1) Haga un esquema del plásmido construído en el problema 5 del Seminario 10, señalando: qué clase de origen de replicación utilizaría, dónde se ubicaría, dónde se encontrarían los sitios de restricción para el clonado, dónde se encontraría el inserto y ubique la región del promotor y la región codificante de lacZ. Además, mencione qué tipo de sistema de selección utilizaría para obtener las bacterias transformadas y qué necesitaría en el plásmido para utilizar dicho sistema.

2) Para clonar un gen de una planta medicinal se ha purificado su mRNA y con él se sintetizó el correspondiente cDNA.

a) Suponiendo que el cDNA está marcado radioactivamente, ¿cómo lo utilizaría para encontrar al gen en una biblioteca genómica de dicha planta?

b) ¿Espera encontrar una secuencia nucleotídica idéntica a la del cDNA? ¿Por qué?

c) De acuerdo a lo respondido por Ud. en b) ¿Era necesario utilizar a todo el cDNA como sonda, o le hubiera bastado con un fragmento más pequeño?.

3) Una proteína de la bacteria causante de la tos convulsa, Bordetella pertussis, actúa en el reconocimiento del tejido humano a ser atacado por el microorganismo, razón por la cual es posible utilizarla en el diseño de una vacuna acelular. Está codificada por un gen contenido en una región de 2,2 kb definida por sitios de restricción para PstI en el extremo 5' y HinDIII en el 3'. Además, posee un sito EcoRI a 600 pb "cuesta abajo" del extremo 5'. La proteína codificada por dicho gen tiene 300 aminoácidos de longitud.

a) Haga un esquema de la región mencionada y diga dónde se encontrará probablemente la región codificante.

b) ¿Qué vector utilizaría para expresar dicha proteína en E. coli?. ¿Y en células BHK?. ¿Qué sistema será más conveniente?

c) Haga una somera descripción del vector, indicando el tipo de promotor que llevaría y su situación con respecto al/los sitios de inserción. Diga también cuáles serían estos y qué situación tendrían entre sí.

d) ¿Colocaría el inserto bajo el control de un gen regulador?. Si su respuesta es afirmativa, mencione qué regulador elegiría y dónde se encontraría.

e) ¿Cómo haría para que la orientación de la región codificante sea la correcta en términos de que la transcripción y traducción de la proteína tengan lugar?

f) ¿Cómo seleccionaría los transformantes?

g) ¿Cómo confirmaría que la proteína se está expresando?

h) ¿Cómo confirmaría que la proteína es activa?

i) ¿Cómo confirmaría que la proteína sirve como vacuna acelular?

j) Suponga que todas las respuestas anteriores satisfacen sus objetivos. ¿Cómo podría obtener la proteína para su utilización como vacuna?. ¿Qué grado de pureza requeriría y cómo evaluaría esto último?.

4) Ud. desea estudiar el efecto de cierta droga sobre la expresión de un gen relacionado con el desarrollo embrionario. Para ello, posee un sistema de cultivo celular in vitro y un clon de dicho gen en pUC18 (ver el mapa del pUC18 en la Figura 5.1). Explique cómo utilizaría dichos materiales para su estudio, y si alguno de ellos no sirve, proponga un reemplazo y describa cómo lo efectuaría.

5) Se purificó piruvato deshidrogenasa (PDH) de Escherichia coli, la que se analizó por PAGE-SDS, dando por resultado 3 polipéptidos (Figura 5.2, calle A). Los mismos se aislaron y se identificaron como el componente piruvato deshidrogenasa, (Fig. 5.2, calle B), dihidrolipoamida transacetilasa (Fig. 5.2, calle C) y dihidrolipoamida deshidrogenasa (Fig. 5.2, calle D). La actividad específica de la PDH purificada de cultivos crecidos en presencia de piruvato o de su análogo a -cetobutirato fue similar a la de PDH puurificada a partir de cultivos crecidos sin piruvato ni a -cetobutirato. Sin embargo, cuando se midió la actividad específica de extractos crudos de cultivos crecidos en medio mínimo conteniendo glicerol con o sin piruvato o a -cetobutirato, se obtuvo el resultado dee la Figura 5.3. Una alta actividad específica de PDH se pudo observar también con mutantes incapaces de producir tiamina, creciendo sin agregado exógeno de piruvato. Este efecto fue parcialmente reprimido por el agregado de glucosa, y no se observó si se añadía acetato o intermediarios del ciclo de Krebs a cultivos que crecían en un medio mínimo conteniendo glutamato de Na como única fuente de carbono. Además, se observó una fuerte inhibición de la actividad específica de PDH de extractos crudos de bacterias crecidas en anaerobiosis.

En otros estudios se pudo determinar que la PDH está codificada en un operón, cuya estructura se muestra en la Figura 5.4. Extractos crudos de mutantes que llevaban una deleción en el gen pdhR mostraban una alta actividad específica de PDH en presencia o en ausencia de piruvato (ver Fig. 5.6). Para estudiar la expresión in vivo de este operón se construyeron proteínas de fusión en las que el gen lacZ se clonó en un vector de expresión bajo el control de las regiones indicadas como "1", "2" y "3" en la línea que dice "lacZ Fusions" en la Figura 5.4, y dicho vector se introdujo en una cepa de E. coli lac- con el fin de utilizar la actividad de b -galactosidasa resultante (medida como <m moles de ONPG hidrolizados por minuto) como reportadora de la expresión de los promotores mencionados.

La Figura 5.5 muestra la expresión in vivo de las proteínas de fusión conteniendo los promotores de pdhR (región 1 en la Fig. 5.4), pdhR y aceE (región 3 en la Fig. 5.4) y aceE (región 2 en la Fig. 5.4) cuando los cultivos se crecieron en medio mínimo conteniendo glucosa (barras blancas), succinato (barras negras) o piruvato (barras grises) como única fuente de carbono. La Figura 5.6 muestra la actividad reportadora obtenida cuando el vector con la fusión de la región 1 con lacZ se introdujo en tres cepas distintas: pdhR+, pdhR- (con una deleción en pdhR) y pdhR++ (con un plásmido de alto número de copias llevando el gen pdhR). Los cultivos crecieron sin (barras blancas) o con (barras negras) piruvato. Izquierda: pdhR+, centro: pdhR-, derecha: pdhR++.

Luego, se extrajo el mRNA total de la cepa salvaje para analizarlo por Northern blot (separación del RNA en gel de agarosa, transferencia a nitrocelulosa, hibridación con sondas radioactivas y autorradiografía) con sondas específicas de pdhR, aceE y lpd (regiones esquematizadas en la Fig. 5.4 en la línea que dice "probes"), cuyo resultado se muestra en la Figura 5.7. Las muestras se extrajeron de cultivos crecidos con piruvato. Se indica los tamaños de los mRNA hibridados, que deben compararse con los tamaños esperados para los transcriptos que se esquematizan al pie de la Figura 5.4.

Posteriormente, se purificó la proteína PdhR de la cepa salvaje: un extracto crudo se precipitó con sulfato de amonio, se pasó por una columna de exclusión molecular de Sephadex G-75 y la fracción seleccionada se separó por intercambio iónico en S-Sepharosa. La actividad se siguió gracias a la capacidad de esta proteína de unirse a DNA (Tabla 5.1). El análisis cualitativo se muestra en la figura 5.8. Con esta proteína se incubó un plásmido de 3.12 kb al que previamente se había insertado un fragmento de 0.55 kb en el que se encontraba la mitad 5' de la región pdhR. Las incubaciones se llevaron a cabo: a) en ausencia o b) presencia de la proteína PdhR purificada, b1) sin o b2) con el agregado de piruvato.

Figura 5.1

Tras la incubación, dicho plásmido se cortó con enzimas de restricción que separaron específicamente al fragmento de 0.55 kb y se sometió a electroforesis (Fig. 5.9: línea 1: incubado sin PdhR ni piruvato, líneas 2 y 3 con PdhR, línea 2 sin piruvato, línea 3 con piruvato).

a) Calcule los pesos moleculares de las subunidades de PDH utilizando los marcadores que aparecen en la calle M de la Figura 5.2. Suponiendo que el peso molecular promedio de un aminoácido es de 120 Da, ubique en la Figura 5.4 la región codificante correspondiente a cada polipéptido.

b) ¿Qué tipos de regulación de la actividad enzimática conoce?. Dentro de ellos, ¿a cuál pertenece el tipo de regulación de PDH descripto en el texto y en la Figura 5.3?. Explique cómo varían los niveles de piruvato en cada una de las condiciones de crecimiento mencionadas en el texto. ¿Cómo se afectará el nivel de piruvato en el mutante incapaz de sintetizar tiamina? En relación al destino del piruvato en cada condición de crecimiento, explique cuál es la ventaja de que la actividad de PDH sea regulada por cada uno de estos metabolitos en la forma descripta.

c) Observe el esquema de la Figura 5.4. En base a él y a los resultados de las Figuras 5.3, 5.5 y 5.6 proponga un rol para la proteína PdhR y el piruvato en la regulación de la actividad de PDH. De acuerdo a la Figura 5.7, ¿cuántos transcriptos diferentes se producen?. ¿Qué regiones codificantes lleva cada transcripto?.

d) Calcule la actividad específica de la PdhR purificada en cada paso (Tabla 5.1), y cuántas veces se purificó. Evalúe el grado de pureza obtenido (resultados de sus cálculos y Fig. 5.8) en función del objetivo que se persigue.

e) Explique el resultado de la Figura 5.9 ¿Corrobora la hipótesis planteada por Ud. en el punto (c)?. En este marco, ¿a través de qué factor ejercería su actividad regulatoria la glucosa?. Plantee un experimento que resuelva este último punto.

 Figura 5.2

Figura 5.3

Figura 5.4

Figura 5.5

Figura 5.6

Figura 5.7

Figura 5.8

7) La velocidad de crecimiento de Escherichia coli en medio mínimo varía según la fuente de carbono de la siguiente manera: v(acetato) < v(succinato) < v(piruvato) < v(glicerol) < v(glucosa), donde v es la velocidad específica de crecimiento con la fuente de carbono indicada. Para explicar este comportamiento, se propusieron dos hipótesis: según la primera, la energía requerida para la biosíntesis de metabolitos esenciales es mayor cuando el crecimiento se verifica en fuentes de carbono "pobres" (acetato, succinato, piruvato) que en fuentes de carbono "ricas" (glicerol, glucosa). Según esta hipótesis, la energía disponible sería limitante para el crecimiento. La segunda hipótesis postula que el crecimiento se ve limitado en fuentes de carbono "pobres" debido a una limitación en la producción de metabolitos intermedios en vez de a una limitación en la cantidad de energía disponible.

Se realizó un experimento para determinar cuál de las hipótesis explica mejor las respuestas del crecimiento de E. coli en distintas fuentes de carbono. Para ello, se inactivaron por deleción los genes que codifican para la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (pck) y la fosfoenol piruvato sintasa (pps). El rol de dichas enzimas en el metabolismo energético de E. coli se muestra en la Figura 5.10. Se obtuvieron tres mutantes: pck- , pps- y el doble mutante pck- pps-.

a) Prediga cómo será el crecimiento de cada uno de estos mutantes (positivo/negativo) en medios conteniendo piruvato o succinato como única fuente de carbono.

En otros experimentos se usó al doble mutante al que se le introdujo el gen pck en un plásmido bajo el control del promotor del operón lactosa con el fin de controlar la cantidad de enzima intracelular mediante el agregado de IPTG (Figura 5.11).

b1) Haga un esquema de la región del plásmido que contiene el promotor y el gen pck, indicando dónde están los sitios de restricción utilizados para la inserción, dónde están el 5’ y el 3’ de cada parte, cómo es la dirección de transcripción, dónde se inicia la transcripción y dónde la traducción especificando qué elementos deben estar presentes y en qué posición, y si éstos pertenecen al promotor o al inserto.

b2) ¿Qué conclusiones obtiene de la Figura 5.11?

Utilizando esta construcción, se observó su crecimiento y consumo de oxígeno en medio mínimo con succinato como única fuente de carbono. Los resultados se resumen en la Tabla 5.2

c1) ¿Cómo se logró variar la actividad Pck en la cepa con el plásmido?

c2) ¿Qué control falta en este experimento?

c3) ¿Puede en base a estos resultados corroborar inequívocamente una de las dos hipótesis enunciadas?

Figura 5.10 

Figura 5.11

8) Se purificó la Isocitrato Deshidrogenasa (IDH) de Thermus aquaticus, un microorganismo extremadamente termófilo (capaz de crecer a muy altas temperaturas). El protocolo para su purificación implicó una lisis del cultivo crecido en medio Bacto-peptona/extracto de levadura a 70oC durante 18 hr., mediante el empleo de un sonicador, centrifugación para remover restos celulares, precipitación del sobrenadante con sulfato de amonio 1,0 M (esta fracción fue denominada "extracto crudo") dos pasos de cromatografía HPLC (Butyl-Toyopearl y DEAE-Toyopearl) y una de cromatografía de exclusión molecular (Superose 6). La Tabla 5.3 muestra los valores de mg totales de proteína y actividad enzimática total obtenidos en cada paso.

Con la enzima pura, se procedió a secuenciar la porción amino-terminal, lo que arrojó la siguiente secuencia: Ala-Tyr-Gln-Arg-Ile-Gln-Ile-Pro-Gln-Glu-Gly-Glu-Lys-Ile-Gln-Glu-Gly-Val. A partir de esta secuencia se diseñó un oligonucleótido con el que se localizó el gen y se lo clonó en el plásmido pBR322 (Figura 5.12). Se estableció, a partir del clon, la secuencia del gen, que se muestra en la Figura 5.13.

Con este plásmido pBR322 llevando el gen de la IDH se transformó una Escherichia coli en la que el gen de la IDH había sido suprimido por deleción. Se observó entonces la estabilidad térmica (Figura 5.14) de la IDH recombinante (la llevada por el plásmido pBR322) (círculos blancos) en comparación con la IDH natural de T. aqaticus (círculos negros) y la de una E. coli salvaje (triángulos negros).

a) ¿Qué papel cumple la IDH?

b) En base a los datos de la Tabla 5.3, calcule rendimiento, recuperación, actividad específica y cuántas veces se purificó la enzima. ¿Qué grado de pureza requirió este proyecto?. ¿Sus datos le certifican el grado de pureza deseado? ¿Necesita más ensayos? Si su respuesta es afirmativa, ¿cuál(es)?

c) ¿Cómo cree que se midieron los mg de proteínas?. Describa brevemente la metodología a seguir y qué controles son indispensables.

d) ¿En qué condiciones se habrá medido la actividad enzimática?.

e) Describa brevemente cómo se realizaó el clonado. Realice un esquema del plásmido pBR322 conteniendo el inserto, especificando dónde están los sitios de restricción utilizados, dónde está el origen de replicación y cómo se procedió para seleccionar los transformantes y los clones recombinantes.

f) En la Figura 5.13, ubique la zona de la proteína que había sido secuenciada y también la información relevante de la secuencia nucleotídica como para que la transcripción y traducción tengan lugar.

g) ¿Cómo se realizó el experimento de la Figura 5.14?. ¿Qué información obtiene de él?

Figura 5.12

Figura 5.14

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