INDICACIONES GENERALES
PARA EL TRABAJO DE INVESTIGACION:
Consiste en:
Elaboración de plan de trabajo (Proyecto)
Realización del trabajo en el laboratorio y redacción del informe escrito.
Exposición y defensa
Fases constitutivas del plan de trabajo:
I. Título Diseño experimental para el estudio del desarrollo bacteriano
II. Planteo del Problema. Se realiza una primera búsqueda bibliográfica que aporte elementos para plantear interrogantes sobre el tema seleccionado para investigar. Se especifican con precisión las preguntas.
En este caso se abordarán los siguientes temas: bacterias, antibióticos,
antisépticos, cultivo bacteriano, antibiograma, tinción gram, etc
Según Kerlinger (1975), los criterios para plantear adecuadamente el problema de investigación son:
El problema debe expresar una relación entre dos o más variables.
El problema debe estar formulado claramente y sin ambigüedad como pregunta (por ej.: ¿qué efecto...? ¿Cuál es la probabilidad de ...? ¿Cómo se relaciona ... con ...?)
El planteamiento debe implicar la posibilidad de realizar una prueba empírica. Es decir, de poder observarse en la realidad.
Luego estos interrogantes se traducen a objetivos. Son definidos con precisión a los fines de ser evaluada su factibilidad de que sean logrados a partir de la metodología propuesta.
III. Marco teórico. Una vez planteado el problema de estudio (objetivos y preguntas) y cuando, además, se ha evaluado su factibilidad, el siguiente paso consiste en sustentar teóricamente el estudio. El marco teórico cumple diversas funciones:
Ayuda a prevenir errores que se han cometido ya en otros estudios.
Orienta sobre cómo ha de realizarse el estudio, ya que se obtiene información sobre: ¿qué tipo de estudios se han efectuado?, ¿cómo se han recolectado los datos?, ¿qué diseños se han utilizado?
Amplía el horizonte del estudio y guía al investigador para que se centre en su problema evitando desviaciones del planteamiento original.
Conduce al establecimiento de la hipótesis o afirmaciones que más tarde habrán de someterse a prueba.
Provee un marco de referencia para interpretar los resultados del estudio.
En la elaboración del marco teórico el aspecto más importante es la correcta revisión de la literatura. Que va a consistir en detectar, obtener y consultar la bibliografía que puede ser útil para los propósitos del estudio. De donde se extrae y recopila la información relevante; de este modo se realiza una selección del material dada la abundancia y diversidad de información que hoy se puede obtener en muchas áreas.
IV. Hipótesis. Son respuestas no confirmadas. Describen, explican o predicen los fenómenos que interesan. La formulación de hipótesis implica un conocimiento del problema a investigar. Una condición indispensable para una hipótesis es su "Verificación empírica", es decir, tiene que poder ser verificable con la metodología y procedimientos del trabajo de investigación
(Objetivos e hipótesis. Ejemplo de objetivo: "Estudiar la acción de la amoxicilina sobre las principales bacterias que colonizan los alimentos", ej. de hipótesis: "La amoxicilina inhibe el desarrollo de las bacteras que se encuentran en los lacteos")
Las hipótesis no necesariamente son verdaderas, pueden o no serlo. Es decir, al establecer sus hipótesis el investigador desconoce si serán o no verdaderas. Las hipótesis contienen variables, estas son propiedades cuya variación puede ser medida. Las variables contenidas deben ser precisas, concretas y poder observarse en la realidad; la relación entre las variables debe ser clara y medible. Ej. Hipótesis: "A mayor remuneración en el trabajo, menor será el ausentismo". Variable 1: Remuneración, Variable 2: Ausentismo.
V. Plan operativo. Se deberán explicitar las distintas actividades a desarrollar. Es decir un diseño específico que someta a prueba a la hipótesis. Debe ser dinámico y flexible. Implica una organización del tiempo y distribución del trabajo en equipo.
En el diseño de un experimento se requiere la manipulación intencional de una acción para analizar sus posibles efectos. Es decir, la manipulación intencional de una variable independiente (supuesta causa) para analizar las consecuencias que esta manipulación tiene sobre una o más variables dependientes (supuestos efectos).
Siguiendo con el ejemplo anterior: Hipótesis: "A mayor remuneración en el trabajo, menor será el ausentismo". Variable 1: Remuneración, Variable 2: Ausentismo.
La variable dependiente se mide, aquí sería la Variable 2. La variable independiente, la remuneración, es la que se manipula, por ej. definiendo rangos de ingresos mensuales.
También es importante evaluar cómo se medirá el efecto que la variable independiente tiene en la dependiente. La medición debe ser válida y confiable. Si no podemos asegurar que se midió adecuadamente, los resultados no servirán y el experimento será una pérdida de tiempo.
Por último se incluirán los "controles" necesarios. Es decir controlar la influencia de otras variables extrañas. Por ej. Higiene de las placas de petri, contaminación del agua destilada, etc . De esta forma se busca saber realmente si las variables independientes que nos interesan tienen o no efecto sobre las dependientes. Otro ejemplo, para analizar el efecto de una droga en ratones con insuficiencia renal se puede diseñar el experimento administrando la droga a un grupo de ratones con la patología mientras a otro grupo con la misma enfermedad no se le administra la droga. Un posible control para este experimento puede ser: administrar una solución sin la droga a dos grupos de ratones sanos.
VI. Bibliografía. Utilizada para la elaboración del plan de trabajo.
Para poder realizar el trabajo en el laboratorio, cada grupo, debe tener su plan de trabajo aprobado. Al concluir el trabajo en el laboratorio y con los datos que se obtuvieron del mismo, el paso siguiente es confeccionar un informe escrito final del trabajo de investigación.
El Informe del trabajo de Investigación debe incluir: Título, Introducción, Métodos, Resultados, Discusión y bibliografía.
Se presenta en hoja tamaño carta (o A4), tamaño de fuente 12, interlineado doble, simple faz, máximo 14 hojas.
1. Título idem
2. Introducción
Breve descripción del trabajo realizado.
Investigación bibliográfica en relación al trabajo a realizar (Idem Marco Teórico).
Objetivos e Hipótesis. Se describen las variables.
3. Metodología
Descripción de la metodología realizada. Materiales, pasos del experimento (procedimiento), métodos estadísticos utilizados, etc.
4. Resultados
Tablas, gráficos, dibujos o figuras con los resultados obtenidos.
Comparaciones realizadas.
5. Discusión
Análisis e interpretación de los resultados obtenidos.
Rechazo o confirmación de la/s hipótesis planteadas.
Breve conclusión que considere los conceptos expuestos desde la introducción hasta discusión.
6. Bibliografía
Se enumeran las publicaciones utilizadas para el trabajo. Ej.:
Barderi MG, Cuniglio F, Fernández EM, Nahabedian SE, Querol SM. Educación para la Salud. Ed. Santillana. (pag. 17-28) Buenos Aires, 1994.
Exposición y defensa del trabajo: En la fecha establecida (15´por grupo): Síntesis de 6´ e interrogatorio del profesor.
TRABAJO DE INVESTIGACION
"Diseño experimental para el estudio del desarrollo bacteriano"
Para la realización del presente trabajo se deben incluir todos los aspectos descriptos, que intervienen en el desarrollo de un trabajo de investigación.
Cada grupo debe tener un cuaderno de laboratorio donde se registrarán todos los procedimientos que se realizan, indicando integrante del grupo que lo realiza, fecha y hora.
También se incluirán los contenidos teóricos y prácticos, desarrollados en las clases, relacionados específicamente con el tema a investigar. Es decir, se plantearán las preguntas y objetivos, se construirá un marco teórico en función de los objetivos propuestos y se planteará la/s hipótesis de trabajo. De esta forma, el diseño experimental o plan operativo debe incluir todos los procedimientos descriptos:
Muestreo Microbiológico
Siembra y aislamiento
Recuento
Cada grupo dispone sólo de su material provisto y los elementos comunes que deben quedar limpios y en condiciones para el uso común.
Para poder realizar el trabajo de laboratorio, cada grupo, debe tener aprobado el PLAN DE TRABAJO.
Objetivos Generales del Trabajo
Materiales disponibles para cada grupo:
Materiales que puede traer cada grupo:
Lavado del material:
Lavar
el material con agua corriente y detergente.
Enjuagar el material con agua destilada varias veces.
Dejar secar sobre papel absorbente.
Procedimientos
1. Muestreo Microbiológico
| La primera etapa del análisis
microbiológico es la extracción de la o las muestras de un lote y
cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido
apropiadamente tomada. Cada grupo deberá utilizar los controles
necesarios para constatar que la muestra que se analizará es
representativa de lo que se desea estudiar y descarla antes de
realizar el análisis si se tiene indicios de que no lo es.
Existen protocolos para el muestreo en las áreas clínicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aquí señalaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres últimas áreas. El lote es el número de
unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas
condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideración
teórica puesto que es difícil asegurar la uniformidad durante la mayoría
de los procesos conocidos. Se
considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas
de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del
lote. Para determinar que la muestra es
representativa y que no se ha alterado después de la extracción deben
tenerse en cuenta las etapas de: recolección, transporte y preparación
para el análisis propiamente dicho. 1) Recolección. Los planes de muestreo determinan el número, tamaño y zonas de recolección de la muestra. Se diseñan por criterios estadísticos teniendo en cuenta además algunas características del producto tales como: - facilidad de homogeneizar el lote. Si el producto es fácilmente mezclable, como un líquido, se requiere menor número de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraerán muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos críticos. A su vez se debe considerar la homogeneidad dentro de la unidad o envase, por ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda más tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. Debe tenerse en cuenta que el aumento del número de muestras está restringido por el costo del estudio y porque existe un límite por encima del cual no hay un aumento significativo de la calidad de recolección. La muestra se extrae en unidades cuyo envase externo esté inalterado. La extracción se realiza en forma aséptica para evitar la contaminación de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un número, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. 2) Transporte La muestra se toma y transporta en recipientes esterilizados y herméticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0º-4ºC) por no más de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no
debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir
homogeneizar. 3) Preparación para el análisis Se debe realizar la observación macroscópica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneización de la muestra mediante manipulación aséptica. Si es un sólido o una pasta se diluye en buffer o solución fisiológica estériles y se mezcla en recipientes esterilizados. Si el análisis se realizará por filtración es necesario disolver el producto en un solvente apropiado inocuo para los microorganismos. Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente sea 1:10. Esta dilución debe prepararse inmediatamente antes del análisis. ALGUNAS APLICACIONES I) Muestreo de productos alimenticios Se puede realizar por varios métodos: a) Extracción y homogeneización: se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relación con el diluyente sea 1:10. Se puede utilizar mortero. b) Contacto de superficie:consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un área determinada del alimento y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. II) Muestreo de utensilios y mobiliario. a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volumen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al análisis microbiológico. b) Contacto de superficie: consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un área determinada del utensilio y posteriormente descargar el hisopo en un volumen medido de diluyente el cual es analizado. c) Inmersión: los
utensilios se sumergen en un volumen determinado de diluyente y se
determina el número de microorganismos por unidad. III) Muestreo de aire. a) Sedimentación: se exponen placas de agar durante 15' a 2 hs dependiendo de la contaminación del área a analizar. Se detectan sólo los microorganismos que están adheridos a partículas sedimentables. c) Impregnación de líquidos: consiste en hacer burbujear un volumen determinado de aire a través de un diluyente estéril el cual retiene los microorganismos presentes. IV) Otros Muestreos Se adaptara alguno de los métodos descriptos, considerando las condiciones para la homogeneización de la muestra y su manipulación aséptica.
|
Sembrar es introducir
artificialmente una porción de muestra en un medio adecuado, con el fin de
iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba
a una temperatura adecuada para el crecimiento.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o
semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.
Para realizar este trabajo utilizaremos siembra en medio sólido: Siembra en superficie de placas. Efectuando alguno de los siguientes procedimientos:
En medio sólido cada célula viable (bacteria) dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar.
En general cuando se
quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es
necesario diluir previamente la muestra en tubos con solución fisiológica estéril.
Aislamiento
Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de un población que los contiene de varios tipos. En habitats naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro (un solo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microorganismos presentes.
El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una proporción adecuada.
Cuando el m.o. que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción en la muestra, o interesa un solo tipo de m.o., se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda que involucra una primera etapa de aumento del número de microorganismos (enriquecimiento) del tipo que se desea aislar en relación al resto de la población. Luego se aisla por el método de estrías o por dilución y se identifica.
Para aislar se puede utilizar
el procedimiento de aislamiento por estrías:
Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías
paralelas: se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se enfría, se
hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa, se
enfría el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la
placa.
Cultivo Puro:
A partir de colonias
aisladas se realiza un examen microscópico que debe mostrar células
razonablemente semejantes respecto al Gram
y a la morfología.
Las colonias deben describirse por examen macroscópico en
función del tamaño, la forma, el borde, la elevación, la transparencia y el
color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación.
Medios de Cultivo. Generalidades
Todo medio de
cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o
varias especies microbianas y dar condiciones tales como pH, presión osmótica,
O2 disuelto, etc. adecuados para el crecimiento.
Según la finalidad del medio de cultivo podemos
encontrar distintos tipos:
1) Medios nutritivos:
Son medios de
propagación que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. No
contienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutritivos comunes tenemos agar
nutriente y caldo nutriente.
Nosotros utlizaremos:
a) Agar Nutritivo (medio Sólido):
Extracto de carne 0,3 g
Peptona 0,5 g
Agar 1,5 g
Agua destilada 100 ml
Hervir para disolver los ingredientes. Luego distribuir en las placas
manteniendo las condiciones asépticas. pH final 6.8 ± 0.2
b) Caldo Nutritivo (medio líquido):
Extracto de carne 0,3 g
Peptona 0,5 g
Agua destilada 100 ml
Hervir para disolver los ingredientes. Luego distribuir en las placas
manteniendo las condiciones asépticas. pH final 6.8 ± 0.2
O bien utlizaremos:
pH final: 7.3 ± 0.2a) Tripteína Soya Agar (medio sólido)
Este medio favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos, tanto aerobios como anaerobios facultativos.
Fundamento
La tripteína y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta también carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos.
Fórmula (en gramos por litro)
Tripteína Peptona de soya Cloruro de sodio Agar
b) Tripteína Soya Caldo (medio líquido de enriquecimiento)
Medio adecuado para el desarrollo de microorganismos exigentes.
Fundamento
La tripteína y la peptona de soya aportan nutrientes ricos en péptidos, aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de soya aporta carbohidratos que estimulan el crecimiento de muchos microorganismos.
Fórmula (en gramos por litro)
| Tripteína |
17.0
|
|
| Peptona de soya |
3.0
|
|
| Cloruro de sodio |
5.0
|
|
| Fosfato dipotásico |
2.5
|
|
| Glucosa |
2.5
|
|
Instrucciones:
Suspender 3 g del polvo por 100 ml de agua destilada esterilizada. Mezclar y calentar hasta
disolver. Esperar que se enfrie un poco. Volcar sobre las placas de petri (15
ml x placa ó aprox. 5 mm. de espesor). Dejar solidificar unos minutos evitar la
contaminación.
2) Medios selectivos o inhibitorios (no serán utilizados en este trabajo):
Son medios sólidos
que contienen además de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el
desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros.
3) Medios de enriquecimiento selectivo (no serán utilizados en este trabajo):
Son medios líquidos que contienen inhibidores, como tetrationato, sales biliares, concentraciones de cloruro de sodio mayores a la fisiológica, etc.
3. Recuentos
Bajo este nombre se incluyen las determinaciones cuantitativas de biomasa microbiana.
Estas se pueden realizar de diferentes formas: Determinación del número de microorganismos (recuento en placa o método de las diluciones múltiples o del número más probable), determinación de la masa celular (turbidimetría utilizando el fotocolorímetro), determinación de la actividad celular (Determinación de alguna actividad enzimática, cuantificación de algún metabolito, medida del consumo de oxígeno).
A los efectos de llevar a cabo cualquier técnica de recuento, hay que tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, por cuanto es posible que algunos de los métodos no sean aplicables.
Como las colonias pueden originarse tanto de
una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Además, a los efectos de que todas las células
que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que
los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas
de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa o menos
según el caso.
Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimación del
recuento, y si es posible se repite hasta caer en las condiciones óptimas.
Procedimiento:
Nosotros sembraremos una dilución 1/10 de la muestra. Si es necesario (>300 colonias por placa luego del cultivo) se sembrarán diluciones consecutivas Ej.: 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).
ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS, EN EL FONDO, CON LOS SIGUIENTES DATOS:
Identificación de la muestra
Dilución
Volumen sembrado
Fecha
Alumno y equipo
Siembra en superficie:
Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 ml de cada dilución.
Incubación:
Una vez secada la muestra, las placas se invierten, y se incuban entre 24 a 72 hs en estufa a 30 - 35 °C.
Interpretación:
Finalizado el período de incubación, observar con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partícula de muestra que pueda haber. Si molesta, borrar la escritura.
Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias próximas una distancia al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña.
Se procede de la siguiente forma:
Se cuentan las colonias de la placa. Se hace el cálculo promediando los valores y multiplicando por la inversa de la dilución.
Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (según sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilución menor.
Si en todas las placas hubiera más de 300 colonias, se ESTIMA el resultado contando las colonias en una superficie conocida de la placa y luego llevando a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plástico.
Se sugieren las siguientes reglas:
1) Si hay menos de 10 colonias por cm2,
se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6
consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4
según el tipo de placa, para estimar el número de colonias en toda la placa.
2) Si hay más de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm
de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 según el tipo de placa.
3) Si hay más de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se
estima el resultado como Mayor de 6500 o 5700 por placa.
Una vez estimado el número de colonias por placa, se aplica el factor de corrección para expresar el resultado por gramo o ml de muestra, de acuerdo a las diluciones realizadas.
Es frecuente que desarrollen colonias extendidas, sobre la superficie, o bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como uno.
Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej: contaminación, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio"
Para alimentos se utilizan los límites de 25
a 250 ufc/placa.
Expresión de los resultados:
Se informan los resultados de recuento con sólo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda.
Ej: 142 se informa 140
155 se informa 160
El resultado debe decir:
Recuento de microorganismos: X u.f.c. /g o mL
2)Turbidimetría (no se realizará en el laboratorio):
Este método da información sobre el contenido de macromoléculas, y no sobre el número de células.
Se usa un colorímetro, o un espectrofotómetro y se mide la absorbancia de la suspensión de microorganismos en comparación con un blanco que es el medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio.
Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y expresando la relación en términos de masa microbiana y absorbancia, la ecuación es la siguiente:
A= k x W:
donde: A: Absorbancia
k: constante
W: masa
celular
La gráfica correspondiente construída con valores reales muestra una desviación
a medida que aumenta la masa microbiana.
Para utilizar la medida de la absorbancia como
método de recuento, es necesario hacer para cada microorganismo una curva de
calibración, midiendo el número de microorganismos por otro método de
recuento.
Coloración
Coloración de Gram (Técnica de Hucker)
Preparar un frotis:
Colocar el porta sobre un soporte
para tinciones. |
Antibiograma (ver también "Los antibióticos")
Se realizará utilizando las indicaciones presentadas en las clases.
Tener en cuenta:
1ro. Aislar la colonia
2do. Tomar 6 a 8 colonias con ansa y diluir en 3 ml de caldo nutritivo (enriquecimiento). Incubar 24 hs
3ro. Preparar las placas necesarias.
4to.Preparar los discos de papel de filtro (aprox. 5mm de diámetro) embebidos en las distintas soluciones.
5to.Sembrar con rastrillo la colonia aislada.
6to. Colocar hasta 5 o 6 discos de papel de filtro por placa. Considerar los controles.
7mo. Incubar 24 a 48 hs
8vo. Interpretar los resultados