1) En el crecimiento anaeróbico de Escherichia coli se reprime la síntesis de piruvato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa, se activa la lactato deshidrogenasa ya presente, y se induce la síntesis de piruvato formato liasa, fosfotransacetilasa y acetato quinasa. Estas tres últimas enzimas catalizan las siguientes reacciones:

piruvato formato liasa

fosfotransacetilasa

Además, se estimula la actividad de fosfofructoquinasa, enolasa y piruvato quinasa. Para estudiar los requerimientos de acetato quinasa y fosfotransacetilasa (cuyos genes se encuentran en la región esquematizada en la Figura 4.13: ack es el gen de acetato quinasa, y pta el de fosfotransacetilasa) se obtuvieron las cepas A y B, que se compararon con el tipo salvaje (TS). El genotipo de cada una de las tres cepas se caracterizó mediante una digestión de su respectivo DNA total con las enzimas de restricción XbaI (X), incubada junto con EcoRI (E) o con HinDIII (H) o con ambas: EcoRI + HinDIII. El material digerido se separó mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfirió a nitrocelulosa y se hibridó con una sonda específicamente complementaria de las 10 kb del fragmanto XbaI/XbaI, que se muestra en la Figura 4.13. El resultado de la electroforesis se muestra en la Figura 4.14. Luego, se cultivó a cada cepa durante un período prolongado en anaerobiosis, y se evaluó su supervivencia a distintos intervalos (Figura 4.15).

a) Esquematice, mostrando las reacciones más importantes, la ruta metabólica mediante la cual E. coli obtiene energía en anaerobiosis, incluyendo todas las enzimas presentadas en el enunciado. Explique cuáles serán los niveles de los metabolitos que ud. haya mencionado, y muestre claramente las transferencias de energía y poder óxido-reductor que se efectúen.

b) Explique cómo se llevan a cabo termodinámicamente las tres reacciones que se expone en el enunciado. Calcule el rendimiento energético de la ruta metabólica que Ud. esquematizó en (a).

c) Calcule los pesos moleculares (en kb) de los fragmentos de DNA de la figura 4.14, y ubíquelos en el esquema de la Figura 4.13.

d) Proponga una hipótesis que explique el diferente comportamiento de la cepa A respecto de la cepa B (Figura 4.15)

Figura 4.13 

Figura 4.14

Figura 4.15

2) Aunque muchos organismos usan la ruta glicolítica para la producción anaeróbica de ATP a partir de glucosa, algunos usan otras rutas. En la Figura 4.16 se muestra la ruta de Entner-Doudoroff, que es utilizada para la fermentación alcohólica por parte de la bacteria anaerobia Pseudomonas lindneri. Si esta especie bacteriana debe competir en el mismo ambiente con otra especie que utiliza la ruta glicolítica ¿cuál cree Ud. que predominará?

Figura 4.16

3) Se aisló y caracterizó la ADP-glucosa pirofosforilasa del alga unicelular Chlamidomonas reinhardtii. En la Tabla 4.8 se muestran los resultados del proceso de purificación, que se llevó a cabo a partir de 60 g de células.

En otro ensayo, se estudió el efecto que diferentes metabolitos ejercen in vitro sobre la actividad de esta enzima pura, cuyo resultado se muestra en la Tabla 4.9. En todos los casos, la concentración de los metabolitos ensayados fue 1 mM. La actividad se midió como milimoles de ADP-glucosa sintetizados en 10 minutos. En el mismo ensayo, se observó que los siguientes metabolitos: AMP, piruvato, NAD+ y NADH, no tienen efecto sobre la actividad enzimática.

Además, con objeto de obtener información acerca de la estructura de esta enzima,se llevó a cabo una cromatografía de exclusión molecular, en una columna de Sephacryl S-300, resultando en el cromatograma un pico con actividad de ADP-glucosa pirofosforilasa, el cual eluyó en el volumen correspondiente a 210 kDa. Al material contenido en esta fracción se lo sometió a electroforesis no desnaturalizante, observándose una sola banda (Figura 4.17). En paralelo, se llevó a cabo otra electroforesis en presencia de SDS y b -mercaptoetanol, en la que se observaron dos bandas, con pesos moleculares de 50 y 53 kDa (Figura 4.18).

a) Calcule la actividad específica, el rendimiento y la recuperación en la purificación de esta enzima. ¿Cree que el protocolo aplicado fue adecuado?. Sugiera alguna modificación, y explique en qué mejoraría su protocolo con ella.

b) Indique cuál es el efecto de cada metabolito sobre la actividad de esta enzima. ¿A qué tipo de regulación está sometida esta enzima?.

c) Suponga una situación de alta carga energética en C. reinhardtii. ¿Cómo será la concentración celular de cada una de los metabolitos mencionados en la Tabla 4.9?. ¿En qué dirección se producirá predominantemente la reacción catalizada por esta enzima?

d) Proponga un modelo de la estructura molecular de esta enzima. Si su respuesta no es 100% segura, proponga un experimento para llegar a una respuesta 100% segura.

4) Una cepa de la bacteria metanógena Methanosarcina barkeri es capaz de crecer con piruvato como única fuente de carbono. Durante el crecimiento en anaerobiosis, el piruvato es transformado en acetato y CO2 (Fig. 4.19). Si se incuba una suspensión de estas bacterias en ausencia de fuentes de carbono y en anaerobiosis, no hay producción de ATP hasta que se agrega piruvato. En este momento, la producción de ATP, CO2 y acetato aumentan. Si luego se agrega arseniato, la producción de ATP cesa mientras que las de CO2 y acetato aumentan más (Figs. 4.20 y 4.21. Observe la diferencia de escala en el eje de ordenadas respecto de la figura 4.19). Teniendo en cuenta los datos de la Tabla 4.9, explique:

a) Cómo estas bacterias son capaces de formar ATP a partir del piruvato (justifique con fórmulas).

Figura 4.17

 Figura 4.18

b) ¿A qué se deben los cambios ocasionados por el arseniato sobre la producción de ATP, CO2 y acetato, que se muestran en las figuras 4.19 y 4.20?

c) Si a estas bacterias se las creciera en anaerobiosis con glucosa marcada con 14C en el carbono 3, ¿en cuál de los productos finales esperaría encontrar la marca?. Justifique con fórmulas.

TABLA 4.9b

Figura 4.21. Efecto del arseniato en la formación de acetato y CO2 a partir de piruvato en suspensiones celulares de M. barkeri en anaerobiosis a 37oC. A los 20 minutos (flecha) se agregó piruvato 60 mM a suspensiones que contenían arseniato 50 mM (símbolos llenos) o sin arseniato (símbolos vacíos). Círculos: acetato; cuadrados: CO2.

 

5) Se incubaron cortes de hígado de rata en condiciones de aerobiosis, con los siguientes agregados:

glucosa                  glucosa + citrato                 glucosa + oligomicina

lactato             lactato + 2,4 dinitrofenol

¿Qué ocurrirá con el consumo de glucosa (o lactato), O2 y producción de CO2 comparando cada caso con el primero (glucosa sola)? Grafique los resultados que esperaría observar en función del tiempo de incubación.

6) A) Los gráficos A y B de la Figura 4.22 representan dos estados metabólicos diferentes de un cultivo de levaduras (en presencia y ausencia de O2).

Asigne a cada gráfico la condición metabólica correspondiente y explique el por qué de las similitudes y diferencias entre ambos.

B) Una compañía farmacéutica le envió muestras de dos inhibidores metabólicos de uso posible como antibióticos. Para establecer su toxicidad y mecanismo de acción, usted los prueba con una preparación de mitocondrias aisladas de hígado. En un medio de incubación con piruvato, ADP, Pi y O2 usted observa que el inhibidor A bloquea tanto el transporte de electrones como la fosforilación oxidativa. Cuando usted agrega el inhibidor B además del A, encuentra que se restablece el transporte de electrones pero no la fosforilación oxidativa.

i) ¿Qué medidas realizó para llegar a esos resultados?

ii) ¿Cómo calificaría a estos inhibidores desde el punto de vista de su acción sobre el transporte de electrones y la fosforilación oxidativa?

iii) Nombre un par de inhibidores conocidos que darían los mismos resultados que A y B y explique el mecanismo de acción en forma breve.

Figura 4.22

7) En una investigación del efecto del acetato sobre el ciclo de Krebs, se perfundió corazoes de rata extraídos de machos adultos de la raza albina Wistar con una solución de buffer de bicarbonato, conteniendo NaCl y glucosa 5,5 mM, gaseada con O2 y CO2 (95:5), sin ningún otro agregado (control) o con acetato de sodio 5 mM. Luego, se midió a tiempos apropiados la concentración de ciertos metabolitos en homogenados de corazones. La Figura 4.23 muestra la concentración de: a, CoA (símbolos vacíos) y acetil CoA (símbolos llenos); b, citrato; c, isocitrato y d, la relación citrato/isocitrato. En todos los casos (paneles a-d) los círculos representan las observaciones del control y los triángulos, las observaciones del tratamiento con acetato. En otro experimento (Figura 4.24) se midió las concentraciones de a -cetoglutarato (b) y malato (c) a diferentes tiermpos después de la perfusión. Como en la Figura 4.23, los círculos representan las observaciones del control, y los triángulos, las observaciones del tratamiento con acetato. Analice estos resultados, explicando a qué se deben las variaciones de concentración observadas, y cuáles son las fuentes y destinos de cada uno de los metabolitos mencionados.

Figura 4.23 

Figura 4.24

8) A fines de los años cincuenta muchas de las vías metabólicas hoy conocidas fueron comprendidas por medio del aislamiento de mutantes auxótrofos de Escherichia coli (mutantes que requieren de una sustancia suplementaria al medio mínimo para crecer). Una de dichas vías fue la utilización de los aminoácidos como combustible. Para eso se aisló un mutante de E. coli con el que se realizaron los ensayos que se muestran en la Tabla 4.10, determinándose la marca de 14C en proteínas y glucosa y la viabilidad.

Explique detalladamente y con ecuaciones cada uno de los resultados obtenidos y diga cuál es la enzima cuyo gen ha sido mutado.

9) En un experimento se determinó el contenido de glucógeno hepático en ratones frente a los siguientes tratamientos:

a) Alimentación normal e inyección de 0,5 ml de Ala 2,0 M 4 horas antes de sacrificados

b) Alimentación normal e inyección de 0,5 ml de glutamato 2,0 M 4 horas antes de sacrificados

c) Alimentación normal e inyección de 0,5 ml de adrenalina 0,01 mg/ml antes de sacrificados.

Una vez sacrificados, a los animales se les extrajo el hígado, el cual inmediatamente se colocó en KOH hirviendo para su homogeneización. El volumen final en todos los casos fue de 3 ml. Luego de la digestión, se tomó una alícuota de 0,4 ml y se precipitó con etanol 96o, descartándose el sobrenadante. El precipitado se redisolvió en 0,4 ml de agua destilada. A partir de esa solución se hicieron distintas diluciones para cada caso en las que se dosó glucógeno (como masa de glucosa) por un método colorimétrico llamado reacción de la antrona. Los datos se muestran en la Tabla 4.11

Asigne a cada uno de los lotes el tratamiento que Ud. considere que le corresponde. Explique claramente mediante cálculos y ecuaciones sus conclusiones.

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