1) ดีเอนเอต้นแบบ (DNA Template)
2) Taq DNA Polymerase (๕ Unit/ml)
3) Deoxynucleoside triphastphate mixs (dNTPs)
4) Oligonucleotide primer
5) Sterile distillede water
1) เตรียมหลอดทดลองขนาด ๐.๕ ml เพื่อเตรียมเป็น master mix โดยผสมสารต่างๆ ลงในหลอดตามตารางดังต่อไปนี้ (เตรียมในถาดน้ำแข็ง)
ชนิดของสาร |
1
reaction |
2
reaction |
Final concentration |
| 1) น้ำกลั่นไร้เชื้อ | 7.525 |
15.05 |
|
| 2) ๑๐* PCR buffer | 1.5 |
3.0 |
1x |
| 3) ๒๕ mM MgCl2 | 1.8 |
3.6 |
3
mM |
| 4) ๒ mM dNTPs | 1.5 |
3.0 |
200
mm |
| 5) ๕ mM Primer | 0.6 |
1.2 |
0.2
mM |
| 6) Taq DNA Polymerase (๕ U/ml) | 0.075 |
0.15 |
2.5
U/100ml |
ปริมาตรรวม |
13
ml |
26
ml |
2)เตรียมหลอดทดลองขนาด
0.2 ml จำนวน 2 หลอด พร้อม tabel ซึ่งกลุ่มที่ฝาหลอดใส่ PCR master mix หลอดละ
13 ml แล้วเติมดีเอนเอต้นแบบที่สกัดได้ หลอดละ 2 ml
3 ) ผสมสารต่างๆให้เข้ากันแล้วปั่นตกตะกอนด้วย Mini Microcentrifuge
4 ) นำหลอดทดลองใส่ในเครื่อง PCR ปิดฝาเครื่องแล้วตั้งโปรแกรมดังต่อไปนี้
pre-denaturation ๙๔ องศาเซลเซียส นาน ๓ นาที
Denealing ๙๔ องศาเซลเซียส นาน ๑ นาที
Annealing ๔๐ องศาเซลเซียส นาน ๓๐ นาที
Extension ๗๒ องศาเซลเซียส นาน ๑ นาที
Final-extension ๗๒ องศาเซลเซียส นาน ๕ นาที
5 ) เมื่อปฏิกริยา PCR สิ้นสุดแล้ว นำผลิตภัณฑ์ PCR ที่ได้ตรวจสอบด้วยวิธีเจลอิเล็กโทรโฟรีซิส