1) En un ensayo donde se estudia la cinética de síntesis del mRNA del operón lactosa, se cultivaron dos cepas de E. coli, una salvaje y otra mutante. Los cultivos se realizaron en un medio sintético que contenía glicerol como única fuente de carbono además de IPTG. A los 3 minutos se añadió glucosa. Se extrajo el RNA de las muestras tomadas a los tiempos indicados en la Figura 4.10 a y b y se determinó el mRNA correspondiente al operón lactosa. En la Figura 4.10a se muestra el comportamiento de la cepa salvaje y en la Figura 4.10b el de la mutante.

Figura 4.10b

a) Explique el comportamiento de las cepas salvaje y mutante.

b) Diga cuál/es es/son la/s posibles mutaciones que justifiquen el comportamiento de la cepa mutante.

c) ¿Puede determinar el fenotipo de la cepa mutante? En caso negativo, diga qué experimentos haría para determinar el fenotipo.

2) Ud. tiene una cepa mutante de E.coli, denominada E.coli 91, de la cual se conoce la siguiente información:

-Una estría realizada en un medio con X-gal e IPTG y en otro con X-gal pero sin IPTG, da crecimiento de colonias azules en ambos casos.

-Otro de los datos con que se cuenta es el resultado del siguiente experimento.

Se prepararon células competentes de E.coli 91 y se las transformó con un plásmido que sólo contenía, del operón lactosa, el gen i proveniente de una cepa salvaje de E.coli. Se hizo crecer a la cepa E.coli 91 con plásmido y a la cepa E.coli 91 sin plásmido y a cada cultivo se le agregó, después de 5 horas de crecimiento en medio LB, IPTG 1 mM y se incubó durante 30 minutos más. Posteriormente, se cosechó las células por centrifugación, se las resuspendió y lisó, y con el lisado se realizó un ensayo "in vitro" donde se midió la actividad enzimática de la b -galactosidasa (m moles de ONPG hidrolizados por minuto a 37oC en 5 min. en una mezcla de reacción donde la concentración de ONPG es de 4 mM). Los resultados de los valores de actividad se muestran en la Tabla 4.5.

a) Diga dónde ubicaría Ud. la mutación en la cepa E.coli 91. Si existe más de una posibilidad, señálelas y fundamente cada respuesta de acuerdo a los datos y conclusiones a que llega.

b) Explique cómo podría revertir el fenotipo mutante de E.coli 91 al fenotipo salvaje

3) Se han encontrado dos mutantes del operón lactosa de los cuales se conoce que las mutaciones se encuentran en el gen i, pero no se han determinado aún los fenotipos y genotipos correspondientes. Para ello se realizaron los siguiente estudios:

a) Los resultados del aislamiento en cajas con medio LB de la cepa salvaje y los dos mutantes fueron:

     con IPTG/con X-gal                    sin IPTG/con X-gal

A        colonias blancas                       colonias blancas

B        colonias azules                         colonias blancas

C        colonias azules                         colonias azules

b) Se determinaron las constantes de asociación entre la proteína represora y el operador en ausencia de IPTG dando los siguientes resultados:

K asociación x M-1

Cepa A      1 x 1015

Cepa B      1 x 1013

Cepa C      1 x 102

c) De cada cepa se tomó una gran cantidad de cultivo líquido saturado y se purificó la proteína represora, que está en bajas concentraciones en la célula bacteriana. El análisis por PAGE-SDS dió como resultado el que se muestra en la Figura 4.11

Figura 4.11

Figura 4.11

a) ¿Cuál de las cepas es la salvaje?

b) ¿Cómo explica los resultados obtenidos con las dos cepas mutantes?

c) Basándose en el análisis de los resultados, diga el fenotipo y genotipo de las cepas mutantes.

4) Considere un operón bajo control negativo, con dos genes estructurales: A y B, que codifican para las enzimas A y B, un gen operador, O, y un gen regulatorio, R. La primera línea de datos en la Tabla 4.6 muestra los niveles relativos de enzima en la cepa salvaje crecida en ausencia o en presencia del inductor correspondiente a ese operón. Complete la tabla para los otros cultivos.

5) Como es sabido, los niveles de glucosa extracelulares son percibidos por las bacterias a través de cambios en los niveles de AMPc. En Streptococcus faecalis, cuando la glucosa extracelular es escasa el nivel de AMPc aumenta, mientras que si la glucosa extracelular es abundante, el nivel de AMPc disminuye. El aumento en el nivel de AMPc señala al mismo tiempo: a) la necesidad de inducir la síntesis de enzimas involucradas en la utilización de otras fuentes de carbono a través de la proteína CAP y b) la necesidad de reprimir la síntesis del sistema transportador de glucosa. Por su parte, la disminución del nivel de AMPc señala en forma simultánea la necesidad de a) desactivar la síntesis de enzimas involucradas en la utilización de otras fuentes de carbono a través de la proteína CAP y b) la necesidad de inducir la síntesis del sistema transportador de glucosa. Dicho sistema transportador se esquematiza en la Figura 4.12.

Figura 4.12

El gen ptgA codifica para una proteína que, cuando une AMPc no puede unirse al DNA. En cambio, cuando no tiene AMPc unido, es capaz de unirse al DNA en la zona del gen ptgO, exponiendo el promotor y activando así la síntesis del mRNA del gen ptgE, que codifica para la proteína estructural PtgE, proteína transportadora de glucosa. La función de esta proteína de membrana es transportar glucosa desde el exterior al interior de la célula y al mismo tienpo, fosforilarla a glucosa 1-P. Este sistema de expresión se ha estudiado generando dos mutantes de S. faecalis ambos con una deleción que abarcaba los genes ptgO y ptgE. En uno de estos mutantes se dejó el gen ptgA intacto, mientras que en el otro, se introdujo una mutación en el codón de iniciación de la traducción de dicho gen. Dado que además S. faecalis no posee actividad b -galactosidasa, se aprovechó para utilizzar al gen lacZ de Escherichia coli como gen reportador. Se insertó en un plásmido la región del gen ptgO y el promotor de ptgE fusionados a lacZ y con dicho plásmido se transformó a ambos mutantes de S. faecalis.

a) Prediga cuál será la actividad b -galactosidasa en cada una de las cepas,, como así también en el tipo salvaje de S. faecalis (mencione si será "alta" o "baja").

b) Para estudiar el rol del AMPc se realizó el siguiente experimento: se obtuvo un mutante en la adenilato ciclasa de S. faecalis, incapaz de sintetizar AMPc. Se cultivó al tipo salvaje por un lado y al mutante por el otro en un medio sin glucosa durante 20 minutos. Transcurrido ese lapso, se agregó al medio glucosa en una concentración final de 50 mM y se siguió la incubación durante otros 20 minutos. A lo largo de los 40 minutos del experimento (es decir, antes y después del agregado de glucosa en cada cultivo) se fueron tomando muestras cada 4 minutos y a cada una se le midió el contenido de mRNA del gen ptgE. Grafique la cantidad de mRNA ptgE extraído de cada uno de los cultivos en función del tiempo, en los intervalos indicados.

c) En un estudio posterior de la proteína transportadora de glucosa de S. faecalis, se intentó su purificación y caracterización. Para ello, la actividad de la proteína se cuantificó mediante la formación de glucosa 1-P a partir de glucosa y ATP en un sistema de membranas reconstituidas (liposomas). Para purificarla, se la extrajo en un buffer que contenía SDS, se la precipitó con sulfato de amonio y se la sometió a una cromatografía de exclusión molecular en una columna de Sephacryl 300 HR. En dicha cromatografía el volumen total corrido fue de 129 ml, y el volumen muerto, 49 ml. En la Tabla 4.7 se dan los datos de la calibración de la columna con marcadores de peso molecular:

La proteína transportadora de glucosa eluyó en un volumen de 72.1 ml. Además, muestras de la proteína purificada se corrieron en un gel de poliacrilamida con SDS y b -mercaptoetanol, dando por resultado una única banda de 65 kDa. En base a estos datos, ¿Qué puede decir acerca de la estructura de la proteína?. Sabiendo además que la proteína atraviesa la membrana (Figura 4.12) ¿puede agregar algún dato más sobre su estructura, respecto de su posible composición de aminoácidos?. Respecto de su forma, ¿Cree que será globular?.

d) Dados los siguientes datos de su purificación:

Calcule rendimiento, recuperación y cuántas veces se purificó la proteína. ¿Cree conveniente agregar alguna etapa más?. Si es así, ¿Cuál?.

e) Se cree que la 2-deoxiglucosa es un inhibidor de esta proteína. Si Ud. quisiera comprobarlo, ¿qué experimentos haría?. Describa brevemente el protocolo a utilizar, qué mediría, cómo lo haría, qué controles incluiría, qué información esperaría obtener y cómo la evaluaría.

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