y Km a 35oC. Justifuque con cálculos y gráficos los resultados.

b) Determine la energía de activación (Ea) de la b -galactosidasa.

Tabla 3.16

5) Se ha observado que los extractos de raíces de cierto arbusto patagónico tienen actividad anticancerígena en ratones. También, que el mismo extracto posee actividad de ß-galactosidasa, y que cuando se ensayan en presencia de un análogo no hidrolizable del ONPG, llamado NTG, pierden tanto la actividad anticancerígena como la actividad ß-galactosidasa.

Esta observación llevó a la hipótesis de que ambas actividades corresponden a la misma molécula, lo cual es muy atractivo para la compañía farmacéutica que acaba de contratarlo, ya que de ser cierto, se podría preparar una droga contra el cáncer con la ß-galactosidasa de dicho arbusto. La primera parte de su contrato exige que Ud. purifique la enzima, y que repita los ensayos de actividad anticancerígena y ß-galactosidasa con la enzima pura, a fin de poner a prueba la hipótesis.

Suponga que su purificación arrojó los resultados de la Tabla 3.17

Además, en un análisis por PAGE-SDS, el producto de la última etapa da una banda ancha en la región de 180 a 200 kDa.

a) Calcule cuántas veces se purificó la enzima.

b) ¿Considera que la enzima ha sido adecuadamente purificada como para poner a prueba la hipótesis que se planteó?. Si su respuesta es negativa, diga qué haría para alcanzar (y certificar) la pureza deseada. Si su respuesta es positiva, explique cuál es el grado de pureza que cree que existe en su muestra, y por qué le parece suficiente.

Supongamos que la enzima se purificó adecuadamente, y se pasó a la siguiente etapa de su contrato, que contempla el análisis cinético. Los resultados obtenidos con 1 ml de la suspensión de enzima purificada se muestran en la Tabla 3.18.

Diversas diluciones de la enzima inyectada en lotes de a 20 ratones por tratamiento, a los que previamente se había provocado cierto melanoma, arrojan los resultados de la Tabla 3.19.

Los números entre paréntesis indican el número de animales que sobrevivió al ensayo el tiempo suficiente para cuantificar las metástasis.

a) ¿Cuál es la actividad (medida en µmoles de ONPG hidrolizados por minuto) contenida en el ml de enzima purificada?

b) ¿Cuál es su Km por el ONPG?

c) ¿Qué tipo de inhibidor es el NTG?

d) ¿Qué conclusiones saca respecto de la hipótesis planteada?. En función de las mismas, sugiera (en forma somera) un plan de acción para obtener la droga que se pretendía.

6) Se estudió la actividad de las DNA polimerasas a y d en la replicación del DNA del virus eucariota SV40. En la Tabla 3.20 se muestra los resultados obtenidos cuando estas enzimas se incubaron in vitro con DNA, dCTP, dGTP, dTTP cada uno en concentración 20 m M, cofactores, otras enzimas necesarias para la replicación y [a -32P] dATP en concentraciones variables (ver Tabla 3.20) en presencia o en ausencia de butilfenil dGTP (BuPdGTP) o afidicolina. La actividad enzimática se midió por incorporación de marca en DNA, y se expresó como m Ci (precipitables con ácido tricloroacético) incorporados por minuto.

Por medio del mismo sistema de reacción, (en el que ahora se mantuvo la concentración de
[a -32P] dATP a 20 m M) se aisló intermediarios de la replicación, obtenidos durante incubaciones de 2 minutos en presencia de BuPdGTP y/o afidicolina, con ambas enzimas. A dichos fragmentos se los separó por electroforesis en geles de poliacrilamida con urea 8 M, y se observó sus tamaños por autorradiografía (Figura 3.3).

En otro ensayo, se incubó las mezclas de reacción (con ambas enzimas y BuPdGTP o afidicolina) durante distintos tiempos en presencia de [a -32P] UTP y con los cuatro dNTPs sin marca. Se separó los productos por electroforesis y autorradiografía, en las mismas condiciones del ensayo anterior (Figura 3.4). Los productos contenidos en las bandas mayoritarias (las que contenían más material) se digirieron exhaustivamente con DNAsa y se sometieron a una nueva electroforesis (Figura 3.5).

a) Calcule Vmax y Km para cada enzima y Ki para cada inhibidor. ¿Con qué región de la enzima cree que interactúa cada uno de los inhibidores?

b) ¿Qué condiciones experimentales se deben satisfacer para que sean válidos los resultados de los cálculos hechos en (a)?

c) ¿A qué tipos de intermediarios de la replicación corresponde cada uno de los grupos de pesos moleculares que se observa en la Figura 3.3?

d) ¿En qué región de los ácidos nucleicos nuevos se encuentra la marca que se observa en la Figura 3.4? ¿Qué tipos de intermediarios representa cada región de pesos moleculares en la Figura 3.4? ¿Puede corroborar estos resultados con los de la Figura 3.5?

e) En base a los resultados discutidos en este problema ¿qué rol asignaría a la DNA pola y qué rol a la DNA pold en la replicación del virus SV40?

Figura 3.3 

Figura 3.4

 Figura 3.5

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