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Vamos a realizar dos pr�cticas. En una vamos a observar los invertebrados de un sector t�pico de los que usamos en 023b (trabajo pr�ctico). En el segundo buscaremos conocer los principios pr�cticos de la microscop�a, con preparaci�n de muestras para observar.
BIODIVERSIDAD DE INSECTOS
En una ocasi�n previa hemos buscado un yuyal cercano a nuestra residencia, lo hemos marcado con un piol�n y no hemos hecho una b�squeda de insectos e invertebrados en ese sitio. Ahora hay que intentar hacerlo. En los lotes marcados busque insectos y peque�os invertebrados, lo cual es obviamente m�s dif�cil que buscar las plantas, que por lo menos se quedan quietas. Llamelos con nombres de fantas�a si no sabe el verdadero nombre. Registre su biodiversidad y su n�mero absoluto. Extraiga conclusiones razonadas, en base a su experiencia previa.
en inhibir el crecimiento bacteriano y fungal mediante la misma sequedad que suelen exhibir las semillas originales previas al brotado, sequedad descubierta por la selecci�n natural como remedio a su ataque.
Notas: Alfalfa: germina en tres a seis d�as y se busca un largo de 3 a 4 cm; tiene sabor a nuez.
Avena: se omite el remojo inicial y se enjuaga una vez al d�a. En tres o cuatro d�as tienen el largo �ptimo que es cuando duplican el tama�o inicial.
Calabaza: se vuelve amarga si el h�sar supera medio cm
Girasol: tarda mucho m�s que el resto y tambien se vuelve amarga al empezar a emerger el h�sar. Es muy rica en minerales como el fluor y el iodo.
Lenteja: brotes �ptimos de tres o cuatro d�as o sea 2 cm
Ma�z amarillo: brote de 1 cm es la medida conveniente.
Mijo: son brotes alcalinos que act�an de reguladores del pH de la digesti�n. Tardan tres o cuatro d�as para llegar al medio cm de largo, que es el adecuado.
Porotos: hay muchas especies y cultivares distintos. A veces est�n bien con un brote de 2 a 4 cm. Como son duros, hay que cocinarlos previamente a la ingesta.
Soja: es una leguminosa completa con todos los amino�cidos esenciales y un 40 % de prote�nas. La etapa 3 se debe repetir a menudo, 5 veces diarias o m�s y los brotes comerciales tienen 4 cm
Trigo: momento de cosecha es con 1 cm de largo. Por ser duro, se debe cocer antes de ingerir. Otra nota: este trabajo pr�ctico se puede extender tambien a las condiciones que deben mantener las semillas en forma previa a su procesamiento. El "invento" de la semilla exige condiciones de sequedad para que no empiece el brote que estamos estudiando en una �poca fuera de nuestros intereses. Durante ese per�odo las semillas respiran y est�n vivas. Las que mueren se debieran retirar apenas se las pueda reconocer por comparaci�n, porque son fuente de microorganismos sapr�fitos que no son agradables de mezclar con los brotes a ingerir. Las t�cnicas para hacer brotar tub�rculos se basan en ubicarlos en vasos con soportes especiales y agua en el fondo. Pueden partirse y lo mismo brotan. Los brotes son un problema para la preservaci�n hasta llegar el invierno en pa�ses fr�os como Polonia y Rusia, para los que la papa es la base de la alimentaci�n humana. El secado en cintas sin fin calefaccionadas con gases calientes es el gran recurso para evitar la pudrici�n del alimento, en general escaso.
MICROSCOPIO
Consiga a alguien que le deje ver un microscopio y que, con su experiencia, le evite a usted errores de manejo que puedan ser importantes.
1. BASE, SOPORTE, BISAGRA DE INCLINACION, BRAZO Y CUERPO DEL TUBO. La base, soporte y brazo sirven para mantener en la correcta posici�n a las partes �pticas esenciales. La base y el brazo son gruesos y fuertes, para disminuir la vibraci�n. En los modelos m�s antiguos una bisagra de inclinaci�n en el soporte, justamente debajo de la platina, permite que la parte superior del microscopio se incline hacia atr�s, en cualquier grado que se desee. En los instrumentos modernos se inclina hacia el observador todo el cuerpo del tubo, al cual est�n unidas las lentes principales, como en la figura zz.
2. TUBOS INTERCAMBIABLES, REVOLVER O PORTAOBJETIVOS, LONGITUD DEL TUBO. En los microscopios escolares m�s antiguos el tubo intercambiable, que se puede extraer tirando hacia arriba, se encuentra encajado en la parte superior del cuerpo del cuerpo del tubo. En �ste se coloca el ocular. El tubo intercambiable tiene la siguiente finalidad: permite ajustar la longitud del tubo, es decir, la distancia entre la lente del ocular que est� arriba y la uni�n del objetivo al rev�lver, que est� abajo. La longitud adecuada dell tubo se puede indicar por una l�nea que corra alrededor del tubo intercambiable. La mayor�a de los microscopios modernos tienen una longitud de tubo fija y oculares dobles, que permiten utilizarlos con los dos ojos.
3. AJUSTES MACROMETRICO Y MICROMETRICO PARA ENFOCAR. Todo el cuerpo del tubo junto con sus lentes (o en los modelos m�s recientes, la platina y el condensador) se mueven hacia abajo y hacia arriba, con la ayuda de un tornillo de ajuste macrom�trico. El tubo o la platina pueden subir o bajar muy ligeramente, mediante un tornillo de ajuste microm�trico. La finalidad de estos ajustes es poner la muestra en el foco, de manera que sus bordes sean n�tidos y claros. Ambos ajustes, el macro y el micro, deben manejarse cuidadosamente, sobre tod el �ltimo, dado que su mecanismo es muy delicado. El recorrido del tornillo microm�trico es muy limitado y no puede ser forzado. Hay un tope para arriba y otro para abajo. Mantenga usted el tubo en un punto intermedio, adquiriendo habilidad con el tornillo macro primero y micro despues y retocando con el macro si el micro llega a uno de sus topes.
4. PLATINA. Es la zona donde se coloca la muestra. En la mayor�a de los trabajos la muestra es un preparado transparente u otra preparaci�n sobre placa de cristal o portaobjetos.
5. ESPEJO, CONDENSADOR Y DIAFRAGMA. El espejo ajustable recoge y refleja la luz hacia el microscopio. Pues esa luz se condensa y enfoca al pasar por una gran lente condensadora que se halla debajo de la platina para finalmente iluminar por debajo a la muestra. Con esto se consigue aportar mucha luz a esa muestra, lo cual es una exigencia especial en el caso de lentes de gran aumento. A veces ocurre que la muestra queda demasiado brillante con la iluminaci�n provista por el condensador, motivo por el cual bajo el condensador hay un diafragma iris. El tama�o de la apertura del diafragma es regulable moviendo una palanquita. As� se puede regular la cantidad de luz c�moda de emplear. Si usted quiere ver microbios vivos sin tinci�n le conviene tener luz difusa. Para ello hay que descender el condensador y el diafragma. En microscopios que tienen condensador divisible, se puede retirar la parte superior. Una opci�n de los microscopios modernos es la de proveer condensador y espejo combinados en una sola unidad, con luz el�ctrica ajustable.
6. OBJETIVOS. Son la parte �ptica realmente importante. Limitan el tama�o de la imagen y son los responsables de una buena calidad de visi�n. Muchos microscopios tienen un rev�lver con tres objetivos. El rev�lver permite usar uno s�lo por vez, pudiendo ser peque�o aumento, gran aumento y objetivo de inmersi�n en aceite.
OBJETIVO DE PEQUE�O AUMENTO. Este es muy �til para examinar micrroorgasnismos grandes y c�lulas comunes, as� como colonias de microbios. Es m�s corto que los otros dos, aunque en su extremo la lente es mayor que el resto. Tiene escrito ya sea un 3, o bien 2/3, o tambien 16 mm
OBJETIVO DE GRAN AUMENTO. Suele estar marcado con 6, o con 1/6 o con 4 mm . Permite ver microorganismos vivos en gotas suspendidas de portaobjetos cavados.
Fig de un portaobjetos cavado con gota suspendida
OBJETIVO DE INMERSION EN ACEITE. Es el m�s �til en bacteriolog�a y se presenta diferente a los otros dos. Dice "oil immer" u "homog. immer" o tambien 1/12, 1.9 mm o 1.8 mm. Los objetivos tienen un aviso adicional de su potencia amplificadora, tales como 10 X, 45 X, 97 X y ademas N.A. seguido de una cifra (N.A. = apertura num�rica). A mayor valor para N.A. tanto mayor es el detalle con el cual se aprecian por separado dos puntos cercanos en la muestra: * en los objetivos que no son de inmersi�n, N.A. como tope vale 1.0, en realidad inalcanzable * en los objetivos para inmersi�n, N.A. vale habitualmente 1.25 La definici�n de N.A. tiene como base el tama�o del haz de luz que puede aceptar el objetivo en cuesti�n. La interpretaci�n de indicaciones como 16 mm, 4 mm o 2 mm es la siguiente: ubique el objetivo a 16, 4 o 2 mm de la muestra o menos (la �ltima cifra es para portaobjetos con una gota de aceite ubicada donde va a sumergirse el objetivo).
7 OCULARES Los oculares son tubos cortos, cada uno con dos lentes, colocados en el extremo superior del cuerpo del tubo binocular, extremo al cual acercamos los ojos. Ellos amplifican la imagen del objeto formada por el objetivo. Sus indicaciones 5 X o 10 X se interpretan que la imagen del objetivo aumentar� 5 � 10 veces. Multiplicando entre s� las indicaciones de objetivos y oculares se llega a cifras similares a 100 � 500, que es la amplificaci�n final. Con inmersi�n se accede a cerca de 1000 aumentos totales.
8 PRINCIPIO DEL OBJETIVO DE INMERSION. Mientras que los objetivos secos tienen aire entre el objetivo y la muestra, el de inmersi�n tiene un aceite especial (de cedro) con el mismo �ndice de refracci�n que el vidrio. El �ndice de refracci�n est� relacionado con la velocidad real de la luz en medios que no son el vac�o. No es lo mismo el �ndice del aire que el �ndice del vidrio. Si todo tiene, entre objetivo y vidrio sobre el cual est� la muestra, el mismo �ndice, el valor del N.A. resulta ser mayor. Esa es la ventaja del aceite de cedro.
Diagrama del paso de la luz con diferentes indices de refraccion pag62
9 USO Y VALOR DE LENTES DE INMERSION Y PODER DE RESOLUCION. Cuando se emplea un objetivo de inmersi�n con ocular de 10 X tenemos un aumento final de 970 � 1000 X que resulta de buena nitidez en muchos microscopios. Cambiando 10 X por 15 X en los oculares deteriora la nitidez de la imagen. El poder de resoluci�n se controla mediante la apertura num�rica N.A. pero est� limitado por la longitud de onda de la luz. Nuestro ojo no alcanza a ver nitidamente objetos m�s peque�os de la mitad de longitud de onda de la luz usada. La luz en el rango �ptico tiene entre 0,4 y 0,8 m (sin�nimo de micra) y su valor central (verde) es 0,6 m. Con un microscopio �ptico vemos bien hasta un m�nimo de tama�o de 0,3 m. Otros microscopios que usted dificilmente consiga no se basan en la longitud de onda de la luz �ptica, sino en la de los electrones o del ultravioleta y distinguen as� objetos m�s peque�os. Los microscopios de contraste de fases con lentes y condensadores fabricados de otra manera, nos permiten ver detalles de la muestra sin te�ir en un portaobjetos cavado, resultando en una visi�n sobre fondo gris recordable para toda la vida.
2 METODOS DE MICROSCOPIA
EXAMEN DE ORGANISMOS VIVOS
La forma m�s simple de ver microorganismos y c�lulas vivos es suspenderlos en agua, colocar una gota sobre un portaobjetos com�n y cubrirlo con un cubreobjetos de manera que la gota quede desparramada.
Una experiencia curiosa consiste en observar el movimiento browniano, resultado del choque sobre la estructura viva (o muerta) de mol�culas invisibles que se adivinan por el efecto de su impacto. A medida que usted se perfecciona, querr� desengrasar los cubreobjetos con jab�n y agua y enjuagarlos con agua caliente, sumergirlos en alcohol y calentarlos suavemente cerca de una llama, antes de empezar. Le va a costar al principio enfocar bien por lo cual si hace una peque�a marca en el cubre cerca de la gota, esa marca le servir� para la tarea de enfoque. Su principal tarea ser� localizar la marca.
EXAMEN DE PREPARADOS La tarea siguiente es te�ir, esto es, ejecutar preparados te�idos. La manera tradicional de empezar es usar yodo y yoduro pot�sico o tinta china y si est� cerca de un proveedor de material de laboratorio, nigrosina. Le vamos a dar tres protocolos de trabajo.
METODOS PRINCIPALES
PRIMER PROTOCOLO (ALGUNAS CELULAS HUMANAS)
1. Instalar el microscopio y la luz. 2. Acondicionar portaobjetos y cubreobjetos limpios 3. Preparar LUGOL: un cristalito de yodo en un vaso de precipitados con 25 cm3 de agua y luego dos veces un montoncito de yoduro pot�sico aportado con la esp�tula (un tipo de destornillador aplanado y de poco espesor). Mezclar. Se usa en 9. 4. Con una cuchara de caf� limpia raspar suavemente el interior de la mejilla dos o tres veces. Colocar lo raspado en el centro de un portaobjetos. 5. Tapar la saliva y la pasta blancuzca con un cubrobjetos, de manera que queden como sandwich. A contraluz se ver�n burbujas de aire, que se volver�n a ver con el microscopio. 6. Mirar con poco aumento. Enfocar. Descubrir las burbujas de aire. Tienen un borde grueso. No llevarles m�s el apunte. Estudiar el resto del preparado. Hay muchas formas ovaladas casi transparentes. 7. Cambiar el aumento. Comparar el borde de la forma ovalada con el borde de la burbuja. Descubrir el n�cleo de la forma ovalada. Descubrir los org�nulos o granulaciones al azar entre el n�cleo y la membrana. 8. Observar la presencia de otras c�lulas similares. Compararlas entre s�. Buscar arrugas en las membranas celulares, usando el enfoque fino (tornillo microm�trico). 9. Empezar de nuevo con la etapa 4. A�adir una gota de Lugol. Cubrir con el cubreobjetos y repetir todo. El yodo colorea m�s al n�cleo que al citoplasma (frotis). Opcional: Comenzar sus experiencias con inmersi�n de aceite, si lo consigue. Inventar alguna manera de estimar el tama�o de las c�lulas de la mejilla y del n�cleo de las mismas. Soluci�n al final del m�dulo.
SEGUNDO PROTOCOLO (CELULAS DE CEBOLLA)
1. Cortar una cebolla a lo ancho. 2. Quitar una tela de la media cebolla. 3. Arrancar la pel�cula transparente y brillante de la superficie externa de la tela, haciendo un peque�o corte en la pel�cula y tomando una punta del borde para desprenderla. 4. Ponga la pel�cula ya sea en una gota de agua, ya sea en una gota de Lugol, previamente depositada en el portaobjetos limpio. Cubrir con el cubreobjetos. 5. Buscar burbujas de aire con poco aumento, para no confundirse m�s adelante. 6. Estudiar las formas de las c�lulas y c�mo se agrupan en l�minas planas. Observar los bordes de las c�lulas y buscar la pared celular gruesa y transparente. Normalmente no se podr� distinguir la membrana de la c�lula, adosada a la pared celular gruesa. 7. Descubrir el n�cleo y la vacuola llena de l�quido y envuelta por una membrana. Buscarla cerca del borde interno del citoplasma. Calcular tama�os.
TERCER PROTOCOLO (CULTIVO DE BACTERIAS)
1. Disponer de portaobjetos limpios segun explicaciones previas.
2. Dejar algo de caldo de carne o de verdura, o bien leche diluida, a la intemperie, o bien obtener una gota de pus.
3. Preparar nigrosina con 5 � 10 g de nigrosina en 100 cm3 de agua destilada, hirviendo 30 minutos y agregando 0,5 cm3 de formalina para matar contaminates. Filtrar con embudo con papel de filtro y guardar esterilmente en frasco, operando similarmente a lo que se debe hacer para preparar leche bovina para un lactante.En su defecto, conseguir un frasco de tinta china.
una gota de nigrosina o tinta china o Lugol. Extender una muy peque�a gota emulsionada, obtenida con un ansa (un alambre de platino con un anillo de 2 mm aproximadamente y un mango) que se embebe en la emulsi�n para formar un preparado delgado o humedecer un algod�n y extenderlo en su parte mojada por el portaobjetos. El resultado buscado de una o de otra manera, es el de lograr una pel�cula delgada, de manera que la luz pueda pasar en forma abundante por la muestra. 5.
Permitir que el preparado se seque al aire. Con experiencia, ahorrando agua, se logra que esto ocurra rapidamente.
6. Examinar el preparado seco con objetivo de inmersi�n y aceite de cedro. La nigrosina o la tinta china no se logra combinar con las bacterias, lo cual las resalta notablemente. El Lugol ti�e de diferente forma y se ven bacterias te�idas.
OTRAS OPCIONES
PRIMERA OPCION
Omitir 3 y 4. En su lugar, con un algod�n lograr una capa delgada del caldo sin te�ir, desparramado por el portaobjetos.
5.bis. En lugar del 5 reci�n explicado, seguir esta otra t�cnica llamada de fijaci�n del preparado: Fijar el preparado. Esto significa pasar rapidamente , con el preparado hacia arriba, por la parte superior de un mechero de gas, tres veces seguidas. Aunque con ello las bacterias no necesariamente se mueren, quedan adheridas al portaobjetos.
6.bis. Seguir una t�cnica tipificada de tinci�n que deber� buscar en el texto de Microbiolog�a de Alimentos, como por ejemplo la muy popular tinci�n de Gram, descubierta por un m�dico dan�s de ese apellido (1884) que distingue dos tipos de bacterias con membranas externas muy diferentes entre ellas y que tambien emplea el Lugol. Siempre se debe usar abundancia de soluci�n colorante y se debe evitar que el colorante se seque sobre el ptrparado. El tiempo necesario para una buena tinci�n se aprende con la experiencia, v�lida solo para la soluci�n tal como se la prepar�. Algunas t�cnicas piden al final un secado a la llama, antes del examen microsc�pico, generalmente con inmersi�n de aceite.
SEGUNDA OPCION
Ubicar una gotita de sangre en el centro del portaobjetos y desparramar con uno de los cuatro bordes del cubreobjetos, sosteniendo con dos dedos los otros dos bordes vecinos al usado. Fig xyz fig xyz p 70 "Peinar" el portaobjetos con el cubreobjetos y depositar a continuaci�n el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Esta t�cnica es muy c�moda si usted no tiene ansa y se puede adaptar a otros casos.
1. Localizar en el microscopio la funci�n que satisfacen las siguientes partes: base,soporte, bisagra de inclinaci�n, brazo, cuerpo del tubo, rev�lver, tornillo micro- y macrom�trico, platina, espejo, condensador y diafragma.
2. Explicar la funci�n de los tres objetivos del rev�lver, as� como las identificaciones que tienen.
3. Explicar la funci�n del ocular, as� como las identificaciones que tiene. Con un ocular 10 X, �qu� aumento se logra con el objetivo de peque�o aumento, con el de gran aumento y con el de inmersi�n?
4. Explicar las condiciones que satisface el aceite de cedro, incluyendo c�mo se forma la imagen.
5. Explicar poder de resoluci�n y deducci�n del tama�o m�s peque�o que presumiblemente se ve claramente con un microscopio com�n provisto de objetivo de inmersi�n.
6. �Por qu� usted preparar�a una muestra de gota pendiente?
7. Explicar algunas opciones que aparecen en las t�cnicas de preparaci�n de muestras.
8. Si usted quisiera dictaminar cu�l organismo est� presente en un monocultivo, �emplear�a usted para la emulsi�n con la cual preparar el preparado agua destilada o agua de canilla? �Por qu�?
MODULO II UNIDAD 4 CAPITULO 4 FINAL
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