L'ingresso è in fondo al portico della Canonica. Il museo, fondato nel 1949, raccoglie preziosi cimeli che testimoniano la gloriosa vita della basilica. In un ambiente ricavato a metà rampa dello scalone è collocato il tesoro che, fra le opere di oreficeria più preziose, custodisce la Croce processionale, del XV secolo. Dal pianerottolo, dove tra le due porte si trova il medaglione in stucco con il busto di Sant'Ambrogio, del XII secolo, si entra nella Sala I detta degli Arazzi. Nella Sala II, detta delle stoffe, si trovano i preziosi tessuti, noti sotto il nome generico di dalmatiche di Sant'Ambrogio, tra i quali ` un damasco del IV secolo con scene di caccia, di provenienza orientale. Inoltre, stoffe che appartennero al sarcofago del Santo, rinvenute nel 1940 nella cappella del transito. Nella Sala III, detta dei Paliotti, si trova il trittico di Bernardino Zenale raffigurante la Madonna e i Santi Ambrogio e Girolamo (1494). Inoltre vari Paliotti d'altare, tra i quali uno a ricami del XV secolo. Nel passaggio sono esposti alcuni involucri delle bombe che nel 1943 colpirono la basilica. La Sala IV, è detta della Lettiera perché al centro vi è esposta un'antica lettiera che si crede appartenuta a Sant'Ambrogio e sulla quale sembra sia morto il Santo. Interessante la riproduzione delle antiche porte della basilica con alcuni frammenti lignei, originari (IV secolo) di squisita modellazione classica. La Sala V, detta degli Affreschi, ospita pregevoli opere di pittura, fra le quali Gesù fra i dottori, affresco del Bergognone, e la Madonna del Latte, del Luini. Nelle vetrine sono esposti alcuni dei cinquantacinque codici manoscritti in pergamena che documentano la storia della miniatura lombarda dal X al XVIII secolo. Nella Sala VI detta delle vicende storiche, arazzi del XVII secolo, disegni, stampe e documenti.