Diagnóstico e Terapia Celular

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Participantes Brasileiros

LFN, ITP (Sergipe)

Jose Omar Bustamante ( Coordenador )
CV, Grupos, Esboço Biográfico , Credenciais, Publicações Indexadas Por PubMed

Elen Romilda de Fátima Michelette: CV, Groups

Lauro Xavier Filho: CV, Groups

Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia (São Paulo)

Leopoldo Soares Piegas: CV, Biographical Sketch, Groups

UFRJ (Río de Janeiro)

Maria da Gloria da Costa Carvalho: CV, Grupos

UFS (Sergipe)

Eduardo Antonio Conde Garcia: CV, Groups

UFSC (Santa Catarina)

Tania Beatriz Creczynski Pasa: CV, Grupos

USP (São Paulo)

Estela Maris Andrade Forell Bevilacqua: CV, Grupos

Glaucia Maria Machado Santelli: CV, Grupos

Participantes Estrangeiros

EUA

Itens Requeridos da Proposta CNPq

Caracterização do Problema
Objetivos e Metas
Metodologia e Estratégia de Ação
Resultados e Impactos Esperados
Riscos e Dificuldades
Outros Projetos e Financiamentos
Referências Bibliográficas

Modelo desenvolvido pelo Proponente/Coordenador da proposta para a análise do transporte nucleocitoplasmático (p.ex., Bustamante et al., 1995a-d, 2000a,b; Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001).

1. Caracterização do Problema

Descrever objetivamente, com o apoio da literatura, o problema focalizado, sua relevância no contexto da área inserida e sua importância específica para o avanço do conhecimento.

Câncer e as doenças dos sistemas cardiovascular e imune dependem dos sinais que controlam tanto a atividade e expressão dos genes nas condições estacionárias como durante a divisão celular. Todos esses sinais entram no núcleo ou saem dele exclusivamente através do poro nuclear. Até os anos 1990s, relativamente pouca atenção era dedicada à função do poro nuclear porque acreditava-se que o mesmo não oferecia regulação a esse movimento de partículas que incluem: DNAs, RNAs, fatores de transcrição, receptores, segundos mensageiros, etc. A maioria dos livros de texto no Brasil mostram esse conceito. Hoje está bem estabelecido que o poro nuclear desempenha um papel importantíssimo na determinação da atividade e expressão dos genes nucleares (revisado em Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001 - publicação de livre acesso através da homepage do laboratório: The NPL ). Em 1995, introduzimos um modelo que explica as diversas caraterísticas funcionais relacionadas com o poro nuclear (Bustamante et al., 1995 a, b, c, d). Entre 1992 e 2001, publicamos vários trabalhos em revistas estrangeiras nos quais demonstramos (em núcleos celulares funcionais com poros nucleares de capacidade intacta de transporte celular) que o transporte de DNAs, RNAs, fatores de transcrição, e outras macromoléculas, deslocam o electrólito de dentro do poro nuclear e isso traz como conseqüência que a corrente elétrica gerada pelos íons seja eliminada: esse é o princípio do contador Coulter (Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1994, 1995a-d, 2000a,b). Propomos realizar estudos de sinais de grande importância para as doenças supracitadas: NFk B, p53, CREB, PKA, PKC, etc. Seguindo a nossa metodologia (p.ex., Bustamante et al., 2000a,b), incorporaremos em núcleos de células do sistema imune (p.ex., linfócitos), do sistema cardiovascular (p.ex., miócitos cardíacos), de câncer (p.ex., próstata) plasmídios de DNA que codificam para esses sinais fusionados com membros da família da proteína de fluorescência verde (EGFP: enhanced green fluorescence protein). Assim, o plasmídio pNFkB-pEGFP produzirá a proteína NFkB-EGFP que já demonstramos pode ser monitorada com microscopia de fluorescência em nossos núcleos (Bustamante et al., 2000a,b). [ Por favor, visite o site da Clontech Labs para conferir as propriedades desses pDNAs. ] Segundos mensageiros como Ca²⁺ serão monitorados diretamente com sondas fluorescentes convencionais e manipulados com seqüestradores de Ca²⁺ que podem ser manipulados com pulsos de nosso laser de luz UV (ver Molecular Probes). Enquanto monitoramos as distribuições e translocações através do poro desses sinais, medimos os pulsos (picos e vales) de corrente elétrica através de um único poro nuclear (correspondentes a translocações macromoleculares). Utilizaremos vários protocolos para estimular as diferentes cascatas de sinalização celular mencionadas. Por exemplo, adicionamento de cAMP estimula a PKA. Radiação contínua com UV estimula NFkB e p53. Colaboram com este projeto vários cientistas de prestigio internacional (lista completa e dados encontram-se na homepage dessa proposta). 1-Robert C. Gallo: co-descobridor do HIV (o vírus do AIDS), descobridor de novas terapias contra AIDS, e Diretor do Instituto de Virologia Humana da Universidade de Maryland, 2-Eduardo Marbán: Diretor do Instituto de Cardiobiologia Molecular da Johns Hopkins University, 3-J. Thomas August, Diretor do Instituto de Biomedicina de Johns Hopkins University (membro do programa de novas terapias anti-câncer), 4-Gordon C. Cragg, Diretor da Seção de Produtos Naturais, Programa de Novas Terapias do Instituto Nacional do Câncer (NIH-EUA), 5-Rodolphe Fischmeister, Diretor de Pesquisas do INSERM (França), 6-6-Naranjan S. Dhalla, Diretor do Instituto de Doenças Cardiovasculares da Universidade de Manitoba, etc. Os resultados obtidos neste projeto serão importantes na compreensão de alguns dos mecanismos envolvidos nas doenças supracitadas. 1-Doenças do sistema imune estão relacionadas ao fator nuclear kappa B: NFkB. 2-Alguns tipos de câncer estão relacionados com o fator supressor de tumor p53. 3-Algumas doenças cardiovasculares que dependem da atividade dos genes (p.ex., hipertrofia), estão relacionadas com esses fatores e com CREB (cAMP-responsive element binding protein), PKA (cAMP-dependent protein kinase), PKC, etc. Todos os equipamentos para essa proposta foram trazidos ao Brasil pelo proponente e estão funcionando adequadamente. Solicitamos uma câmara de CCD intensificada para poder observar movimentos de moléculas individuais e assim poder correlacionar quantitativamente as medições de fluorescência com as de corrente elétrica.

Modelo aplicado ao miócito de coração adulto isolado por coordenador segundo suas técnicas (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1981, 1982a,b; Bustamante & Jachimowicz, 1988).

2. Objetivos e Metas

Explicitar os objetivos e metas do projeto, definindo o produto final a ser obtido.

Esperamos que esse projeto contribua da seguinte forma:

Técnicas de diagnóstico e terapia celular para a prevenção, controle e/ou tratamento de alguns tipos de câncer e algumas doenças dos sistemas cardiovascular, nervoso, ósseo, sangüíneo/imune, etc. Para isso, desenvolveremos métodos farmacológicos e de terapia dos genes que usarão as observações feitas durante nossos experimentos sobre a sinalização celular. Todos os modelos experimentais utilizados são aceitos pela comunidade científica. É claro que o desenvolvimento e realização dessas terapias necessitarão de um prazo de tempo que vai além do limite estabelecido para esse Edital CNPq. Porém, acreditamos que nossa contribuição possibilite o desenvolvimento futuro desses métodos de diagnóstico e terapias.

Programa de treinamento de graduandos, pós-graduandos e PhD’s. Para isso, aproveitaremos os programas existentes nas instituições participantes.

Esperamos chegar a contribuir dessa forma seguindo os seguintes passos:

Identificação e quantificação das vias de sinalização celular que regulam o ciclo celular em condições que levam ao câncer e hipertrofia cardíaca e deficiência imune. Para isso, aplicaremos as técnicas disponíveis em nosso laboratório e nos laboratórios participantes. Dentro do prazo de 24 meses permitido nesse Edital Universal teremos que seguir protocolos experimentais bastante específicos. 1^o Estudaremos os mecanismos de desenvolvimento de hipertrofia cardíaca pois já trabalhamos anteriormente com essa doença no Inst de Cardiologia da Univ Ottawa (p.ex., Bustamante et al., 1991) e na Escola de Medicina de Yale. O estímulo usado será aquele de sobrecarga mecânica que é bem aceito pela comunidade científica. 2^o Estudaremos os mecanismos de desenvolvimento de doenças imunes em camundongos tratados com supressores do sistema imune (ver Liepins & Bustamante, 1994). 3^o Os mecanismos de desenvolvimento de câncer são muito variados. Usaremos nossa experiência com câncer de próstata (p.ex., Bustamante et al., 2000a) para estudar a sinalização das células cancerosas. Para esses estudos aproveitaremos nossa experiência (p.ex. Bustamante et al., 2000a,b) na incorporação de DNA no núcleo celular para a produção intrínseca de proteínas de fusão de vários sinais celulares com membros da família da proteína de fluorescência verde, EGFP. Por exemplo, para observar o papel do cAMP, através da sua quinasse PKA, injetaremos o plasmídio pPKA-pEGFP, o qual codifica para PKA fusionada com EGFP (PKA-EGFP). Também testaremos o papel de Ca²⁺ na sinalização e translocação nuclear. Observaremos a sinalização durante a mitose celular. Para isso, usaremos plasmídios de fusão do pEGFP com sinais do ciclo celular. Por exemplo, usaremos os plasmídios pp53-pEGFP e pNFk B-pEGFP para expressar os fatores de transcrição p53 e NFk B. O fator nuclear NFk B é bem interessante pois demonstra a coordenação entre a fosforilação do complexo citoplasmático NFk B+Ik B e a permeabilidade do poro nuclear. Brevemente, a fosforilação do complexo, dissocia NFk B de Ik B e o a molécula livre de NFk B pode entrar no núcleo através do poro nuclear. Testaremos os efeitos de várias manobras físicas e químicas sobre o ciclo celular (p.ex. radiação UV, choque térmico, TNF).

Implantação de um programa educacional que forneça a base de treinamento e capacitação a todos os níveis. A maioria das instituições nacionais que participam nessa proposta tem programas de graduação e pós-graduação. Todas as instituições estrangeiras que participam nessa proposta tem implantados programas de capacitação acadêmica. Esses programas tem grande prestigio internacional. Todas as instituições tem vagas, espaço e materiais para treinamento a todos os níveis. O único que falta são bolsas. Isso é o resultado da inexperiência do proponente com o sistema do CNPq. Especificamente, na experiência do proponente, nos EUA, Canadá, França, Alemanha e Suíça o coordenador do projeto primeiro recebe uma verba para fazer a pesquisa e depois atrai os pós-graduandos, pós-doutorandos, associados, etc. Porém, vale salientar que no momento, depois de ser informado no inicio de 2001 sobre essa deficiência, o proponente dessa proposta está negociando credenciamento em universidades brasileiras para treinar esse tipo de pessoal (ainda sem verba para pesquisa).

3. Metodologia e Estratégia de ação

Descrever a metodologia empregada para a execução do projeto e como os objetivos serão alcançados

A Metodologia será aquela desenvolvida por nós desde o ano 1990 (p.ex., Bustamante, 1992, 1993, 1994a,b; Bustamante et al., 1995a-d, 2000a,b - revisado em Mazzanti, Bustamante & Oberleithner, 2001). Os núcleos isolados são colocados num meio com substratos para o transporte nucleocitoplasmático, para a síntese de RNA e para a síntese de proteínas (Bustamante et al., 2000a,b). Medições de distribuições de sinais serão feitas com fluorescência. Medições de permeabilidade de membrana são feitas com corrente elétrica. Nessas condições, os núcleos fabricam DNA, RNA e são mostram transporte macromolecular através dos NPCs. A preparação (núcleo+meio) produz proteínas (Bustamante et al., 2000a,b; Bustamante et al e Bustamante & Dean, submetidos). Usaremos o pDNA que codifica para a proteína de fluorescência verde (pEGFP-C1). Para determinar a localização da atividade do promoter, usaremos o Fluorescent Timer . Já demonstramos que esse plasmídio entra no núcleo e produz mRNA que depois é usado na síntese de EGFP (enhanced green fluorescence protein). As vias de sinalização são estudadas com dois grupos de sondas fluorescentes. O primeiro grupo usa o fato que a pEGFP entra no núcleo e funciona corretamente. Baseado nisso, utilizamos plasmídios da familia pEGFP (p.ex., pPKA-pEGFP, pPKC-pEGFP, pp53-pEGFP, pNFk B-pEGFP, pCREB-pEGFP, pCRE-pEGFP) que codificam para proteínas de fusão para sinais celulares (p.ex., PKA, PKC, p53, NFk B, CREB, CRE). O resultado é que as moléculas de sinalização produzidas estão acompanhadas da EGFP e, por isso, é fácil observar sua mobilização quando as manobras experimentais são aplicadas (p.ex., radiação UV, TNF, TPA). Uma outra sonda que usaremos é a ficoeritrina B (240 kD) conjugada ao sinal nuclear do SV40 (ver Bustamante et al., 1995a). Essa sonda é necessária para caraterizar o transporte de macromoléculas mais pequenas que os plasmídios (p.ex., pEGFP tem 3,1 Megadaltons). O segundo grupo de sondas fluorescentes que usaremos está baseado no conceito de que muitas moléculas que entram no núcleo ou saim dele somente sob a presencia de Ca²⁺, ATP, e outros substratos. Por isso, monitoraremos [Ca²⁺] com sondas fluorescentes (p.ex., Alexa-Fluor e Oregon Green 488 da Molecular Probes ) e também manipularemos [Ca²⁺] com seqüestradores de Ca²⁺, inibidores de bombas de Ca²⁺, etc. ( Molecular Probes ). Além disso, usaremos sondas fluorescentes inertes para inferir o diâmetro dos poros (Bustamante et al., 2000b). Contamos com o equipamento de fluorescência (câmaras de CCD não intensificadas), mas não temos a sensibilidade para a resolução molecular que precisamos para poder correlacionar com precisão as medições (de fluorescência e elétricas) ao nivel de um único poro nuclear (p.ex., Bustamante et al., 2000a,b). As translocações macromoleculares através dos poros nucleares serão quantificadas por meio das estatísticas padrões (p.ex., Bustamante, 1992, 1993; Bustamante et al., 1995a-c). Nossa contribuição neste campo é o desenvolvimento do paradigma do canal iônico transportador de macromoléculas (ver publicações citadas no começo desse parágrafo). Brevemente, o que isso quer dizer é que cada vez que uma macromolécula passa pelo poro, ela entope o mesmo. Como resultado, o fluxo de cargas elétricas é interrompido e não é detectado valor algum de corrente elétrica através da membrana nuclear. A interpretação é que o entupimento do poro causa exclusão dos íons que são os condutores de carga elétrica. Manobras que aumentam a atividade e expressão dos genes devem aumentar a capacidade de transporte dos poros nucleares. Essa capacidade é medida com essas duas técnicas. A fluorescência deverá mostrar maior intensidade nos compartimentos finais de transporte. As medições elétricas deverão mostrar uma maior atividade de transporte macromolecular. A Estratégia que seguiremos é baseada em nossa experiência anterior e posterior a nossa chegada ao Brasil em 1997. Acreditamos que os alvos estão bem definidos. Porém, o problema de apoio financeiro é sério (problema familiar no Brasil). Isso será resolvido como já temos feito desde nossa chegada ao Brasil: com financiamento por parte do proponente (método familiar no Brasil). Como os objetivos serão alcançados? Os resultados obtidos em nosso laboratório serão testados por nossos colaboradores. As instituições estrangeiras tem programas internacionais de graduação, pós-graduação e pós-doutoramento. Isso garante o sucesso de nossas metas e objetivos.

4. Resultados e Impactos esperados

Descrever os resultados e/ou produtos esperados. Estimar a repercussão e/ou impactos sócio-econômicos, técnico-científicos e ambientais dos resultados esperados na solução do problema focalizado.

Resultados Esperados

Câncer e doenças dos sistemas cardiovascular e imune apresentam um problema muito sério para a saúde. O desenvolvimento de métodos de controle e erradicação dessas doenças depende, em grande proporção de nosso conhecimento dos mecanismos que regulam as mesmas. As vias de sinalização que serão estudadas são importantes nas etiologias dessas doenças. Antecipamos que nossos estudos identifiquem e quantifiquem algumas das vias de sinalização das doenças estudadas com nossos modelos celulares e nucleares.

Produtos Esperados

Esperamos que parte de nossa produção esteja dirigida à publicação de trabalhos em revista de prestigio internacional. Também, se conseguimos financiamento, esperamos apresentar trabalhos em reuniões nacionais e internacionais. Finalmente, nosso desenvolvimento de meios que permitem a expressão de proteínas é muito importante comercialmente. Como já existem patentes sobre esse tipo de material, antecipamos que nosso projeto possa levar ao desenvolvimento de substâncias que possam ser comercializadas.

Repercussão e/ou Impactos Sócio-Econômico, Técnico-Científico e Ambientais Estimados

Sócio-econômico: As doenças dos trabalhadores causam grande impacto à economia. Por isso, a redução de doenças contribui à economia. Apesar de nosso projeto não ser diretamente relacionado com o desenvolvimento de fármacos, ele está indiretamente relacionado com isso já que identificará alvos terapêuticos. Técnico-científico: É reconhecido pela comunidade científica internacional que o núcleo celular contém o DNA, a chave para o desenvolvimento das doenças que serão estudadas neste projeto. Por isso, o conhecimento dos mecanismos para o controle das mesmas é importante para o desenvolvimento de metodologias terapêuticas. Ambientais: A radiação UV solar causa uma alta proporção do câncer da pele. Os efluentes industriais causam muitas alterações genéticas. O coordenador desta proposta já constatou esse problema localmente, tanto em animais marinhos como em moradores de áreas afetadas. Os mecanismos estudados estão relacionados a esses problemas ambientais. Por isso, o projeto contribuirá à resolução desses problemas.

5. Riscos e Dificuldades

Comentar sobre possíveis dificuldades e riscos potenciais que poderão interferir na execução das ações propostas e comprometer o atingimento das metas e objetivos preconizados. Explicitar as medidas previstas para contornar ou superar essas dificuldades.

Todos os equipamentos necessários para a pesquisa estão disponíveis em nosso laboratório e em cada instituição colaboradora. Os equipamentos principais para medir fluorescência e corrente elétrica, foram trazidos ao Brasil pelo Coordenador da proposta. Somente pedimos aqui uma câmara de CCD intensificada para poder detectar cada macromolécula durante sua translocação. Isso é necessário para poder correlacionar as observações de fluorescência com as de condutância iônica. O proponente já desenhou e construiu muitos instrumentos eletrônicos, ópticos, mecânicos, etc. Ele trouxe ao Brasil ferramentas e materiais para o reparo de todos seus instrumentos. Por isso, não antecipamos problemas com o funcionamento deles. O problema atual da energia elétrica foi resolvido um ano atrás com a compra, pelo proponente, de vários aparelhos de voltagem no-break e baterias. Todos os colaboradores estrangeiros são colegas do Coordenador de muitos anos.

6. Outros Projetos e Financiamentos

Indique outros projetos de pesquisa em andamento dos quais participem membros da equipe proponente, incluindo a origem e o valor do financiamento. Informe se uma proposta idêntica ou equivalente está ou não sendo financiada ou submetida a outra agência financiadora.

Todos os equipamentos necessários para a pesquisa estão disponíveis em nosso laboratório e em cada instituição colaboradora.

O proponente/coordenador desse projeto não tem conseguido apoio desde sua chegada a Aracaju em 1998. Por isso, é pertinente dar uma explicação. Mas, por favor, confira as credenciais do Coordenador/Proponente, na homepage:

http://Go.To/Credenciais

Entre 1998 e 2000, o proponente recebeu do CNPq cartas de rejeição justificando que o proponente não tinha um currículo bom e que não tinha recurso de apelação. No começo de 2000, esse proponente descobriu que seu currículo no Banco de Currículos do CNPq, não tinha publicações. O proponente contatou os responsáveis do Banco de Dados do CNPq e recebeu a explicação de que isso foi um "erro do software". O proponente retificou o problema e recebeu sua Bolsa de Produtividade logo depois. Porém, a Proposta APQ acompanhando à bolsa, foi negada. Como na experiência do proponente, os relatórios sempre acompanham as cartas de rejeição e aceite, na ausência desses relatórios, o proponente lutou por vários meses para obter do CNPq os relatórios dos consultores externos. Foi somente em março de 2001 que o proponente recebeu os relatórios, os quais recomendavam apoio. Com esses dados, o proponente perguntou ao CNPq por que se pesquisador é bom (bolsa de produtividade) e projeto é bom (relatórios e palavras da Coordenadora de Biofísica), por que não recebe apoio. A resposta finalmente chegou em março de 2001: "falta de pós-graduandos". Com essa nova informação a situação mudou. Como a instituição do proponente carece de curso de pós-graduação na área, o proponente começou a procurar estudantes em outras instituições. Essa ação facilitará a resolução dessa nova crítica do CNPq (não antecipada pelo proponente porque na sua experiência de 19 anos nos EUA e Canadá nunca viu que podia-se supervisar pesquisa de pós-graduandos sem dinheiro para pesquisa). É importante notar que o prestigio internacional do proponente facilita a abertura de programas internacionais de treinamento de graduandos, pós-graduandos e pós-doutores (p.ex., Johns Hopkins University, Universitiy of Maryland at Baltimore, National Institutes of Health, State University of New York-Stony Brook, University of Calgary Faculty of Medicine, etc.).

Também é importante notar que o proponente chegou ao Brasil em Junho de 1997 convidado pela USP-Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) para ocupar uma das vagas de Professor Titular oferecidas pela FAEPA (HC-Ribeirão Preto). Documentos pertinentes encontram-se na homepage da proposta. No final de 1997, o proponente descobreu que as vagas foram canceladas. Para salvar os equipamentos e materiais (a contrapartida lista alguns deles) trazidos ao Brasil (ao pedido da USP-FMRP), o proponente aceitou o emprego atual. Infelizmente, a instituição é jovem, situada no Nordeste do Brasil, e sem apoio para pesquisa (exceto através de seu próprio financiamento e da ajuda de seus colegas no exterior).

Finalmente, todos colaboradores desta proposta possuem facilidades de prestigio internacional. Dados seus cargos e verbas, eles não tem problemas de espaço e materiais para realizar as pesquisas propostas.

Esse proponente pede desculpas ao leitor se a explicação parece apaixonada. O único propósito do proponente é o de esclarecer a situação atual e a falta de apoio recebida desde sua chegada a Aracaju.

7. Referências Bibliográficas

Além das referências supracitadas, o leitor pode encontrar mais referências clicando nos seguintes links.

Bibliografia da Proposta enviada ao CNPq

Algumas das Nossas Publicações Sobre a Membrana Celular

Bustamante & McDonald, 1983, Bustamante, 1985, Bustamante, 1987

Referências de PubMed sobre NPCs nos Últimos 30 dias.

Revisões de PubMed Sobre NPCs nos Últimos 5 Anos

Métodos e Conceitos de Biologia Celular/Molecular Usados

1st EMBO Workshop on Ca Signals in the Cell Nucleus
Agosto 20-23, 1998

Introdução
Os genes nucleares determinam a estrutura e função nos eucariontes. Sua atividade é regulada por sinais que se deslocam desde o citoplasma ao núcleo. A maioria desses sinais usam os complexos de poros nucleares (NPCs) (localizados no envoltório nuclear, NE, veja Laskey, 1998). Os NPCs regulam o cargo transportado através do NE (fatores de transcrição, mRNA, etc.). Desde 1990, patch-clamp (p.ex., Matzke et al., 1990; Mazzanti et al., 1990) confirmou os experimentos clássicos com microelectrodos (ver referências abaixo). Essas observações apoiam a idea que os NPCs também regulam o fluxo de ions (revisado em Loewenstein et al., 1966). O comportamento do NPC como canal ionico pode ser visto com o paradigma do canal ionico condutor de macromoléculas (Bustamante et al., 1995a, ver abaixo). Esses experimentos validam patch-clamp como um método apropriado para a avaliação da sinalização nuclear e, por tanto, para a compreensão dos mecanismos de controle da atividade e expresão dos genes. Assim, eles são de relevância a clonagem e terapia gênica.

Estrutura do NPC

Na direita mostramos o modelo do NPC do grupo de Aebi em Basel. A figura é tomada de Panté & Aebi, 1994 (com permissão). O transportador ou tampão central, que contém os famosos complexos p62, é desenhado transparente para ilustrar que experimentos recentes indicam que ele não é parte do poro como fosse pensado no passado recente. Filamentos Citoplasmáticos estão representados pelos canos verticais. Filamentos Nucleoplásmicos, no outro lado, convergem para formar um basquete. O transportador, observado com EM, não é observado quando o material é preparado com substratos de transporte macromolecular. Isso sugere que o tampão é material fixado durante seu transporte através do NPC. Com algumas excepções, o entupimento do NPC e o transporte macromolecular dependem de Ca²⁺(ver abaixo e também visite a homepage de Prof. Dunn´s homepage) e de RanGTP (veja ilustrações da Max Planck Society e The Scientist).

Comportamento de Canal Ionico do NPC e o Contador Coulter

Estamos investigando a estrutura e função do NPC com patch-clamp, microscopia confocal confocal, microscopia de força atômica (AFM) e, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e de emissão de campo (FESEM). Nossos resultados demonstram que, devido a sua incapacidade (ou capacidade reduzida) de ser portadores de carga elétrica, as macromoléculas (fatores de transcrição, DNAs e RNAs, etc.) e outras partículas (naturais ou não) reduzem a condutância iônica do canal do NPC (p.ex., Bustamante et al., 1995a). Esse paradigma (veja animação abaixo) foi aplicado recentemente à medição de ácidos nucléicos (p.ex., Kasianowicz et al., 1996; Hanss et al., 1998; Akeson et al., 1999; Lubensky & Nelson, 1999; Meller et al., 1999). A medida que o tamanho macromolecular aumenta, o NPC fica entupido e isso faz com que o fluxo dos ions pare. Esse efeito é similar ao usado no contador Coulter (p.ex., Bezrukov et al., 1994 ; Bezrukov & Kasianowicz, 1997; Merzlyak et al., 1999). Para uma revisão sobre o contador molecular Coulter, veja Bezrukov (2000). Clique com o botão direito do mouse na imagem animada para visitar a página do princípio do contador Coulter. A Fig 2 de Daneholt (1997) ilustra uma partícula de RNP (RNA de alto peso molecular associada com proteínas) sendo exportada (com permissão). O estudo por Kiseleva et al. (1998) com FESEM demonstra as interações entre mRNA e NPCs. Nosso paradigma é mostrado abaixo (ver Bustamante et al., 1995a). Note que entupimento do canal central do NPC foi proposto na base de microscopia de fluorescência (ver página 350 da revisão de Reiner Peters Peters, 1986; ver também Keminer & Peters, 1999). Canais ionicos mitocondriais também mostram entupimento. Clique aqui com o botão da direita para ver algumas referencias sobre esses outros canais. Canais ionicos condutores de proteínas foram observados no retículo endoplasmático (ER) (veja Simon et al., 1989; Simon & Blobel, 1991, 1992). Finalmente, canais ionicos da membrana tilakoide das plantas também mostram entupimento quando estão conduzindo proteínas (p.ex. Teter & Theg, 1998).