Kweek en identificatie
Staphylococcus aureus is relatief simpel te isoleren en te diagnosticeren, groeit gemakkelijk op schapenbloed Trypticase soy agar platen. Deze kolonies moeten onderworpen worden aan een Gramkleuring, om te controleren of het grampositieve kokken zijn in trosjesvormen gelegen. En er wordt een catalasetest uitgevoerd, om een onderscheid te maken met de Streptococcaceae. Er wordt ook een coagulatetest uitgevoerd, want Staphylococcus aureus is zowel catalase en coagulase positief.
Indien beide testen (catalase en coagulase) positief zijn, voert men een gevoeligheidstest aan antibiotica uit.
Direct onderzoek:
Kolonievorming:
Coagulatieproductie:
Catalase:
Indien er specifiek naar Staphylococcus aureus gezocht wordt, is het gemakkelijk een eerste isolatie door te voeren door gebruik te maken van een selectieve voedingsbodem en door specifieke eigenschappen aan te tonen.
Identificatie:
Biochemische testen:
Coagulase-test:
Microscopisch onderzoek en Gramkleuring:
Er bestaat ook een slidex-test, waarmee men S. aureus ook kan identificeren, als men al zeker weet dat het om een Staphylococcus gaat.
Ga naar:
OPM: staphylokinase kan de gevormde klonter bij de coagulase-buistechniek terug oplossen en aldus vals negatieve resultaten vormen.
Staphylococci zijn namelijk van het F-type (= fermenteerders) en Micrococci zijn van het O-type (= respiratoir metaboliserende kiemen).
Staphylococcus aureus is een grampositieve coccus, maar de gramkleuring is indicatief maar geeft geen uitsluitsel op niveau van de species. Wel moeten we letten op de aanwezigheid van ettercellen in het te onderzoeken staal, wat duidt op de aanwezigheid van een pyogene infectie.
S. aureus geeft gladde, lichtjes verhoogde en witte tot gele kolonies met een gave rand. De diameter bedraagt zo�n 0,6 tot 1 mm. Meestal wordt er een geel tot oranje pigment gevormd en op MSA (mannitol salt agar of MZA: mannitol zout agar) geeft dit goudgele kolonies.
De productie van een coagulatie (dit is de pathogene factor van de Staphylococcus) kan worden gevisualiseerd door het klonteren van plasma. Er moet onderscheid gemaakt worden tussen vrij coagulase en gebonden coagulase. De vrije coagulase werkt in op prothrombine waardoor een thrombine-achtige substantie ontstaat. Deze zet fibrinogeen om in fibrine. De gebonden coagulase daarentegen werkt direct in op fibrinogeen. Twee testen laten ons toe de coagulase te detecteren:
1. De buistechniek:
deze test detecteert de vrije coagulase. Om de coagulase aan te tonen voegt men 0.1 ml van een overnachtscultuur in BHI (= brain heart infusion bouillon) toe aan 0.5 ml plasma. Na incubatie op 37 �C gedurende 4 uur bekijkt men het buisje onder een hoek van 90�. Elke graad van klontering wordt als positief beschouwd. Flocculatie en precipitatie zijn negatieve resultaten.
Een klein percentage van de S. aureus stammen vraagt een langere incubatie. Wanneer de incubatie langer dan 4 uur bedraagt, moet men toch een aantal zaken in acht nemen:
het staphylokinase kan de klonter oplossen zodat men een vals negatief beeld bekomt. Vandaar dat het noodzakelijk is regelmatig te evalueren. Het is ook mogelijk dat er contaminatie opgetreden is.
deze test meet de gebonden coagulase of de �clumping factor�. In deze test voegt men 1 druppel plasma toe aan een zware suspensie in gedestilleerd water op een draagglaasje. Het aflezen kan reeds binnen de 10 s gebeuren. In 10 � 15% van de S. aureus stammen vinden we een negatief resultaat. Deze stammen moeten hertest worden met de buisjestechniek. Indien de afleestijd de 10 s overschrijdt of indien de kolonie afkomstig was van een zoutrijk medium (MSA), kunnen vals positieve waarden voorkomen.
hemagluttinatie slide test voor de clumping factor (Bio-M�rieux, BBL)
Latex agglutinatie (Wellcome)
...
Het enzym catalase wordt geproduceerd door de meeste a�robe en facultatieve ana�robe bacteri�n. Het hydrolyseert waterstofperoxide in water en zuurstof. De vrijgestelde zuurstof veroorzaakt gasbellen.
2H2O2 ==> 2H2O + O2
De test is vrij gemakkelijk uit te voeren en niet zonder belang want ze laat ruwweg toe het onderscheid te maken tussen Staphylococcus (catalase positief) en Streptococcus (catalase negatief).
Bij het uitvoeren van de test moet men 2 belangrijke gegevens in acht nemen:
- verse cultuur gebruiken (< 24 uur)
- catalase is aanwezig in erythrocyten, dus opgelet met bloedmedia.
Voor Staphylococcus aureus is dit MZA, een selectieve bodem waar enkel halotolerante kiemen (verdragen hoge zoutconcentraties) goed op kunnen groeien en die de metabolisatie van mannitol aantoont, iets typisch voor Staphylococcus aureus.
Indien de MZA-voedingsbodem geel verkleurt, heeft men al een heel groot vermoeden dat het om Staphylococcus aureus gaat, maar om zeker te zijn, worden er nog enkele testen uitgevoerd, de coagulase-test en de DNAse-test, en een microscopisch onderzoek met gramkleuring.
Mannitolvergisting opsporen: (= doel)
principe: MZA is een selectieve voedingsbodem, vanwege het hoog zoutgehalte (75 g/l VB). Staphylococci zijn halotolerant en kunnen dus groeien op MZA.
Staphylococcus aureus vergist meestal mannitol, andere (de witte) Staphylococci meestal niet.(Er bestaan ook mannitol-negatieve Staphylococci aureus.
Mannitol is een suiker met een alcoholfunctie i.p.v. een OXO-groep (keton, aldehyde). Staphylococcus aureus is een fermentatieve kiem en kan dus suiker vergisten, waarbij zuren ontstaan. Deze zuren kunnen aangetoond worden door een zuur-base indicator die in de voedingsbodem zit, nl. fenolrood. (pH<6,4: geel, pH>8,2: rood).
Dus als we te doen hebben met een Staphylococcus aureus is er een gele zone rond de kolonies waarneembaar.
Voor alle kiemen die op de MSA groeien, een DNAse-test en een coagulase-test uitvoeren.
Doel: aanwezigheid aantonen van het enzym DNAse (= een hydrolase)
Principe: breng met een entnaald met oogje een dikke rechte entstreep (of radiair op de voedingsbodem indien er meerdere kiemen uitgeplaat moeten worden) aan op DNAse-agar. Incubeer voor 24 h bij 37�C.
Het DNA in de voedingsbodem wordt afgebroken tot nucleotiden indien het enzym DNAse aanwezig is. Dit proces wordt depolymerisatie genoemd. De plaat wordt overgoten met HCl (1 mol.l-1). Wacht 10 minuten. Giet de overtollige vloeistof weg in een beker met javel. Er zou een gedefinieerde klaardere zone moeten zijn in het troebele cultuurmilieu: DNAse positief.
Daar waar het DNA afgebroken werd, door DNAse, tot de verschillende nucleotiden, treedt er geen neerslag op.
Waar er nog DNA aanwezig is, zal er troebeling ontstaan. Dus indien de gehele voedingsbodem troebel wordt, is de kiem DNAse negatief.
doel: opsporen van het enzym coagulase.
Principe: fibrinogeen (afkomstig van het konijnenplasma) wordt, indien coagulase aanwezig is, omgezet tot fibrine, zodat er stolling optreedt. Stolling wil zeggen coagulase-positief.
OPM: door Staphylokinase krijgt men in de buistechniek soms vals negatieve resultaten bij te lang wachten om af te lezen, vandaar dat men regelmatig moet aflezen (1, 3 of 24h).
Be�nt door aftikken een HHIB (= hersen hart infusie bouillon = BHI). Incubeer 18 uur bij 37 �C.
Breng 0,5 ml van de HHIB-cultuur bij 0,5 ml konijnenplasma in een hemolysebuisje en incubeer bij 37 �C voor 1, 3 of 24 uur. Bij de minste graad van stolling wordt de test als coagulase-positief beschouwd.
Het zijn grampositieve cocci die in typische �druiventrosjes� voorkomen.
Breng op een gereinigd en ontvet (aceton) voorwerpglas een druppel water centraal aan. Neem met een steriele entnaald met oogje staal en suspendeer dit in de druppel. Smeer de bacteriesuspensie uit over een zo groot mogelijk oppervlak. Droog de uitstrijk in de buurt van de vlam aan de lucht. Fixeer het preparaat door de opgedroogde voorwerpzijde driemaal snel door de vlam te halen. Kleur het preparaat: overvloedig huckerammoniumoxalaatkristalviolet aanbrengen en laat 1 minuut inwerken, laat afvloeien en breng de lugoloplossing aan en laat 15 tot 20 seconden inwerken. Laat afvloeien en breng opnieuw lugol aan en laat weer 15 tot 20 seconden inwerken. Overgiet met het wasmiddel tot de wegstromende vloeistof kleurloos is en spoel overvloedig na met water. Breng gedurende 2 � 3 seconden de safranine-oplossing aan en spoel overvloedig met water. Laat het preparaat aan de lucht drogen en voer dan de microscopie uit.
OPM: cellen die reeds afgestorven zijn voordat men het preparaat begint te maken, kleuren altijd rood = vals gramnegatieve kiemen. (dit kan ook bij te sterk ontkleuren).
Doel: nagaan hoe het glucide door de kiem gemetaboliseerd wordt.
Principe: naargelang hun gedrag in een half vaste voedingsbodem met glucose, kunnen de bacteri�n in 3 typen ingedeeld worden:
- Inerte bacteri�n (I-type): tasten glucose niet aan. De voedingsbodem die een zuurbase-indicator (BTB) bevat, kan gealkaliniseerd worden door afbraak van Pepton in a�robe omstandigheden (de bodem wordt dan aan de oppervlakte alkalisch, hetgeen zichtbaar wordt door verkleuring van de zuurbase-indicator: blauw bovenaan).
- Oxyderende bacteri�n (O- of R-type): kunnen glucose afbreken enkel in aanwezigheid van dizuurstof. De bodem wordt verzuurd door vorming van 6-Fosfogluconzuur (hetgeen zichtbaar wordt doordat de zuurbase-indicator geel wordt in zuur milieu: geel bovenaan).
- Vergistende bacteri�n (F-type): kunnen glucose afbreken in afwezigheid van dizuurstof. Katabolieten zijn voornamelijk zuren die in het milieu accumuleren, waardoor de pH gevoelig daalt en er een gele kleur over de gehele voedingsbodem ontstaat.
"save target as" om slidex-test te kunnen bekijken!
Indexpagina:
Inleiding van het multimediaal project:
Algemene eigenschappen van Staphylococcus aureus:
Pathologie�n:
Voedingsbodems:
Besmetting:
Resistentie en behandeling:
Artikels:
Referenties: