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SEMINARIO 7 |
REPLICACION, SECUENCIACION Y PCR
Replicación
1) Para estudiar la replicación del DNA cromosomal en Escherichia coli se creció un cultivo en un medio que contenía: 49 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 50 mM NaCl, 10 mM glucosa, 1mM MgSO4 y 0,003 mM FeCl3, al cual se le añadió, como fuente de nitrógeno, 100 mg por litro de 15NH4Cl. Al cabo de 14 horas de crecimiento con agitación a 37oC (suficiente como para que transcurran 14 generaciones), se agregó al medio 1 g por litro de 14NH4Cl, y se dejó crecer durante otras 4 a 8 horas. A lo largo de todo este proceso se siguió el crecimiento mediante recuentos de células viables y recuentos al microscopio ( Figura 4.1). Como controles, dos cultivos crecieron en las mismas condiciones, pero con 15NH4Cl durante todo el proceso o con 14NH4Cl durante todo el proceso. Estos controles fueron cosechados por centrifugación, lisados con SDS, mezclados y sometidos a una centrifugación de densidad en CsCl, en una ultracentrífuga analítica durante 20 horas a 140.000 xg. Al cabo de la centrifugación, se fotografió la distribución del material en el tubo de centrífuga (Figura 4.2a: el tope del tubo se encuentra a la izquierda y el fondo a la derecha), y la cantidad de material observado se cuantificó por densitometría (Figura 4.2b). Alícuotas apropiadas de los cultivos de la figura 4.1 se fueron tomando a tiempos equivalentes a 0; 0,3; 0,7; 1,0; 1,1; 1,5; 1,9; 2,3; 3,0 y 4,1 generaciones transcurridas después del agregado de 14NH4Cl. Las muestras se introdujeron inmediatamente en baños de agua-hielo, se centrifugaron en frío a 1.800 xg 5 minutos, se resuspendieron en una solución 10 mM NaCl y 10 mM EDTA a pH=6,0, se lisaron con SDS y se sometieron a centrifugación con CsCl en las mismas condiciones que los controles de la Figura 4.2. También, al cabo de la corrida los tubos fueron fotografiados y el material que contenían, cuantificado por densitometría (Figura 4.3). Finalmente, se tomó al DNA purificado de cada uno de los controles de la Figura 4.2 y al correspondiente a 1 generación después del agregado de 14NH4Cl, se los calentó a 100oC 30 minutos, se los enfrió bruscamente y se los centrifugó en CsCl igual que antes. Los resultados obtenidos por densitometría se muestran en la Figura 4.4 (B: DNA de 1 generación después del agregado de 14NH4Cl, C: pico de la izquierda, DNA del control crecido en 14NH4Cl, pico de la derecha, DNA del control crecido en 15NH4Cl).
a) Explique cuál es el principio de separación del DNA empleado en estos experimentos, especificando los fenómenos físicos y/o químicos que tienen lugar y sobre los cuales se basan estos métodos.
b) Discuta los resultados mostrados en las Figuras 4.1 a 4.4, y proponga en base a ellos un modelo para la replicación del DNA en E. coli.
2) Usted ha aislado un organismo no terrestre (¡del planeta MARTE!) y desea conocer la forma de replicación del ADN que al parecer es el material genético que utiliza para almacenar la información. Para eso Ud. realiza un experimento similar al de Meselson y Stahl, dando como resultado lo que se indica la Tabla 4.1.
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Tabla 4.1 |
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Cont. Relativo de DNA del Tipo de Cadena PP LL PL |
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1ra. Generación |
1 0 0 |
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2da. Generación |
0 0 1 |
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3ra. Generación |
0 1/2 1/2 |
*PP: se refiere al contenido relativo en DNA de doble cadena ambas pesadas (N15).
LL: idem anterior pero ambas cadenas son livianas (N14)
LP: idem anterior pero el DNA es híbrido N15 - N14.
a) Explique cómo se realiza el experimento.
b) Diga si la replicación es conservativa o semiconservativa. Fundamente su respuesta con un esquema que explique los resultados expuestos en el cuadro.
c) De acuerdo a la respuesta anterior, haga una tabla y un esquema de la replicación si las muestras fueron tomadas a tiempos intermedios entre generaciones (1,5 y 2,5 generaciones).
d) Diga cuántas generaciones sería necesario estudiar para demostrar la otra forma replicativa que se dió como alternativa en el inciso b).
Figura 4.1
Figura 4.2
Figura 4.3
Figura 4.4
3) En un estudio sobre la anatomía de la horquilla de replicación en eucariotas, en el que se utilizó como modelo al virus SV40 se incubó a un plásmido que contiene el origen de replicación de SV40 con componentes del aparato de replicación purificados. Dichos componentes son: el factor de replicación C (RFC), que es una proteína que se une al extremo 3' de DNA naciente, el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), que forma parte de la holoenzima DNA polimerasa, la DNA polimerasa d (pol d ), de la misma holoenzima, una exonucleasa 5'-3' (MF1), DNA ligasa, RNAsa H, DNA polimerasa a , primasa y topoisomerasas I y II. Al DNA replicado en presencia de estos componentes se lo marcó por inclusión de [a -
32P]dATP en la mezcla de incubación. Los productos de la reacción se separaron por electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante y se revelaron por autoradiografía. El resultado se muestra en la Figura 4.5, especificándose, sobre cada calle, el componente que se omitió en la mezcla de reacción. Se señala en dicha figura la posición del DNA relajado (II) y superenrollado (I).Para estudiar en detalle los requerimientos para la replicación de la hebra retrasada, se diseñó un sistema artificial en el que una hebra de DNA de 445 nucleótidos (nt) se usó como molde a la que se apareó un segmento de 15 nucleótidos de RNA unido al extremo 5' de una hebra de DNA complementaria del molde, de 227 nucleótidos de longitud, marcada con
32P. En el extremo 5' de la hebra molde se apareó otro fragmento de DNA de 30 nucleótidos de longitud (para una ilustración, véase Figura 4.6. Template=molde, sizes=tamaños; los asteriscos muestran la ubicación de la marca radioactiva). Se incubó esta construcción con los diversos componentes enzimáticos purificados mencionados en la Figura 4.5, en presencia o en ausencia de la proteína de unión a simple cadena de DNA (ssb) llamada proteína de replicación A (RPA). Los productos de esta reacción se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida 5% con urea 8M, y se reveló por autoradiografía. Los resultados se muestran en la Figura 4.7 a,b,c. En las calles 1 de la Figura 4.7 a y b se sembró la construcción de ácidos nucleicos previamente sometida a hidrólisis alcalina.a) ¿Cuál es la actividad (que Ud. conozca) de cada uno de los componentes enzimáticos utilizados?
b) ¿A qué se debe, en la Figura 4.5, que el DNA superenrollado migre a una distancia diferente que el relajado?
c) ¿A qué se debe, en la Figura 4.5, el patrón de bandas observado?
d) ¿Qué función cumple la urea en los geles de la Figura 4.7?
e) Interprete los resultados de la Figura 4.7, y proponga una función para la proteína RPA.
Figura 4.5
Figura 4.6
Figura 4.7
4) Una especie bacteriana recientemente descubierta presenta un comportamiento anómalo en la replicación de su DNA, ya que no se detecta la formación de "primers" o cebadores de RNA. Se cree que además el modo de replicación es conservativo. Para determinarlo, se realiza un experimento en el que un cultivo crecido con una fuente de nitrógeno-14 (isótopo liviano) se transfiere a un medio en que la fuente de nitrógeno es del isótopo pesado (15N). Se aísla el DNA del cultivo al tiempo 0 de la transferencia y del correspondiente a la primera y segunda generación después de la transferencia. Se fracciona por gradiente de densidad de cloruro de cesio y se observa el bandeo para cada muestra.
a) ¿Qué son y qué función cumplen los primers de RNA?
b) ¿Cómo esperaría que fuese el bandeo en el gradiente si:
b1) la replicación es conservativa
b2) la replicación es semiconservativa.
c) Proponga un modelo para la replicación de esta bacteria, suponiendo que el resultado en (b) demuestra que es semiconservativa, y que se confirma la ausencia de primers de RNA. De acuerdo a su modelo, ¿cómo sería la tasa de mutación de esta bacteria comparada con la de E. coli?
5) En la Figura 4.8 se muestra un apilamiento de secuencias correspondientes a una región del gen que codifica el factor de transcripción rpoS en los siguientes microorganismos: 1) Salmonella typhimurim, 2) Shigella flexneri, 3) Erwinia carotovora, 4) Yersinia enterocolitica, 5) Serratia entomophila, 6) Pseudomonas aeruginosa, 7) P. fluorescens.
a) Planifique al menos un juego de primers como para amplificar por PCR un fragmento del gen correspondiente en Escherichia coli. Para planificar los primers, tenga en cuenta:
*Deben ser oligonucleótidos no menores de 20 pb.
*Deben comprender un segmento de al menos 200 pb.
*Deben ser específicos de un solo sitio.
*No deben formar estructuras secundarias internas.
*Es deseable que tengan un alto contenido de G/C, sobre todo hacia el extremo 3'
b) Explique a qué se deben las recomendaciones de a).
c) Escriba la secuencia de los primers, en el sentido 5'® 3'.
d) Usando la secuencia del gen rpoS de E. coli que se muestra en la Fig. 4.9, señale los sitios que serían reconocidos por los primers y dibuje el resultado que obtendría si después de la reaccón de PCR Ud. corriera sus productos en una electroforesis en gel de agarosa. Suponga que como marcadores de peso molecular, Ud. cuenta con el fago l cortado con Hind III (fragmentos: 23.130, 9.416, 6557, 4.361, 2322, 2027, 564 y 125 pb).
Figura 4.8
Figura 4.9
6) Como parte de un estudio de la actividad de las enzimas de restricción Pha I y Sfa NI, ambas provenientes de Pasteurella haemolytica, se obtuvo la secuencia parcial de regiones de DNA que comprenden los respectivos sitios de corte. La secuencia reconocida por Pha I es 5' GATGC 3' y la reconocida por Sfa NI, 5' GCATC 3'. En la Fig. 4.10 a y b se muestra el resultado de dos de las mencionadas reacciones de secuenciación.
a) Explique brevemente cómo se llevan a cabo dichas reacciones y la electroforesis.
b) Obtenga las secuencias a partir de los resultados mostrados y ubique los sitios de restricción para estas dos enzimas.
Figura 4.10 a y b
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