La situazione spagnola negli anni '30 fa intravvedere uno sbocco rivoluzionario e, fin da subito, attivisti dell'USI partecipano alle sollevazioni popolari del 1934.

Dopo il golpe di Franco del 17 luglio del 1936, l'organizzazione anarcosindacalista spagnola CNT passa al contrattacco e il 19 luglio le sue milizie guidate da Bonaventura Durruti liberano Barcellona e danno inizio alla rivoluzione libertaria.

L'USI partecipa insieme alle altre sezioni dell'AIT ad un'attiva mobilitazione e molti sono i suoi militanti, in particolare quelli esiliati in Francia,che raggiungono la Spagna ed entrano nelle storiche colonne della CNT: Ascaso, Durruti, Tierra y Libertad, Ortiz ecc…

Tra i compagni italiani che accorrono in Spagna ricordiamo Umberto Mazzocchi - che sarà uno dei riorganizzatori dell'USI nel dopoguerra - e Camillo Berneri.