PURIFICACION: METODOS Y CRITERIOS, ANALISIS PARAMETROS

a) ¿Cuál es la estructura de la proteína 11S, qué tipos de enlaces participan en ella?

b)- Discuta los resultados de la Tabla 1.8 e indique si realizaría alguna modificación. Compare con la SDS-PAGE (Figura 1.16, calle Salv), considerando que el objetivo es utilizar esta proteína para análisis estructural.

Cuando se analizaron con SDS PAGE sin ß-mercaptoetanol los productos de la purificación de extractos de distintas variedades (Figura 1.17A) y las fracciones solubles e insolubles de la precipitación con sulfato de amonio (Figura 1.17B), se encontraron dos variedades (G1 y Ser2) que eran semejantes a la variedad Salv, en las cuales se supuso estaba modificada la composición aminoacídica.

c) Basándose en los resultados, identifique las mutaciones que llevan las variedades G1 y Ser2, y cómo cree usted que afectan éstas la estructura de la proteina 11S.

   Figura 1.16                                                                 Figura 1.17

6) Se estudia una toxina bacteriana de naturaleza proteica y con actividad enzimática, la adenilato ciclasa (AC). Esta proteína proveniene de un microorganismo patógeno para el hombre, y su actividad patogénica consiste en alterar funciones metabólicas en células eucarióticas del hospedador a través de un incremento exacerbado del AMPc intracelular.

La enzima cataliza la siguiente reacción:

ATP -----------------> AMPc + PPi

Mediante una serie de ensayos se determinó que en el microorganismo dicha proteína se encuentra parte en el citosol y parte asociada a la membrana. Se pudo determinar que además del sitio de unión al ATP, la AC posee otro u otros para asociarse a una proteína eucariótica, la calmodulina.

El objetivo es determinar la estructura de la adenilato ciclasa, para lo cual previamente se desarrolló un protocolo de purificación.

A continuación se describen brevemente los pasos seguidos para la purificación de la proteína. Se adjunta además datos que se obtuvieron de la aplicación de cada uno de ellos:

4- luego de separar el sobrenadante del precipitado por centrifugación, el precipitado se disolvió con tampón pH 7,2, vol. final 2,0 ml.

5- dicho volumen se cromatografió en una columna de afinidad. De las fracciones colectadas se pudo detectar actividad en cuatro tubos cada uno de los cuales contenía 200 m l.

6- el volumen de los cuatro tubos se cromatografió mediante una columna de exclusión molecular (25.000-80.000). Sólo se pudo recuperar la actividad luego de una elución exhaustiva (Ve>>> Vo incluído)

Se concentró entonces la proteína y a través de distintas metodologías se determinó su peso molecular: 19.000 Da

Las determinaciones se realizaron a partir de 0,2 ml de muestra en un vol final de 1,3 ml

La Tabla 1.9 presenta los datos obtenidos del proceso de purificación

a) ¿Cómo realizaría el primer paso? Indique brevemente las condiciones, el tampón y las precauciones que debería tomar

b) Fundamente el paso 3

c) ¿Qué tipo de relleno emplearía para armar la columna de afinidad?

d) ¿Cuántas veces se purificó la adenilato ciclasa en cada uno de los pasos?

e) ¿Cómo mejoraría este protocolo? ¿Qué etapa agregaría o descartaría?

f) ¿Qué técnicas pueden usarse para la concentración de proteínas después del paso 6?

g) ¿Qué criterio utilizaría para establecer el grado de pureza de su preparación?

7) Se logró desarrollar una droga anticancerígena a partir del factor ß de necrosis tumoral humano (TNF-ß). Un estudio in vitro sirvió para demostrar que el TNF-ß tenía actividad citolítica y citotóxica provocando la muerte de células malignas, que son más susceptibles que las células normales.

El TNF-ß nativo (soluble y activo) fue purificado, obteniéndose dos fracciones proteicas, una pequeña fracción con la proteína activa y soluble y la otra con la proteína insoluble agregada en cuerpos de inclusión (CI) inactiva. A ambas fracciones se le realizaron electroforesis nativas y desnaturalizantes cuyos perfiles se observan en la Figura 1.18; en el gel A calle 2 no fue posible observar la fracción insoluble.

El objetivo ahora es lograr la purificación del TNF-ß a partir de los cuerpos de inclusión, para lo cual se utilizó los siguientes buffers:

El protocolo a seguir fue el siguiente (resumido en la Tabla 1.10), las bacterias K12HB101 clonadas con el gen rhTNF-ß (que codifica para la proteína de interés) en el plásmido pCG402 fueron crecidas en un fermentador automático a 30°C, se agregó un inductor IAA y se suplementó el medio con leucina y prolina. Se tomaron 1.000 ml del medio en la fase exponencial de crecimiento y se diluyó 3,5 veces para obtener una DO (600nm) de 0,8. Las bacterias fueron lavadas en buffer A y resuspendidas en 10 ml del mismo buffer. Posteriormente fueron sonicadas 3 veces (1 minuto cada vez) y centrifugadas a 17.400 xg por 30 minutos a 4°C. El pellet se resuspendió en 10 ml de buffer B y se incubó 20 minutos a temperatura ambiente. Luego se centrifugó a 17.400 xg por 15 minutos. El pellet lavado fue solubilizado en el buffer C (por cada gramo de pellet se usan 10 ml de buffer) ajustando el pH a 7,5 con HCl. 10 ml del resuspendido anterior se sembraron en una columna de intercambio catiónico (CM-Sepharosa), obteniéndose 2 picos. El pico II de la corrida anterior se sembró en una columna de intercambio aniónico (DEAE-Sepharosa) y se recolectó la fracción no unida. Como paso final se utilizó una técnica que permite la renaturalización de las proteínas, a lo que se llamó producto final. En cada uno de los pasos se determinó la cantidad de proteína utilizando el método de Lowry y la cantidad de TNF-ß por medio de un método específico.

Como comprobación del trabajo se realizó una cromatografía de exclusión molecular del producto final, para lo cual se calibró la columna con los siguientes patrones de peso molecular: Albúmina bovina (67 kDa), Ovoalbúmina (43 kDa), Quimotripsinógeno (25 kDa) y Citocromo C (12,4 kDa). Obteniéndose el perfil de la Figura 1.19 A y B.

a) Según los resultados de la Tabla 1.10 y la Figura 1.19 ¿se purificó satisfactoriamente el TNF-ß?.

b) Explique en forma breve y concisa cómo realizaría la cromatografía de exclusión molecular y qué información le entrega.

c) Utilizando la información general del problema y la Figura 1.18, ¿podría indicar cómo están formados los cuerpos de inclusión?.

8) La bacteria Fusobacterium mortiferum coloniza el tracto oral y gastrointestinal de humanos y animales provocando absesos y necrosis, sensibilizando además dichos tejidos a infecciones por otros patógenos. Para controlar dicha bacteria se han iniciado estudios de sus requerimientos metabólicos. Se observó que durante la infección estas bacterias metabolizan la maltosa. La actividad mediante la cual pueden captar este disacárido es la fosforilación de la maltosa para dar maltosa 6-fostato y su posterior hidrólisis mediante una maltosa 6-fosfato hidrolasa (MalH). Esta enzima puede hidrolizar una variedad de glucósidos 6-fosforil-a -D ligados, entre ellos el 4-metilumbelliferil-a -D-glucopiranósido 6-fosfato (4MUa Glc6P), que al hidrolizarse libera 4-metilumbeliferona (4MU), la cual es fluorescente al ultravioleta.

Para estudiar las características de esta enzima, un litro de cultivo de F. mortiferum fue lisado por sonicado y centrifugado y el sobrenadante separado, el que constituyó el extracto crudo. A dicho extracto se lo llevó a pH=4,9, se lo dejó equilibrando a 4oC una noche, se lo centrifugó y al precipitado resultante se lo resuspendió en 5 ml de buffer fosfatos pH=7,0. A este resuspendido se lo sembró en una columna de exclusión molecular Sephadex G-100 y se recogió el material correspondiente a la zona de entre 90-110 kDa, que eluyó en un volumen de 20 ml. A dicho eluído se lo precipitó con 3 volúmenes de acetona a -20oC durante 1 hora, se lo centrifugó y resuspendió en 1 ml de buffer fosfatos pH=7,0. Para medir la cantidad de proteínas totales y la actividad de MalH se tomó 1,0 ml del extracto crudo, 0,1 ml del resuspendido de la primera precipitación, 0,5 ml del eluído de la exclusión molecular y 0,03 ml del resuspendido de la segunda precipitación. A cada muestra se la llevó a un volumen final de 10 ml en buffer fosfatos pH=7,0. Luego, de las muestras así preparadas correspondientes al extracto crudo y al resuspendido de la primera precipitación, se las diluyó 1:10 en un volumen final de 5 ml cada una, y de las otras se tomó 5 ml de las respectivas preparaciones sin diluír y a cada muestra se la dividió en alícuatas de 1 ml. Con tres alícuotas de cada muestra se dosó proteínas totales (por triplicado) mediante el método de Bradford. En la Tabla 1.11 se dan los valores de DO obtenidos conjuntamente con los correspondientes a una curva de calibración realizada a partir de una solución stock de 10 mg/ml de albúmina. A cada una de las tres alícuotas restantes de 1 ml de cada muestra se agregó 1 ml de una solución que contenía la concentración apropiada de 4MUa Glc6P como para obtenerse concentraciones finales de 2,0; 7,0 y 15,0 mM en cada tubo. Cada solución de 4MUa Glc6P agregada a los tubos se preparó diluyendo adecuadamente un stock de 100,0 mM de 4MUa Glc6P. La reacción se inicó al momento de agregarse el 4MUa Glc6P y se siguió mediante la fluorescencia obtenida en 2; 5; 10 y 20 min de incubación a 37oC. Dichos valores fueron luego convertidos a m moles de 4MU por tubo de reacción. en la Tabla 1.12 se dan los valores obtenidos.

Se realizó además un análisis cualitativo de la purificación, cuyo resultado se muestra en la Figura 1.20.

Con la proteína obtenida en la muestra correspondiente al resuspendido de la última precipitación, se analizó el efecto de ciertos iones sobre su actividad (Tabla 1.13).

Se desarrolló un segundo ensayo de actividad en el cual 20 m l de extractos crudos de E. coli conteniendo 20 m g de proteína total se sembraron en geles de poliacrilamida nativos y luego de la corrida, los geles se incubaron con 4MUa Glc6P y se observaron en un transiluminador con luz ultravioleta, obteniéndose el resultado de la Figura 1.21A. Con este ensayo se determinó el efecto de la composición del medio de cultivo sobre la síntesis de MalH y de glucógeno (Figura 1.21B).

a) Explique el fundamento de cada una de las técnicas de purificación empleadas, como así también las características fisicoquímicas discriminadas.

b) ¿Qué diluciones se realizaron a partir del stock de albúmina para obtenerse los puntos de la curva de calibración para el método de Bradford?

c) En base a los datos de la Tabla 1.11, calcule la concentración de proteínas en cada muestra.

d) ¿Qué diluciones se realizaron para obtenerse las concentraciones apropiadas de 4MUa Glc6P a partir del stock con las que se realizaron los ensayos de actividad, y cuáles eran éstas?

e) Calcule el rendimiento, la recuperación y cuántas veces purificó la enzima.

f) Analice el resultado de la Figura 1.20 y sugiera un modelo molecular para esta enzima.

g) Explique cómo se realizó el experimento de la Tabla 1.13 y qué información obtiene de él.

h) ¿Qué conclusión obtiene de las Figuras 1.21A y B?

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