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Proteínas

1- Introdução:

             São macromoléculas formadas pelo encadeamento de moléculas de aminoácidos. Podem ser basicamente classificadas em proteínas simples (quando hidrolisadas liberam somente aminoácidos) e proteínas conjugadas (quando hidrolisadas liberam aminoácidos e componentes orgânicos ou inorgânicos como, por exemplo, as cromoproteínas, lipoproteínas, glicoproteínas e fosfolipídeos). Apresentam inúmeras funções mostradas no quadro abaixo.

            O teor total de proteínas no plasma humano é de aproximadamente 6 a 8 g/dl. Em um pH normal de 7,4 as proteínas se encontram na forma aniônica. Analisadas quimicamente e por processos de separação eletroforética, podem ser separados em 3 tipos: albumina, globulina e fibrinogênio.

            A Albumina é a mais abundante das proteínas séricas, sendo sintetizadas no fígado. 

            As globulinas é uma mistura complexa de proteínas que quando separadas por eletroforese origina várias frações: alfa 1, alfa 2, beta,  teta  e gama1 e gama2.

O Fibrinogênio é o precursor da fibrina, a substância do coágulo sangüíneo, assim como a albumina, é sintetizada no fígado.

Observa-se na figura abaixo o padrão eletroforético de proteínas plasmáticas em pH 8,6.

Figura 01. O gráfico mostra a ordem de migração ao longo do eixo horizontal, com proteínas de maior mobilidade mais próximas do ânodo. A altura da banda ao longo do eixo vertical mostra a concentração da proteína (DEVLIN, 2002).

Figura 02. Conformações estruturais de uma proteína.

  Métodos de dosagem de proteínas

 

Para se identificar e dosar as proteínas há vários métodos, com suas respectivas características, vantagens e restrições. Apresentamos a seguir uma seleção de técnicas que iremos utilizar nesta prática:

 

a) Identificação de proteínas pelo método de Biureto – Esta reação ocorre quando há dois ou mais laços peptídicos em meio fortemente alcalino a solução diluída de cobre produz cor azul-violeta. Esta cor se deve a formação de complexos de coordenação entre o íon cúprico e quatro grupos amina de duas cadeias protéicas adjacentes.

 

b) Identificação de aminoácidos pelo método da Ninhidrina – Essa reação ocorre pela presença do amino grupo livre e possibilita a determinação quantitativa do aminoácido. A ninhidrina é um agente oxidante poderoso que causa a descarboxilação oxidativa dos aminoácidos produzindo CO2, NH3 e um aldeído com um átomo de carbono a menos. A ninhidrina reduzida reage com a amônia liberada formando um complexo de cor violeta (a leitura máxima ocorre em 570nm).

 

c) Efeitos desnaturantes: (temperatura, ácidos e bases fortes) Ë uma mudança estrutural e funcional da proteína original sem alteração na seqüência dos aminoácidos. O efeito da temperatura promove a destruição de pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas que leva ao desnovelamento da molécula.  O efeito do ácido leva a alteração da carga líquida da proteína. Valores alterados de pH onde haja excesso de carga positiva ou negativa concorrem para desestabilizar a estrutura compacta da proteína. É importante ressaltar que a conformação nativa das proteínas é estável somente numa faixa estreita de valores de pH. 

d) Precipitação das proteínas com soluções salinas (Salting-out): baseia-se na formação de um sal com as proteínas em solução que se encontra na forma iônica e um ânion ou cátion inorgânico adicionado na forma de sal. Na técnica usada nesta prática o ácido fosfotungstíco (Na2WO4. H2O + H2SO4) tem função aniônica onde a proteína atua como cátion. Essa precipitação é feita em meio ácido em relação ao pI da proteína. O processo é revertido por alcalinização. O precipitado formado é um sal pesado, o proteinato.

 

e) Precipitação das proteínas com solventes orgânicos: A ação desses solventes vai depender da sua maior ou menor polaridade e, portanto, da sua capacidade de interagir com certos grupos laterais das proteínas através de pontes de hidrogênio ou promovendo ruptura de ligações hidrofóbicas. Os detergentes são substâncias orgânicas que apresentam grupos hidrofóbicos (apolares) e grupos hidrofílicos (polares). As cadeias laterais hidrofóbicas das proteínas podem estabelecer fortes interações com a parte hidrofóbica da molécula de detergente enquanto que a parte polar da molécula estabeleceria forte interação com o solvente e com os grupos polares da proteína. Assim devido aos dois tipos de forças presentes, a estrutura protéica tenderia a ser abrir e desordenar.           

Obs: A desnaturação pode ser ou não um processo reversível; tudo vai depender do grau de alteração que ocorreu na estrutura da proteína. Certos tipos de alterações, como por exemplo, rupturas de ligações covalentes (por exemplo, S-S) são consideradas como um processo irreversível.

Técnicas

 

Reação do biureto - Em um tubo de ensaio colocar 1,0 mL do reagente de biureto + 0,5 mL da solução de proteínas. Comparar a cor desenvolvida contra um branco.

 

Reação da ninhidrina – Em um tubo de ensaio colocar 2,0 mL da solução de ninhidrina + 0,2 mL da solução de proteínas. Ferver durante cinco minutos comparar contra um branco.

   

Desnaturação Térmica - Em um tubo de ensaio colocar 2,0 mL da solução de proteínas. Levar a chama até a fervura. Observar; separar o sobrenadante (se houver) adicionar o tampão ao precipitado e agitar.

 

Desnaturação ácida – Em um tubo de centrífuga colocar: 1,0 mL de TCA (ácido tricloroácetico) a 10% + 1mL de solução de proteínas. Agitar e observar; centrifugar por 5 minutos a 2500 rpm, separar o sobrenadante e fazer a reação de biureto. Ao precipitado adicionar tampão e agitar.

  

Precipitação Salina (Folin Wu): Em um tubo de centrífuga, colocar: 1,0 mL de solução de proteínas, 6,0 mL de água destilada e 1,0mL de H2SOa 0.67 N. Misturar por inversão e adicionar 2,0 mL de tungstato de sódio a 5%. Misturar novamente por inversão, em seguida centrifugar por 3 minutos a 2500 rpm. Ocorrendo precipitação total das proteínas o líquido deverá permanecer translúcido. O precipitado pode ser ressolubilizado pela adição de 3,0 mL de NaOH  a 2,5N.

 

Fracionamento protéico: Em um tubo de centrifuga juntar 0,5 mL de solução de proteína e 6,5 mL de sulfato de sódio a 22%. Agitar vigorosamente e acrescentar 3,0 mL de éter, misturar bem e centrifugar por três minutos a 2500rpm. O precipitado da interface é constituído pela fração globulínica a fase aquosa contém sulfato de albumina e fase superior é formada pelo éter.

 

Precipitação pelo etanol: Em um tubo de centrífuga colocar: 1mL de etanol gelado. Centrifugar e separar o sobrenadante: ao sobrenadante adicionar igual volume de TCA a 10% , centrifugar e adicionar 1,0 mL de tampão ao precipitado, tente dissolve-lo.  Ao precipitado adicionar 2,0 mL de tampão e agitar.             

 

4- Dosagem e curva padrão de proteína pelo método do Biureto.

Procedimento: Conforme a tabela abaixo:

  Misturar e Incubar durante 15 minutos a 37 ºC em temperatura ambiente. Retirar os tubos do banho-maria, deixar esfriar e ler no espectrofotômetro a 540 nm, zerando o aparelho com o branco.

1- Determine a concentração das proteínas totais e da albumina, usando o seguinte cálculo:

Proteínas Totais = Abs. da  amostra   x 7g/dL

                                     Abs. do padrão

 

A concentração da albumina deve ser corrigida usando o fator de correção = 14 (diluição da amostra).

2- Construa a curva padrão em papel milimetrado utilizando densidade óptica (Y) e concentração no (X).

3- Determine a concentração da solução de proteínas totais e da albumina, utilizando a curva padrão.  

Obs: A cor final da reação é estável por 2 horas.

 

Figura 03.Espectrofotômetro

 

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Fibrinogênio e Protrombina

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Albumina, hemoglobina, Lipoproteína e Transferrina.

Tubo

Padrão

(7,0 g/dL)

Sol.Teste

(Prot. Total)

Sol.Teste

(albumina)

Água

destilada

Biureto   

D.O.

Concentração

g/dL

1

-

-

-

1,0 mL

4,0 mL

 

 

2

0,2 mL

-

-

0,8 mL

4,0 mL

 

 

3

0,4 mL

-

-

0,6 mL

4,0 mL

 

 

4

0,6 mL

-

-

0,4 mL

4,0 mL

 

 

5

0,8 mL

-

-

0,2 mL

4,0 mL

 

 

6

1,0 mL

-

-

-

4,0 mL

 

 

7

-

1,0 mL

-

-

4,0 mL

 

 

8

-

-

1,0 mL

-

4,0 mL

 

 

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