MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

TEMA 1 – INTRODUCCIÓN

 

RELACIÓN ENTRE MICROORGANISMOS Y ALIMENTOS

 

Existen, fundamentalmente, tres tipos de posibles relaciones, según la consecuencia que tengan:

 

1.       Deterioro: no son patógenos

2.       Salud: patógenos del ser humano

3.       Fermentación: incluso deseable en determinados alimentos

 

DETERIORO

 

Cuando (en el pasado) se piensa en la conservación de alimentos se observa de manera empírica que hay tres factores importantes que hay que evitar para que no se produzca el deterioro:

 

-          luz

-          aire: envasado

-          humedad: desecación

 

Con los años aparecen técnicas de conservación alternativas, más elaboradas:

 

-          temperatura (appertización)

 

Con Pasteur se empezó a conocer la teoría de los mecanismos de deterioro. La microbiología comienza como ciencia y se tiene la posibilidad de diseñar mejores técnicas de conservación.

El conocimiento de la existencia de microorganismos responsables hace que puedan diseñarse métodos más racionales y cuantificarse los efectos que éstos pueden tener sobre la conservación o el alimento. Para esto fueron necesarios una serie de pasos:

 

-          identificación de microorganismos

-          métodos de aislamiento (cultivos axénicos)

-          métodos analíticos: hasta la llegada de la PCR el análisis de todos los microorganismos era demasiado largo. En la actualidad tienden a estandarizarse los métodos homologados, para poder facilitar la reproducción de los resultados.

 

SALUD

 

El desarrollo de patógenos suele progresar en paralelo con el deterioro. En el pasado no se conocía la relación alimento-enfermedad. También fue con Pasteur cuando pudo demostrarse. Comienza la distinción entre los microorganismos que deterioran los alimentos y los que, además, provocan enfermedades.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 2: MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

 

 

Existen muchas clasificaciones, la que nos interesa distingue cuatro tipos:

 

-          Bacterias: son los más importantes, ya que se desarrollan con mucha rapidez. No consideraremos a las arqueas porque no tienen importancia en alimentos debido a sus condiciones de vida “extremas”

 

-          Hongos: Son eucarióticos. Dentro de los hongos distinguimos levaduras (unicelulares) y mohos (más complejos).

 

-          Virus: para la industria alimentaria tienen una importancia relativa puesto que no pueden multiplicarse en alimentos

 

-          Parásitos

 

BACTERIAS

 

Aunque incluye muchos y variados grupos, todas tienen en común la necesidad de una fuente de energía y otra de carbono. Podemos clasificarlas según el modo de obtención. Por sus características los alimentos no permiten el desarrollo de organismos fotosintéticos, ni de aquellos que utilicen energía de compuestos químicos inorgánicos, o carbono de CO₂. Las bacterias que mayoritariamente van a crecer en los alimentos serán quimioorganotrofos.

Todas las bacterias (siempre habrá una excepción) tienen en común el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Como todos sabemos éste es fundamental para posteriores reacciones catabólicas. Durante el TCA se genera poder reductor en forma de NADH, que puede ser recuperado de dos formas:

 

-          Fermentación: los microorganismos fermentativos carecen de cadena de transporte de electrones, o ésta no es funcional. Normalmente son anaerobios (el O₂ les resulta tóxico) pero otros solo fermentan en ausencia de O₂ (fermentativos facultativos). Para regenerar el NAD⁺ utilizan la reacción de conversión PYR --> LAC. Existen varios tipos de fermentación según el producto que generen: láctica, propiónica, alcohólica. No generan gradiente protónico porque carecen de cadena, la única forma de conseguir el gradiente es mediante la protón ATPasa a costa de hidrolizar ATP.

 

-          Respiración: el NADH cede electrones a una cadena transportadora que acaba en un aceptor: oxígeno, azufre. Se genera  gradiente de protones. Suelen realizarla microorganismos aerobios, pero eso no significa que tengan que utilizar O₂, (NO₃^-, SO₄^2-) simplemente no les es tóxico. El gradiente de H⁺ es en realidad otra fuente de energía, su disipación puede dar lugar a tres acciones:

 

1.       formación de ATP (mediante protón ATPasa)

2.       movimiento (no utiliza ATP, sino este gradiente)

3.       transporte de nutrientes

 

Además de su metabolismo, podemos utilizar para clasificarlos su forma (cocos, bacilos), movimiento (polar, perítrico, inmóviles), color por formación ocasional de pigmentos,formas de resistencia o respuesta ante tinción de Gram

 

NUESTRAS BACTERIAS ESTRELLA

 

GRAM NEGATIVAS

 

1.       Aerobias, metabolismo respiratorio

 

a.         pseudomona: el “deteriorator” fundamentalmente en condiciones aerobias, es un grupo de Gram^- muy heterogéneo

b.         psicrobacter, xanthomonas, alcalígenes, acinetobacter, brucella (patógeno)

 

2.       Microaerófilos

 

a.     helicobacter y campylobacter (patógenos)

 

3.       Anaerobios facultativos:

 

a.       enterobacterias (E. coli, salmonella (patógeno), proteus)

b.      vibrios, aeromonas, plesiomonas

 

GRAM POSITIVAS

 

1.                        Formadoras de endosporas:

 

a.       bacillus (aerobios) cereus (patógeno)

b.       clostridium (anaerobio) botulinum, perfringes (patógenos)

 

2.                        No formadores de endosporas:

 

a.       bacterias del ácido láctico: realizan una fermentación láctica, son responsables de deterioro pero no son patógenos: lactobacillus, lactococcus

b.      micrococcus: son estrictamente aerobios, también responsables de deterioro

c.       staphylococcus: no son patógenos en sí, pero liberan toxinas que dan dolorcito en el cuerpo

d.       crochotrix: importantes para el deterioro

e.       listeria: patógeno

 

EL MARAVILLOSO MUNDO DE LAS ENDOSPORAS

 

Las células vegetativas (bacterias normales) son aquellas metabólicamente activas. A nivel de estructura son unicelulares y rodeadas por una pared celular (diferente según sean Gram⁺ o Gram^-)

Todos los microorganismos formadores de endosporas tienen, esencialmente, una estructura similar. Sin embargo en determinadas circunstancias (no se conocen exactamente pero, por ejemplo, la falta de nutrientes activa el proceso) forman esporas endógenas de resistencia. Junto con la esporulación también ocurre:

 

1. producción de antibióticos y/o toxinas para evitar otros crecimientos microbianos
2. unas adquieren competencia para admitir DNA exógeno
3. segregan enzimas hidrolíticos: lipasas, proteasas

 

 

MECANISMOS DE FORMACIÓN DE LA ESPORA

 

1. En la célula madre se produce un septo y una de las dos partes se invagina
2. Después se sintetiza el córtex, formado por péptido glicano modificado, y se forma una capa interna de pared celular. El cortex es el responsable de la deshidratación del citoplasma, lo cual va a hacer a la espora resistente a radiaciones, desecaciones...
3. Rodeando al cortex hay una cubierta de capas de naturaleza proteica. La cubierta impermeabiliza y protege al interior del ataque de compuestos oxidantes (H₂O₂) enzimas hidrolíticas y otros agentes químicos que pudieran afectar al péptidoglicano.
4. Y finalmente un exosporium (no siempre)

 

Al mismo tiempo que la síntesis de las diferentes capas suceden otras cosas:

 

1. Deshidratación del citoplasma (se reduce hasta el 10%)
2. Acumulación de ácido dipicolínico, que servirá para acomplejar iones Ca²⁺, Mg²⁺ y Mn²⁺. Esta acumulación de iones tiene una función importante.
3. Pproteínas SASA (en inglés proteínas pequeñas solubles en ácido) que se unen a DNA. Protegen a las bases de posibles daños producidos por rayos UVA

 

La espora puede permanecer en este estado de latencia deshidratada durante muchísimo tiempo; si encuentra condiciones favorables “germina” y da lugar de nuevo a la célula inicial y funcional. Este proceso se dispara por señales tales como: en ocasiones disminución de pH, adición de aminoácidos o determinadas sales o tratamiento térmico a 80ºC

Esto se conoce empíricamente, pero no se tiene muy claro el mecanismo a nivel molecular. Se sabe que hay proteínas de membrana situadas en la membrana externa importantes en el proceso de captación de señales y posterior germinación.

 

HONGOS (EUMYCOTA)

 

Se caracterizan por:

 

1. ser eucariotas
2. ser formadores de esporas no de resistencia
3. no tener clorofilas
4. tener reproducción sexual o bien asexual
5. alimentarse por absorción

 

Son importantes en fitopatología, en procesos de fermentación industrial y formación de antibióticos. Se dividen en dos subclases: levaduras y mohos

 

LEVADURAS

 

 Hongos unicelulares, se dividen por gemación aunque a veces pueden dar lugar a meiosis. Son inmóviles, más grandes que bacterias, anaerobios facultativos (aunque suelen preferir fermentación). Se identifican y clasifican igual que las bacterias: fenotipo, metabolismo, actividades enzimáticas, tipo de reproducción

 

MOHOS: 

 

Hongos pluricelulares. Diferenciamos dos clases:

 

-          septado: las células están separadas por tabique, aunque los citoplasmas comunican

-          cenocítico: todos los citoplasmas se fusionan. Los núcleos suelen trasladarse hacia la zona de crecimiento de la hifa.

 

Dos tipos de micelio:

 

-          sustrato: en superficie o dentro, tiene como finalidad la toma de nutrientes

-          aéreo: hifas que crecen hacia arriba (finalidad reproductiva

 

Los mohos se alimentan normalmente de materia muerta y liberan gran cantidad de enzimas hidrolíticas (que no son frecuentes en bacterias) que degradan moléculas complejas, por eso suelen ser los iniciadores de procesos de deterioro. Para clasificarlos se siguen otros criterios: reproducción sexual (zigomicetos, ascomicetos, basidiomicetos, deuteromicetos)

 

REPRODUCCIÓN FÚNGICA

 

Dos formas: la reproducción asexual está prevista para la colonización, no contempla mejoras genéticas. Tipos:

 

 

1.       Fisión binaria, gemación (no hay formación de esporas)

2.       Formación de esporas asexuales:

 

a.       artrosporas (a partir de hifas en mohos)

b.       clamidosporas (finalidad más de resistencia)

c.       conidiosporas (junto con d, y e sirven para morfología)

d.       esporangiosporas

e.       blastosporas

 

La reproducción sexual conlleva fusión de gametos, o hifas; o bien fusión de gametangios generados exclusivamente para el momento de la reproducción:

 

a.         zigomicetos

b.         ascomicetos

c.         basidiomicetos (setas)

 

ORÍGENES DE LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA

 

La mayor proporción de microorganismos se encuentra en el  suelo:

 

1. Aire: es un ambiente hostil por varias razones: sequedad, rayos UVA, presencia de O₂. Además no contiene nutrientes, con lo que  los microbios no se multiplican, y su número solo aumentará por contaminación (estornudos, emisiones...). Los microorganismos no se mantienen largo tiempo en el aire. Los más habituales son aquellos que forman esporas (ligeras), también micrococcus y corynebacterium,  ya que son bacterias gram⁺ y tienen pigmentos que los protegen del UVA.

 

2. Agua: la carga microbiana del agua varía mucho con el tipo de agua:

 

4. Río, charca (más aporte del suelo, residuos humanos)
5. Costa, mar abierto: mayor salinidad, mucho menor proporción de nutrientes y Tª baja Triunfan los organismos acostumbrados a bajas temperaturas, por eso el pescado va a estropearse más en refrigeración

 

3. Suelo: la flora presente en el suelo suele estar en equilibrio con el agua. Aunque hay mucha diversidad el suelo es un nicho cambiante, así que van a fomentarse formas que puedan adaptarse mejor a los  cambios en las condiciones: strectomyces (bacterias), endosporas de clostridium y bacillus.

 

Además de estas fuentes de contaminación exógena, los alimentos poseen una microbiota propia, cuyo nicho habitual no es aire, suelo ni agua. Los vegetales por ejemplo: bacterias lácticas, levaduras, mohos... A medida que un fruto madura la resistencia que presenta a microorganismos es menor. Algunos patógenos para plantas (que no tienen que serlo para humanos) se seleccionan durante la maduración y hay que tenerlos en cuenta ya que implican serias pérdidas económicas a causa del deterioro.

 

 

En ocasiones sin embargo la materia prima debe seguir una transformación para convertirse en el alimento. Durante el procesado se aportan microorganismos al alimento (manipuladores, utensilios, maquinaria, transporte...)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 3: CINÉTICA DE CRECIMIENTO

 

 

A la hora de estudiar la cinética de crecimiento de microbios que se desarrollan sobre alimentos tenemos que tener en cuenta que los alimentos nunca van a presentar cultivos puros. Por lo tanto para el estudio se aislarán los microorganismos por separado. De esta forma encontramos parámetros aproximados que nos permitirán más tarde estudiar las interacciones.

 

a.       Fase de latencia: tanto mayor cuanto menor es N₀ (carga microbiana inicial). Durante esta fase no hay división celular, sino una adaptación génica a las nuevas condiciones. Será mayor cuanto más diferentes sean éstas a las anteriores del microorganismo.

 

b.      
Fase de crecimiento: una vez terminada la latencia el cultivo crece de una forma exponencial (N = N₀·2ⁿ) donde n es el número de generaciones.

 

La representación de log N/t resulta una línea recta cuya pendiente es log2/t de esta forma podemos conocer el tiempo de generación. Factores que influyen en el tiempo de generación: t, t, m (tassa de crecimiento específico dN/dt.

 

c.       Fase estacionaria: la tasa de crecimiento va disminuyendo hasta que se hace cero, por tres razones:

 

1.       desaparecen nutrientes, o bien O₂

2.       se acumulan residuos tóxicos de desecho

3.       en general cambian las condiciones iniciales “óptimas”.

 

        En la fase estacionaria puede ocurrir que los microorganismos dejen de  

        dividirse, o bien que se balancee el número de divisiones / muertes.

 

d.       Fase de muerte: se produce la lisis celular, tiene una pendiente menor en organismos que forman endosporas.

 

En caso de microorganismos en los que no sean unicelulares no puede graficarse logN/t sino otra variable (peso, diámetro) con lo que no podría detectarse la fase de muerte (el peso, por ejemplo, no varía).

 

TEMA 4: FACT0RES DE CRECIMIENTO

 

 

Existen diferentes factores que hacen que unos microorganismos se desarrollen antes que otros. También va a decirnos que tipo de microbios contaminarán antes un determinado alimento. En general la tasa de crecimiento es mayor para bacterias y para levaduras y mohos. Los tipos de factores son:

 

-          Intrínsecos: son aquellos inherentes al alimento: nutrientes, sensibilidad a sistemas antimicrobianos, presencia de barreras, actividad de agua, pH y potencial redox

-          Extrínsecos: determinados por el ambiente del suelo: Tª, atmósfera del entorno (O₂, CO₂,H_R)

-          Factores de procesamiento: producen una selección microbiana durante el procesado: físicos [térmicos, irradiación, liofilización, filtración, congelación], químicos [conservantes]

-          Factores implícitos: influencia que se produce entre microorganismos contaminantes, puede ser de dos tipos :sinérgicos o antagónicos.

 

FACTORES INTRÍNSECOS

 

pH

 

En función del pH un alimento será ácido, alcalino o neutro. Lo habitual es que los microorganismos sean neutros o ligeramente ácidos (5.5-6 levaduras, 6.5-7 bacterias) siempre tendrán un pH óptimo y un rango en el que pueden desarrollarse aunque no sea a toda velocidad. Podemos considerar que a menos de 5.5 ningún patógeno va a desarrollarse (excepciones haylas, por supuesto) Para complicar un poco el asunto según que ácido estemos utilizando se modifica el pH mínimo para un mismo microorganismo. Propiónico y acético son los más bactericidas, pero ¿cual es la razón de esto? A medida que el pH disminuye, influyen en el crecimiento microbiano dos factores:

 

-          Aumento de la concentración de protones: no influye el tipo de ácido, saturan los transportadores de membrana, precipitan iones útiles y proteínas extracelulares, dificultando efectivamente su desarrollo

-          En ácidos con pK más alto predomina R-COOH con lo que pueden atravesar la membrana. Dentro de la célula el pH es 7, así que liberarán H⁺ dentro de la célula, causando estragos. Ante esta situación se produce en las bacterias una respuesta homeostática, intentan expulsar protones en contra de gradiente a costa de energía. Si el pH exterior  es 5.5 se desencadena una respuesta de tolerancia ácida se expresan de forma diferente como 18 proteínas. Esto implica más energía aun (protón ATP-asa) A pH<5 respuesta de stress ácido; llega un momento en que no compensa el gasto energético y la célula se hace inviable.

 

ACTIVIDAD DE AGUA

 

Un requisito del desarrollo es que se encuentre agua disponible (a_w), que es aquella que no se encuentra ligada, absorbida y ocluida. a_w se refiere a la proporción entre la presión de vapor en presencia de un soluto y la del agua pura. En presencia de cualquier soluto que absorba agua o se hidrate a_w<1 (en agua pura es 1)

 

a_w = H_R/100

 

A medida que disminuye a_w los microorganismos doblan. Como siempre tienen un mínimo y un valor óptimo. Si dibujamos vemos que en el mínimo (importante):

 

-          aumenta la fase de latencia

-          disminuye la pendiente de crecimiento

-          disminuye el número máximo de microorganismos

 

En alimentos que han sido procesados hay 3 factores de disminución de a_w:

 

1. adición de solutos
2. deshidratación y liofilización
3. congelación (resta disponibilidad al H₂O)

 

Medir la actividad de agua es muy complicado, por lo que se mide directamente el contenido total de agua y se relaciona para cada alimento con su a_w. Este valor no es constante porque está en un equilibrio dinámico con el ambiente y la acción de microorganismos (suelen generar H₂O del metabolismo y aumentar  a_w de forma local)

 

POTENCIAL REDOX

 

Hay una serie de componentes que pueden formar parte del equilibrio redox de un alimento.

 

El pH es importante en el potencial. Cuanto más alto sea menos oxidante será el alimento. El crecimiento de un microorganismo variará el potencial según:

 

1. si es aerobio, y se consume oxígeno disminuye E
2. se genera hidrógeno del metabolismo

 

Cuando el potencial es positivo se desarrollan fundamentalmente bacterias aerobias. Respuesta bacteriana al potencial redox:

 

 

AEROBIOS	aprox –50, 500 mV
FACULTATIVOS	-600, +180 mV
ANAEROBIOS	-30,+216 mv SIEMPRE QUE NO HAYA O2

 

NUTRIENTES

 

Es un factor obvio ¿que nutrientes necesitan?

 

1. Carbohidratos: como fuente de energía y de carbono. No es frecuente que los microorganismos (excepto mohos) tengan la capacidad de degradar polisacáridos como el almidón, con lo que suelen alimentarse de azúcares sencillos.

 

2. Fuente de nitrógeno: tampoco suelen degradar proteínas, sino que toman el nitrógeno de aminoácidos presentes en el medio,  bien de sales (gram^-)

 

3. Azufre y fósforo

 

4. Vitaminas: mientras las bacterias gram^- las sintetizan (los mohos también) las gram⁺ necesitan que éstas se encuentren en el medio para poder tomarlas.

 

BARRERAS DEL CRECIMIENTO (FÍSICAS Y QUÍMICAS)

 

Un factor a tener en cuenta son la presencia de barreras que protegen al alimento, como es la cáscara del huevo, o bien pH ácido etc. Podemos dividirlas en:

 

-          Físicos: cáscara, tegumento, tejido conectivo, películas grasas de cubierta

-          Sustancias antimicrobianas: en los vegetales no se han encontrado sustancias a una concentración suficiente como para tener efectos bactericidas. Sin embargo en animales existen varios sistemas, como son:

 

a.      Lactoferrina: elimina disponibilidad del hierro que es necesario para microbios. Se encuentra en leche, al igual que el sistema lactoperoxidasa

b.      Ovotransferrina: igual, quela hierro

c.      Avidina: quela biotina

d.      Ovoflavoproteína: igual pero con riboflavina

e.      Lisozima: sistema enzimático que rompe la pared celular, son más sensibles bacterias gram⁺

f.        Sistema lactoperoxidasa: se basa en la reacción del isotiocianato con peróxido de hidrógeno para dar lugar a hipotiocianato; sustancia antimicrobiana que reacciona con grupos sulfhidrilo.

 

 

 

FACTORES EXTRÍNSECOS

 

TEMPERATURA

 

Es uno de los más importantes a tener en cuenta a la hora de elegir métodos de conservación. Si hacemos una representación del desarrollo de un microorganismo frente a la temperatura siempre resultará una distribución normal (campana de Gauss)  temperaturas óptima, máxima y mínima.

 

a.       La temperatura óptima es aquella en la que la tasa de crecimiento es la más alta. Suele estar muy cerca del máximo (aprox 10ºC).

b.       Cuando Tª es mayor de la óptima las proteínas microbianas empiezan a desnaturalizarse y el microorganismo tiene que activar mecanismos de respuesta (respuesta de stress térmico) que consisten en la generación de proteínas encargadas de plegar a las que se desnaturalicen. Llega un valor de Tº (máxima) en el que la energía necesaria para la respuesta no compensa, con lo que la célula deja de ser viable

c.       Por debajo de la temperatura óptima el crecimiento es más lento, pero la pendiente es menor (aproximadamente 30ºC). Generalmente la temperatura mínima no es bactericida, sino que se reduce a un aletargamiento reversible; la bacteria volverá a ser funcional si vuelve a subir Tª. A medida que disminuye Tª también se produce una respuesta d la célula: se paralizan los mecanismos de transportes de nutrientes, la membrana va perdiendo fluidez (debido a su componente graso) y funcionalidad. Los microorganismos tienden a modificar la composición de la membrana para que ésta no se produzca.

 

Los microorganismos pueden clasificarse en función de sus tres valores de Tª:

 

TIPO	Tª ÓPTIMA/ºC	Tª MÁXIMA/ºC	Tª MÍNIMA/ºC
termófilos	55-65	70-90	40-50
mesófilos	30-40	45-50	5-15
psicrótrofos	20-30	40	-5-5
psicrófilos	10-15	15-20	-5-5

 

 

Esto quiere decir que, dependiendo de la Tª del alimento o de su procesado van a seleccionarse diferentes microorganismos.

 

-          Termófilos no van a tener mucha importancia en alimentación, dada su Tª óptima

-          Dentro de los mesófilos se encuentran casi todos los organismos patógenos, así como los que habitan en la carne.

-          Los organismos psicrótrofos también van a tener importancia. Se desarrollan bien en refrigeración, y además no se inactivan a temperatura ambiente.

-          Psicrófilos tampoco son muy habituales, dado que a temperatura ambiente no son viables.

 

MICROORGANISMOS QUE SE DESARROLLAN EN REFRIGERACIÓN
Pseudomonas (deteriorator)	Brochotrix (gram positivo)
Shewanella (olor a pescado)	Enterococcus
vibrio	Aeromonas, yersinia, listeria, clostridium botulinum

 

Con lo cual la refrigeración no será garantía de que no existan patógenos

 

MÁS FACTORES: O₂ (no lo explicó) CO₂

 

El CO₂ tiene generalmente un efecto negativo e inhibitorio, más acusado en bacterias gram^-

 

FACTORES DE PROCESAMIENTO

 

Los factores de procesamiento son básicamente métodos de conservación, que combinan factores intrínsecos y extrínsecos

 

PROCESO	EFECTO y FACTORES IMPLICADOS
Congelación,desecado,curado	disminuyen aw
Refrigeración, congelación	disminuyen Tª
Envasado al vacío o atmósfera modificada	potencial redox, cantidad de O2
Adición de ácidos, fermentación láctica	disminución de pH
Emulsificación	Introduce barrera porque los microorganismos no atraviesan la grasa
Adición de conservantes
Pasteurización	aumento de Tª
Radiación	inactivación de microorganismos

 

FACTORES IMPLÍCITOS

 

Tienen que ver con los microorganismos como organismos individuales:

 

-          Genéticos: las bacterias Gram^- suelen desarrollarse más rápido que Gram⁺, y mucho más que levaduras y mohos.

-          Van a seleccionarse aquellos que aguantan mejor cambios (respuestas: osmótica, ante ácidos) en las condiciones del ecosistema

 

O como parte de un ecosistema en el que unos organismos modifican los parámetros (en especial intrínsecos) de los demás:

 

-          a_w : por ejemplo en silos de grano los mohos xerófilos se desarrollan a niveles de actividad muy bajos, al generar agua permiten que crezcan otros

-          pH: bacterias fermentativas disminuyen pH e impiden el crecimiento (antagonismo)

-          Nutrientes: pocos organismos pueden asimilar el almidón, sin embargo el género bacillus tienen actividad amilasa, que lo hidroliza y lo convierte en azúcar aprovechable para otros

-          Síntesis de antibióticos por parte de algunas bacterias

 

De esa forma el ecosistema microbiano no es estático, sino dinámico; varía con el tiempo, fundamentalmente a causa de los mismos microorganismos.

 

CONTROL MICROBIANO

 

El control microbiano basado en uno de los factores expuestos generalmente resultaba insuficiente, o bien debía ser tan extremo que estropeaba las características de calidad del producto, y obligaba a consumirlo de una determinada forma (pescado en salazón). En la actualidad se tienden a combinar varios factores subóptimos para evitar esos inconvenientes, por ejemplo:

 

37 ºC	pH = 7	20 min
27 ºC	PH = 7	50 min
27 ºC	PH = 5	80 min(tiempo gen)

 

MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA

 

En vez de realizar estudios alimento por alimento para estudiar la presencia de microorganismos la tendencia actual es de realizar modelos matemáticos que puedan ser válidos para cualquier organismo y alimento. La idea es desarrollar una ecuación matemática que refleje el comportamiento, su tasa de crecimiento y de inactivación; y poder formularlo en función de parámetros intrínsecos y extrínsecos que sean fácilmente medibles (pH). Se realizan en caldo de cultivo. Estos modelos matemáticos presentan tres niveles:

 

-          Primario: mide el nivel de los microorganismos con el tiempo. Para ser útil debe considerar toda la curva, incluidas las fases de latencia y estacionaria.

-          Secundario: estudia además el comportamiento cuando se modifica uno de los valores ambientales (Tª, pH)

-          Terciario: se tienen en cuenta varios factores al mismo tiempo. Los modelos terciarios son más que ecuaciones programas informáticos completos.

 

Sin embargo, aunque los programas son bastante potentes es necesario realizar su validación, dado que no contemplan todos los factores posibles (cantidad de glucosa, sinergismo ...) Generalmente suelen ajustarse bastante bien al comportamiento observado empíricamente.

Estos modelos terciarios van a servirnos:

 

a.           para realizar estimaciones de patógenos y evaluaciones de riesgo de una forma rápida (APPCC)

b.           demarcar límites de Tª en los que sea seguro almacenar el alimento, o procesarlo

c.           ahorrar coste económico y personal que supone el análisis exhaustivo de cada alimento en diferentes condiciones

d.           para reformular productos, o formular nuevos considerando las consecuencias que, por ejemplo la adición de más azúcar, puedan tener sobre la microbiota.

e.           Por último también puede utilizarse como demostración gráfica educativa para ilustrar de los riesgos a microlegos

 

TEMA 5 – DETERIORO

 

 

Un alimento se considera deteriorado cuando no tiene propiedades organolépticas óptimas. El deterioro implica pérdida económica y, en principio, no suele llevarse a cabo por patógenos. Se manifiesta generalmente antes de que los patógenos (que no suelen causar deterioro manifiesto) alcancen un nivel alto. Puede hablarse:

 

-          Deterioro no microbiano: oxidación, golpe, frío, insectos

-          Deterioro microbiano: es el que a nosotros nos interesa. Se manifiesta en el aspecto, sabor y olor el alimento

 

a.       aspecto: color (pigmentos, esporas, reacciones químicas), textura (acción de pectinolíticos), mohoso, formación de colonias o turbidez en líquidos

b.       sabor y olor: descomposición del alimento (proteína degradada) o bien por productos de desecho del metabolismo o por la misma presencia de microorganismos

 

 

Generalmente cuando nos referimos a deterioro solo consideramos la primera parte, hasta que el alimento ya no es útil para el consumo humano. Para retrasar la aparición de deterioro es importante que la carga inicial sea pequeña.

 

¿Como se utilizan las moléculas complejas?

 

Las proteínas se degradan por proteasas para dar lugar a péptidos (amargos) y aminoácidos (de sabor dulce). La proteolisis aumenta el pH y puede dar lugar a patógenos que estaban controlados por pH. También se desprende H₂S lo que da lugar a mal olor por desulfuración.

 

 

 

 

 

 

TEMA 6 – ANALISIS MICROBIANO DE ALIMENTOS

 

Desde hace tiempo se ha dado más importancia al análisis, por ejemplo, de APPCC ya que el análisis de alimentos tenía muchos inconvenientes en controles de calidad. Sin embargo para algunos aspectos sigue siendo una herramienta imprescindible. ¿Por qué es importante realizar análisis microbiano en alimentos (materias primas o procesada o productos alimenticios? Para:

 

1. determinar calidad microbiológica: inocuo, aceptable y estable
2. comprobar criterios microbiológicos: normas especificaciones y pautas
3. determinar la vida comercial
4. comprobar la higiene que se ha llevado durante el procesado
5. comprobar el buen funcionamiento de técnicas de conservación
6. determinar causas de alteración
7. aislar patógenos de alimentos sospechosos de contenerlos
8. evaluar la calidad microbiológica del entorno

 

Podemos usar varias técnicas:

 

-          cualitativas (marcan simplemente ausencia/presencia de microbios)

-          cuantitativas: determinantes del número total de bacterias

 

Hay que diferenciar entre técnicas convencionales de análisis, y las llamadas técnicas rápidas:

 

-          Convencionales: se basan en el crecimiento microbiano en distintos medios y en la formación de colonias. Tardan días en dar un resultado

-          Rápidas: son modificaciones de técnicas existentes, o bien técnicas nuevas de resultado rápido. Consisten principalmente mediante reacción con anticuerpos, o bien ácidos nucleicos.

 

TÉCNICAS TRADICIONALES DE RECUENTO

 

Existen diferentes técnicas de recuento:

 

-          recuento de colonias (en medio sólido)

-          número más probable (medio líquido)

-          por reducción de colorantes (azul de metileno)

-          medidas de impedancia

-          medida de absorbancia

-          medida de metabolitos o sustratos de metabolismo microbiano

 

Estos métodos implican el uso de un medio de cultivo:

 

alimento –-> dilución 1/10 --> homogeneización (imp) --> medio de cultivo

 

Estos medios pueden ser:

 

1. ricos: favorecen a todo tipo de microorganismos
2. selectivos: cristal violeta o antibiótico polimixina inhiben GRAM+, mientras litio, talio o penicilina inhiben GRAM-
3. electivos: se diferencian de los selectivos porque seleccionan a los microorganismos de una forma selectiva. Por ejemplo si añadimos lisina las levaduras van a crecer de forma más rápida.
4. diferenciales: con crecimiento en medios diferenciales se diferencian colonias mediante indicadores (de pH, o medios con actividad enzimática)

 

El recuento de colonias nos da idea del número de células viables que tenemos en la muestra. Se dice que una célula es viable cuando puede formar colonias, sin embargo es posible que células viable no sean capaces de formarlas (células con daño subletal) Las células que presentan daño subletal son más sensibles a medios selectivos, porque tienen dañada su capacidad de respuesta. Eso quiere decir que en un recuento tradicional podemos subestimar el número real de células. Para evitar el riesgo se incuba la muestra en un “medio de recuperación” para que luego estas células formen colonias, y se les vea el plumero.

Como en los microbios siempre hay excepciones existen otras células viables y sin daño que no forman colonias, ocurre por ejemplo con salmonella en ocasiones, en este caso será inútil el medio d recuperación.

 

EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS

 

MICROSCOPIA

 

Permite la medición directa de células viables. Puede utilizarse:

 

-          microscopia de contraste de fases

-          epifluorescencias: para diferenciar bacterias viables o no según la tinción de naranja de acridina, que varía su color  según se una a DNA o a RNA. Solo presentan RNA accesible aquellas células activas al transcribirlo para sintetizar proteínas.

-          cuantificación de ATP: la cantidad de ATP es más o menos constante en cada célula. Se estima acoplándolo a una reacción de la enzima luciferasa que produce luz en presencia de ATP. Si ponemos todos los reactivos en exceso la cantidad de luz resulta proporcional al número de bacterias. El problema es que no discrimina tipos de ATP (celular o bacteriano) Solo resulta válido para cultivos puros, o también en higiene industrial, para cuantificar restos orgánicos y bacterianos que queden, por ejemplo, tras la limpieza de una máquina.

-          citometría de flujo: marca de fluorescencia las células y se observa con un citómetro, que distingue y cuantifica varios tipos de fluorescencia.

-          mesófilos aerobios totales: dan idea de la carga microbiana existente, para ello se dejan crecer 48 h  en medio rico a 30ºC

-          psicrótrofos: igual pero realizado a 10-15ºC

-          lácticas:

-          esporas:

-          patógenos

-          bacterias indicadoras o índices: para evitar el gasto de tiempo  dinero que suponen los análisis completos microbianos se utilizan bacterias indicadores. Para que una bacteria se considere indicador debe tener características similares a patógenos (supervivencia, resistencia a antibióticos) debe estar siempre presente con el patógeno. Lo habitual es la utilización de bacterias coliformes.

 

INCISO: BACTERIAS COLIFORMES

 

No son un grupo taxonómico, sino funcional, que reúne caracteres comunes:

 

-          fermentan lactosa en presencia de sales biliares (gram-) produciendo ácido y gas: enterobacter, E. coli (la única fecal), enterobacter, klebsiella, citrobacter

 

Como el usar fermentación de lactosa da no se que problema empiezan a utilizarse más enterobacterias (fermentan glucosa) nos dice la calidad higiénica de un alimento

 

METODOS RÁPIDOS:

INTERACCIONES ANTÍGENO – ANTICUERPO (INMUNOLÓGICO)

 

TÉCNICA DE SEPARACIÓN INMUNOMAGNÉTICA

 

Estos métodos rápidos suelen ser complementarios de los tradicionales, que acortan o eliminan alguno de los pasos del análisis. En métodos tradicionales se seguían cuatro pasos:

 

1.       preenriquecimiento

2.       enriquecimiento selectivo del microorganismo que buscamos

3.       cultivo en medios diferenciales

4.       pruebas de confirmación bioquímica (por ejemplo la galería API 20)

 

En el caso de este método rápido:

 

1.       igualmente se hace un preenriquecimiento

2.       se adicionan anticuerpos (reacción selectiva) incluidos en una “bolita” magnética

3.       mediante un imán se seleccionan los antígenos que se encuentran unidos a anticuerpos

 

TÉCNICA DE ELISA

 

Se lleva a cabo en placas multipocillo. También se basa en reacciones antígeno-anticuerpo. Se pegan anticuerpos específicos de células o toxinas, de la siguiente forma:

 

-          se añade la muestra, si está presente lo que buscamos se producirá una interacción

-          el revelado se lleva a cabo mediante otro anticuerpo que tiene acoplado un enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). Si se produce la reacción enzimática sabremos que la interacción se ha producido.

 

AGLUTINACIÓN LATEX

 

Es esencialmente similar a la técnica de Elisa, excepto en el método de revelado:

 

-          placa multipocillo con anticuerpos rodeados de partículas de látex

-          si no hay antígeno, el látex se depositará

-          si lo hay se forma una red que impide el depósito y se distribuye por el pocillo

 

TÉCNICAS QUE UTILIZAN DNA

 

1. PCR: Amplificación de un fragmento de DNA (ver ingeniería genética) mediante “primers” [iniciadores] que son oligonucleótidos específicos. Válido para microorganismos con una secuencia de DNA conocida.

 

2.  HIBRIDACIÓN: Se trata de diseñar una sonda específica a la que se marca radiactivamente. El DNA total se digiere y se separa en un gen. Se incuba la sonda y se  observa si se produce una hibridación. e identificamos que bandas la dan.

 

3. RNA 16S (DNA chips): Tiene secuencias específicas de ada microorganismos. Se sitúan sobre un cristal específico hasta 6000 secuencias que se encuentran en posiciones conocidas. Preparamos RNA total (desnaturalizado) y amplifica marcando con una fluorescencia la cadena complementaria a la del cristal y las hibridamos. Aquellas que efectivamente lo hagan significará que hay presencia de microorganismo.

 

MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS; CONCEPTOS

 

·         Exactitud: parecido entre el resultado obtenido con el real. Puede no ser exacto: daño subletal, viables no formadores de colonia, selectividad del medio y tal, límite de detección del método, especificidad (no determina el que no andamos buscando) sensibilidad (encontremos todos los que buscamos)

 

·         Precisión: se refiere al margen del error y la posibilidad de repetir un resultado. Ésta dependerá del tipo de muestra y de las condiciones, Hay que diferenciar:

 

a.       repetible: misma persona, mismo laboratorio

b.       reproducible: mismo método, diferente persona

 

 

 

                  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 7: CRITERIOS MICROBIOLOGICOS

Se definen como los límites en cuanto a la calidad y cantidad de microorganismos presentes en un alimento. Se relacionan con la presencia de microorganismos o de sus toxinas dentro de un alimento determinado, establecido por el uso de procedimientos definidos y aplicado para los muestreos de aceptación de alimentos ¿ que debe incluir un criterio?

Hay que tener en cuenta:

 

1. el alimento al que se aplicará (tipo, estado, grado de procesamiento)
2. microorganismos o toxinas que preocupan en ese alimento
3. límites microbiológicos adecuados

 

Tipos de criterio:

 

-          normas: son leyes punibles que deben cumplirse

-          especificaciones: acuerdos comerciales no son leyes pero implican, por ejemplo, a los precios del producto en el mercado

-          recomendaciones: se refieren a control interno del proceso, pautas de comportamiento.

 

Nunca olvidar que los criterios microbiológicos no deben sustituir a las buenas prácticas de higiene.

 

PLANES DE MUESTREO POR ATRIBUTO DE DOS CLASES

 

Se llaman de dos clases porque solo hay dos posibilidades:

 

-          muestra aceptable (no contiene patógeno, por ejemplo)

-          aceptable (contiene patógeno)

 

Necesitan una toma de muestra lo más representativa posible. Para un lote en cuestión hay que admitir (tomamos una muestra) que pueden suceder dos cosas:

 

a.       muestra aceptable: no contiene patógenos

b.       muestra defectuosa: contiene

 

Si se trata del lote completo, habrá una probabilidad p de que sea defectuosos, y una probabilidad q, de muestra aceptable. Cogiendo n muestras, la probabilidad de que x sean defectuosas es:

 

 

 

Consideramos x=0 (lo más habitual) y entonces la fórmula resulta p= (1-p)ⁿ

En un lote independientemente de x  cuanto mayor sea n menor el número de lotes que  serían aceptados. Utilizando programas de muestreo cabe la posibilidad de aceptar lotes que contengan, por ejemplo, el patógeno, o bien rechazar lotes buenos. Teniendo en cuenta esto hay que  limitar el número de casos, si queremos que la probabilidad de rechazar un lote defectuoso sea del 95% sustituimos en la fórmula y resulta:

 

P_R = 1 – (1-p)ⁿ => 0.95 = 1 – (1-p)ⁿ

 

El resultado es una gráfica (ver fotocopias para c=0) Todo esto viene a justificar la poca garantía que tiene el análisis de producto final. Para entender mejor todo esto definiremos varios conceptos:

 

n = número que se coge de muestras

c = número de muestras defectuosas que se permiten

m = Nº máximo de microbios permitido para considerar aceptable la muestra

 

PLANES DE MUESTREO POR ATRIBUTOS DE TRES TIPOS

 

Los planes de muestreo de dos atributos están pensados para microorganismos de los que no puede tolerarse su presencia en el alimento, los de tres tipos permiten un margen en el que la cantidad de microorganismos es aceptable. En este caso se consideran tres tipos de muestra:

 

-          aceptable

-          defectuosa

-          provisionalmente aceptable

 

Para lo cual hay que definir otros parámetros propios:

 

 n = número de muestras

m = número de microorganismos para que la muestra se acepte

M = Nº por encima del cual la muestra se considera defectuosa.

c = Nº de muestras que cumplen que m < μ < M (aceptables)

 

El resultado, en este caso, es una gráfica 3D ¿como se fijan n, m, M y c? Se juega con la modificación de los valores de n y c para hacer más severo el muestreo. Para modificar m y M deben considerarse el tipo de microorganismo y  de alimento. Siempre debe cumplirse que M sea menor de la dosis infectiva, ya se trate de patógenos o responsables del deterioro. m se considera como un “ideal” (mínima cantidad de microbios posible) de buenas maneras higiénicas, procesado...

El muestreo de tres tipos se utiliza también para patógenos con dosis permisible (por ejemplo aquella cuya dosis infectiva sea muy alta), para valorar calidad de un alimento, o cuando quiera hacerse recuento de microorganismos.

 

 

 

A la hora de elegir n y c se habla de distintas categorías de  plan de muestreo (ver fotocopias), basadas en:

 

-          microorganismo del que se trate

-          manipulación a la que se somete el alimento

-          población a la que va dirigido (ancianos, niños...

 

Peligrosidad potencial: según dosis infectiva, letalidad, tipo de enfermedad que produce:

 

1.       Riesgo moderado: S.aureus, C.perfringens enfermedades  autolimitantes o leves, dosis infectivas altas

2.       Peligrosos: salmonella, E.coli

3.       Muy peligrosos: C. botulinum, Brucella, se caracterizan por dosis bajas, potencialmente mortales cat 13,14,15

 

En función de las categorías se eligen los valores n y c (severidad del muestreo) que además se clasifican en tres tipos:

 

-          Categorías 1,4,7,10,13: alimentos que se procesan de forma que el riesgo se reduzca

-          Categorías 2,5,8,11,14: condiciones que no modifican la peligrosidad

-          Resto: el procesado potencialmente puede aumentar el riesgo

 

Si se supone que  el alimento irá destinado a bebés, enfermos de VIH o yayos deberá aumentarse su severidad. En la práctica los análisis que comúnmente se hacen son:

 

1. patógenos: salmonella, S.aureus, Listeria monocytogenes
2. indicadores: enterobacterias, coliformes, E.coli

 

Para ver la contaminación global de los alimentos se analiza la cantidad de mesófilos. Importante: los planes no garantizan la seguridad de un alimento, sino que establecen márgenes de confianza y unas buenas prácticas de manipulación y procesado.

 

LIMITACIONES DE LOS PLANES DE MUESTREO

 

-          Coste económico y de personal

-          limitación por la dificultad de obtener muestras representativas de alimentos que no son homogéneos (canales de carne, por ej)

-          pueden aceptarse lotes con niveles no aceptables

-          precisión de resultados

-          suelen ser métodos destructivos para el alimento

-          implican tiempos largos de análisis, por periodos de incubación

 

Hay programas de variables de atributos trabajando con datos experimentales de recuento microbiológico: valores medios y desviación estándar.

 

TEMA 9 – CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS

La conservación de alimentos, desde el punto de vista microbiológico, puede realizarse de tres formas:

 

1. eliminación física de microorganismos ( ultrafiltración)
2. inhibición del desarrollo microbiano: dentro de las técnicas de inhibición del desarrollo hay que hacer más subdivisiones:

 

2.1               agentes físicos: procesos de refrigeración, congelación, deshidratación, envasado en atmósfera modificada, emulsión

2.2               métodos químicos, básicamente adición de conservantes ácidos, nitritos, sulfatos o parabenos

 

3. destrucción de microorganismos

 

3.1               apertización

3.2               otros tratamientos térmicos (pasterización)

3.3               tratamientos no térmicos: irradiación, campos eléctricos, o magnéticos (en estudio)

 

La bioconservación consiste en la presencia de bacterias lácticas, que impiden el desarrollo de otros microorganismos

 

CONGELACIÓN

 

Cuando se disminuye bajo cero la temperatura el agua comienza a congelarse y los microorganismos se desarrollan muy lentamente o no se desarrollan. Se juega con dos factores, temperatura y actividad de agua. Los organismos más xerófilos (soportan valores menores de actividad de agua) son los que se desarrollan a una temperatura más baja (-8ºC). Aunque el objetivo de la congelación no es destruir microorganismos, si es cierto que disminuye su número, sobre todo si es rápida (por el frío). Una disminución de a_w hace aumentar el número de solutos. modifica la presión osmótica y la célula expulsa agua hasta que se destruye. Este efecto es mayor cuando se realiza una congelación lenta que de lugar a cristales de mayor tamaño.

Bacterias Gram+ son más sensibles. Aquellos microorganismos que sobrevivan a –10ºC ya no se inactivan, aunque se detendrá su división celular.

 

ATMÓSFERAS MODIFICADAS

 

Se basan en una inhibición de microorganismos aerobios (pseudomonas) mediante la sustitución de oxígeno pro otros gases: CO₂ (inhibe), N₂ (inerte, pero utilizado para preservar los envases). Hay que tener en cuenta que en algunos alimentos como la carne no puede eliminarse totalmente el O₂ (por la mioglobina)

Existen tres técnicas para conseguir atmósferas modificadas:

 

-          vacío

-          atmósferas modificadas

-          atmósferas controladas: en las que vamos modificando las condiciones, o bien reponiendo CO₂ . Se utilizan en industria y está pensado para cámaras que almacenen, por ejemplo, fruta.

 

Por sí mismas las atmósferas modificadas no son suficientes, sino que suelen acompañarse de refrigeración.

 

ADITIVOS (CONSERVANTES)

 

-          Los más utilizados son ácidos orgánicos (sórbico, benzoico, acético, láctico, propiónico). Todos ellos presentan una inhibición de amplio espectro, la diferencia es que el acético y el láctico no están limitados por la legislación (ya que son “naturales”) mientras el resto tiene un uso restringido.

-          También se utilizan parabenos (derivados del ácido benzoico) son también bactericidas, e incluso a pH neutro

-          Existen también conservantes no ácidos como el nitrito. Ha sido polémico por su capacidad de formación de nitrosaminas (agentes cancerígenos) es el más eficaz inhibidor de clostridium botulinum. Parece ser que inhibe su sistema de obtención de energía (proceso fermentativo) interacciona con una enzima que contiene ferredoxina, (sobre la que actúa), en vez de NADH.

-          Altos porcentajes de alcohol inhiben también

-          en ahumados los compuestos del humo (formaldehído...) tienen en general efecto bacteriostático, e incluso bactericida.

-          Algunas especias (ajo) también tienen compuestos que pueden inhibir el desarrollo de microorganismos.

 

BIOCONSERVACIÓN – EL FÚTURO DE LA MICROBIOLOGÍA

 

La bioconservación se basa en la potencial utilización de unos microorganismos  para inhibir otros. En muchos casos se obtienen ventajas de cara al producto (bacterias lácticas) Se usa como complemento a las técnicas de refrigeración. Las bacterias lácticas pertenecen a especies variadas, aunque tienen características comunes. Su presencia tiene dos consecuencias, principalmente:

 

-          disminución de pH, lo cual inhibe crecimiento bacteria

-          síntesis de bacteriocina: son estructuralmente similares a antibióticos. A la más conocida se le denomina nisina (lactococcus lactis) y va a inhibir preferentemente bacterias Gram +, también se  ha conseguido purificar pediocina (pediococcus) . No son enzimas ni lo producen todas las bacterias lácticas. Su efecto es dependiente del tiempo. Actúan uniéndose a la membrana externa. Se acomplejan y formas poros en la membrana bacteriana, con la consiguiente disipación de protones y pérdida de nutrientes solubles. Las bacterias que la segregan tienen receptores específicos de membrana, que impiden ser afectados. Para conservar un alimento puede añadirse directamente bacterocina, o bien las bacterias que la producen (no olvidar que estas últimas generan además bajada de pH)

 

MÉTODOS PARA DISMINUCIÓN DE POBLACIÓN MICROBIANA

 

Los métodos tradicionales son térmicos; muy eficaces pero con el inconveniente de la alteración del alimento. Por esa razón se está investigando en la actualidad la utilización de tratamientos no térmicos:

 

-          irradiación

-          campos eléctricos o magnéticos

-          altas presiones

 

Ante estos tratamientos, la sensibilidad de los microorganismos:

 

gram- > gram+ > levaduras > mohos > endosporas

 

TRATAMIENTOS TÉRMICOS

 

Métodos térmicos específicamente bactericidas (hay que diferenciar con la congelación, que aunque destruya algunos microorganismos no es su objetivo principal):

 

-          Pasterización (60-80ºC): elimina patógenos no esporulados. Se supone que en los alimentos en los que se utiliza no crecen formadores de esporas. En leche consiste en un tratamiento de 63ºC durante 30 minutos. En general debe venir acompañada de otras medidas, como refrigeración, para los microorganismos a los que no afecta (termodíricos: esporas, bacillus cereus, enterococcus, streptococcus, micrococcus). El caso de pseudomona es especial, si se ha desarrollado antes de la pasterización, las lipasas y proteasas que genera no se inactivan tras ellas (aunque la bacteria sí) y el deterioro asociado va a continuar.  Hay alimentos (cerveza y zumo de frutas) que no están asociados a patógenos, en este caso el tratamiento térmico servirá para inactivar microorganismos del deterioro sistemas enzimáticos.

 

-          Apertización (>100ºC) capaz de inactivar clostridium botullinum, sin embargo no se consigue una esterilidad total. Es un tratamiento térmico, que incluye condiciones anaerobias, suele hacerse sobre productos enlatados. Diferenciamos:

 

a.       pH<4.5: sin problema

b.       pH>4.5: en este rango hay que tener en cuenta al clostridium. Para inactivarlo son necesarios 120ºC durante 2-3 min. Debemos jugar con la presión para poder alcanzar esas temperaturas. A pesar dello habrá microorganismos que no se inactiven: bacilus stearotermophilus, desulfotomaculum nigrificans,  clostridium thermosachorolyticum. Sin embargo ninguno de estos se desarrollan a menos de 40ºC. El concepto de esterilidad comercial se refiere a la imposibilidad de deterioro por estos microorganismos a Tª ambiente, aunque no es esterilidad total (que implicaría ausencia de bichitos)

 

MICROONDAS. CAMPOS ELÉCTRICOS

 

Pueden equipararse a los tratamientos térmicos, ya que lo que afecta a los microorganismos es el calor generado.

 

TRATAMIENTOS NO TÉRMICOS

 

Con estas nuevas técnicas se persigue la no alteración de un producto esterilizado, los más importantes son tres: irradiación (rayos X, gamma), pulsos eléctricos y altas presiones.

 

IRRADIACIÓN

 

los rayos producen rotura de DNA celular, con lo que se evita la reproducción. También se usa como insecticida, y para evitar la germinación de vegetales. La sensibilidad al tratamiento de una bacteria será mayor cuanto mayor sea la cantidad de DNA. Factores:

 

-          los microorganismos serán más sensibles a Tª alta, en presencia de O₂, con mayor [H₂O] o en caldos de cultivo más pobres.

 

Y según la fuerza del  tratamiento tenemos:

 

-          radapertización (>10 KGy) efecto similar a apertización

-          radicidación (3-10 KGy) pasterización

-          radurización (< 5 KGy) evita la germinación y prolonga la vida útil

 

Ventajas: puede aplicarse en alimentos ya envasados, o sensibles a tratamientos térmicos (fresas)

Inconvenientes: virus y esporas resisten, hay además un rechazo por parte del consumidor de los productos que han sido irradiados.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 10 – CURVAS DE SUPERVIVENCIA

CURVAS DE SUPERVIVENCIA

 

En ellas se representa el log N/ tiempo a una temperatura determinada. De esta forma la curva es más o menos una línea recta (cinética de primer orden) El valor D (tiempo de reducción decimal) se obtiene a partir de la curva y se define como el tiempo necesario para que el número de microorganismos sea una décima parte. Sustituyendo tenemos.

 

 

Si al incremento del tiempo le damos el valor de reducción decimal D:

 

 

Si representamos log D/Tª también tendremos una línea recta. A partir della puede obtenerse otro valor Z () que se define como el incremento de que habría que aplicar para disminuir D un orden de magnitud.

 

60 ºC =  30´

60 ºC + Z = 3´

60 ºC – Z = 300´

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 11: ENFERMEDADES MICROBIANAS

 

 

Dentro de las consideradas enfermedades microbianas deben diferenciarse:

 

-          intoxicaciones: producidas por toxinas (importante el nivel de toxina)

-          infecciones: producidas por ingesta de microorganismos

 

INTOXICACIONES

 

Tienen tres tipos:

 

1. envenenamientos por agentes químicos
2. productos biológicos (sean vegetales o animales)
3. microbiológicas (toxinas de alga, micotoxinas o bacterianas)

 

Los más importantes productores de toxinas son C.Botulinum, S.aureus también importante la producción de B.Cereus y C.perfringens. Estos dos últimos además producen infecciones.

 

INFECCIONES

 

Tipos:

 

1. Enterotoxigénicas: se producen toxinas una vez que el microorganismo penetra en el cuerpo. Estas toxinas se excretan bien durante la esporulación, o durante la multiplicación y lisis

 

2. Invasoras: normalmente de mucosa intestinal (salmonella), o bien sistémicas que contaminan otros órganos (hígado [hepatitis]) por medio de torrente sanguíneo o linfático.

 

Los más importantes organismos infecciosos son: Salmonella, Yersinia enterocolítica, E.coli, Shigella, Vibrio Cholerae (cólera), Vibrio parahemolyticus, Brucella, Listeria monocytogenes, C.perfringens, B.cereus y Campylobacter jejuni. Una de las especies de Salmonella (typhi) produce fiebres tifoideas.

 

 

 

En niños el C.Botulinum puede germinar en el intestino. En este caso se considera infectivo y provoca lo que se denomina botulismo infantil.

 

A parte de los microorganismos “tradicionales” se han descubierto en los últimos años nuevos agentes infecciosos: aeromonas, plesiomonas, helycobacter... unidos a enfermedades emergentes. Pero éstas ¿son realmente nuevas o han existido siempre? pues un poco de los dos. Quizá bacterias muy difíciles de cultivar [campylobacter] avance de los estudios epidemiológicos o bien causas del consumidor: aumento de la esperanza de vida, cambio de costumbres alimentarias, uso de drogas (tasios), mayor movilidad entre países (importación de enfermedades)

 

DOSIS INFECTIVA MÍNIMA

 

Se define como la cantidad de microorganismos o de toxinas que hay que ingerir para manifestar la intoxicación, o bien una infección. Son muy variables (Salmonella 10¹-10¹⁰) hasta Vibrio cholerae (10³) o <10 virus Norwalk. Estas dosis depende, fundamentalmente:

 

-          tipo de microorganismo: algunos sufren una adaptación genética que los hace más peligrosos: fabrican NH₄⁺ para evitar el pH del estómago, proteínas de unión específica al epitelio intestinal o bien producen proteínas que favorecen la invasión, tienen mutaciones selectivas o forman plásmidos que puedan conjugarse

-          alimento: tiempo de permanencia en el estómago, grupos protectores de la acción de jugos gástricos

-          tipo de consumidor: niño, viejos, disfunciones gástricas, VIH, microbiota intestinal afectada, procesos de co-infección [salmonella-aeromonas]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

TEMA 12: PATÓGENOS

Los patógenos que vamos a estudiar son los que más veces afectan a humanos por ingesta alimentaria. Se trata de salmonella, escherichia, shigella  y yersinia y tienen características en común. Son bacilares, gram-, no tienen actividad catalasa y pertenecen al grupo de las enterobacterias (aquellas que se analizaban en la galería API) fermentan glucosa.

 

SALMONELLA

 

Tiene como 2300 serotipos conocidos. La clasificación actual considera un única especie S.entérica con siete subespecies. Se asocian al tracto de animales y se diseminan a través de las heces. Hay que distinguir:

 

-          serotipos que producen salmonelosis (gástrica)

-          fiebres tifoideas

 

Actúan dentro de las células del epitelio intestinal liberando una enterotoxina en el citoplasma. Esta toxina aumenta la síntesis de cAMP mediante una modificación covalente de la proteína G; el resultado es una pérdida de líquido y metabolitos al lumen intestinal, de ahí surge la diarrea.

Por otra parte la Salmonella tiphi tiene un antígeno V₁ que produce las fiebres. Casi cualquier alimento puede contener salmonella.

 

SHIGELLA

 

Responsable de la disentería bacilar.. Existen 4 especies, de las cuales la más patógena se llama S. dysenterie y la menos S.sonnei . Es de transmisión exclusivamente humana, medidas relacionadas con la higiene. También es invasiva, entra y se multiplica en el citoplasma. Se invaden células adyacentes. Sintetiza en el lumen intestinal una toxina llamada Shiga (No es una enterotoxina, sino una citotoxina) En los peores casos ésta pasa al torrente sanguíneo. Dentro de la célula  inhibe la síntesis de proteínas al romper ribosomas 26S ARN_R.

 

E. COLI

 

Microorganismo de origen fecal que en principio no es patógeno y se encuentra en el tracto intestinal de todos los mamíferos. Sin embargo se han encontrado determinadas cepas en análisis de heces de procesos diarreicos. Hay cinco cepas consideradas patógenas:

 

-          Enterotoxigénica: se adhiere al epitelio intestinal mediante receptores específicos, pero no se produce invasión. Producen dos tipos de toxinas, una LT (termolábil) y otra ST (termoestable). Las LT se han relacionado con la del cólera en cuanto a secuencia genética y mecanismo de acción. El mecanismo es: alterar el nivel de cAMP y con ello la permeabilidad de la membrana. Modifica la proteína G para que libere GTP constantemente y se mantenga activa la adenilato ciclasa. ST hace algo parecido, pero actuando sobre cGTP.

 

 

 

-          Enteroinvasiva: se parecen a Shigella, tanto que parecen pili y mili. No producen la toxina Shiga, sino una lisis de enterocitos consecuencia de su reproducción. No fermenta lactosa y son inmóviles (el resto de E.coli justo al revés)

 

-          Enteropatogénica: no invaden, pero si producen toxinas. Generan cambios morfológicos en las células epiteliares invadidas, con lo que se altera su funcionalidad.

 

-          Enterohemorrágicas: son idénticas a las enteropatogénicas, pero además producen la toxina shiga. Es la forma más severa de todas las E.coli, produce diarrea con sangre. La toxina puede ir por el torrente sanguíneo a otros órganos diana. No puede detectarse por los indicadores normales de E.coli porque los ensayos se hacen a 44ºC y no se desarrolla. Tampoco tiene glucuronidasa (utilizada como indicativo de presencia de E.coli).

 

-          Enteroagregativas: se acumulan en zonas concretas del epitelio.

 

 

 

YERSINIA

 

No todos sus serotipos son patógenos. Es un psicrótrofo. Relacionado con el consumo de carne de cerdo, la sintomatología de su infección es similar a la apendicitis.

 

CAMPYLOBACTER

 

No es una enterobacteria, sino una gram^- con muchas peculiaridades. Solo se desarrolla con a_w>0.990 (alimentos frescos), pH>5.0, y 30º<Tª<45ºC. Es microaerófilo, poco resistente a congelación, tratamientos térmicos, cambios osmóticos... vaya mierda de bacteria alimentaria no se multiplica dentro del alimento. ¿el truco? sus dosis infectiva es muy baja, y 500 células pueden ya producir enfermedad. Todo esto explica que se produzcan muchos casos de campylobacteriosis pero como casos aislados, apenas se dan brotes.

Tiene una peculiar forma en espiral con flagelo que le facilita atravesar la mucosa intestinal. también atracción quimiobáctica con moléculas de membrana. Aunque no se divida a 4ºC se conserva bien en refrigeración. Suele relacionarse con aves. Se sabe que es invasivo aunque no se conoce del todo su mecanismo de acción, parece que produce alguna toxina.

 

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

 

La infección por C.perfringens es numéricamente muy importante, pero al ser muy leve no aparece en las tablas de morbilidad, además se encuentra en cualquier animal. Es el primer organismo de los que hemos visto que esporula, aunque no sea excesivamente termorresistente. Por sus características de crecimiento es anaerobio, ligeramente más termófilo (45ºC) que los anteriores, la refrigeración impide su desarrollo. Clínicamente es más importante como productor de gangrena que como portador de enfermedades alimentarias. Se distinguen cinco tipos de perfringens, en función de la toxina que produce. Las que producen enterotoxinas

 

S.AUREUS

 

Microorganismo gram positivo, no esporula, es un coco aerobio facultativo. Es de las bacterias más resistente a baja a_w (0.83). Provoca intoxicación, aunque su presencia no implica necesariamente producción de toxina, sobre todo en valores límite de pH y a_w. Las enterotoxinas de S.aureus son muy resistentes a altas temperaturas y pH, con lo que es difícil eliminarlas. En alimentos frescos no puede competir con los deteriorators, con lo que es más fácil encontrarla en alimentos procesados y manipulados. Este organismo se encuentra de manera natural en el 50% de los manipuladores. La intoxicación produce principalmente vómitos, puesto que afecta al nervio vago que controla los movimientos peristálticos. Según el tipo de serotipo forma  varios tipos diferentes de toxina; la A es la primera causa de intoxicación alimentaria, junto con D.

Las enterotoxinas actúan como superantígenos ya que no necesitan receptores específicos, sino que inducen la actividad un tanto inespecífica de otros muchos linfocitos.

 

BACILLUS CEREUS

 

Microorganismo gram⁺, aerobio y formador de esporas. Por infección de B.cereus se describen dos sintomatologías:

 

-          síndrome diarreico = Clostridium perfringens

-          síndrome emético = intoxicación por S.aureus

 

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

 

La intoxicación produce botulismo, enfermedad a menudo letal aunque prácticamente erradicada. Produce lo que se denomina parálisis fláccida. Es una bacteria anaerobia, gram⁺  y formadora de esporas. Se han descrito cuatro grupos de C.botulinum:

 

 

En total entre las cuatro forman siete tipos diferentes de toxinas, las más importantes en humanos A, B y E y en aves C₁,C₂ y D. La toxina se genera en una forma inactiva de 150 kb que se divide más tarde en dos subunidades de 50 y 100 kb. La unidad pequeña es la que produce realmente la intoxicación

 

CONTROL DE COSTRIDIUM BOTULINUM

En caso de clostridium botulinum no está asociado al tracto intestinal (como perfringens) salvo caso de infección:

      -   refrigeración: solo los no proteolíticos (E) pueden desarrollarse a <4ºC

-          pH: alimentos con pH<4.5 son seguros ante clostridium. Hay que tener en cuenta que moho y levadura puede subirlo. Frutas no tienen problemas por ejemplo: tratamiento te´rmico, adicion de sal, también el nitrito es un inhibidor bastante selectivo de C. botulinum

 

 

La toxina de esta bacteria es de las más tóxicas que se conocen: con solo 2 gr pueden matarse a 10⁷ personas. Esto es así porque es una enzima, que se recupera después de su uso. Solo las toxinas C2 no son neurotoxina; sino que actúan como ADP ribosilantes.

 

TIPOS DE TOXINAS

 

1. Exotoxinas:  producidas por microorganismos

 

1. enterotoxina: producen diarreas
2. neurotoxina: tóxina botulínica
3. citotoxinas: tienen un efecto citotóxico (lisis celular) importante en bacterias que tienen un mecanismo invasivo

 

 

2. Endotoxinas: liposacarido de membrana de la bacteria que tienen una cadena de glúcidos (serotipos o antígenos 0) repetitiva y que varía con cada cepa. Otros antígenos son H (flagelares), antígenos v_i (de cápsida)

 

MORBILIDAD

 

Las enfermedades infecciosas son la mayor causa de ingresos en hospital, aunqeu relativamente pocas veces acaba en muerte. Hay que diferenciar entre casos esporádicos o brotes, en los que puede llegarse a relacionar un microorganismo con un alimento, mediante estudios epidemiológicos (salud pública)

 

DECÁLOGO DE BUENAS PRÁCTICAS MICROBIOLÓGICAS

 

1.       elegir alimentos procesados

2.       cocinar de forma intensa

3.       comer inmediatamente los alimentos cocinados

4.       almacenar con cuidado después de cocinados

5.       evitar contactos entre alimentos crudos y cocinados

6.       lavarse las manos con más frecuencia

7.       mantener las superficies de la cocina cuidadosamente limpias

8.       proteger de insectos, mascotas, animales...

9.       cuidar el origen del agua de lavado

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

VIRUS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS

 

CARACTERÍSTICAS

 

1. son metabólicamente inertes y no se multiplican en los alimentos
2. tienen dosis infectivas muy bajas; en torno a 10-100 unidades
3. son específicos de huésped, generalmente son incapaces de infectar a dos especies animales diferentes
4. no son sensibles a antibióticos
5. tienen un tamaño mucho menor que el de bacterias, de forma que solo pueden observarse al microscopio electrónico

 

CLASIFICACIÓN

 

Su clasificación puede hacerse de varias formas:

 

1. por el tipo de huésped: bacteriófagos, infectan células de plantas o animales
2. en virus específicos de humanos pueden clasificarse por su órgano diana ya sea el tracto digestivo (enterovirus), sistema nervioso, hígado etc
3. Según la vía de infección: alimentarios, respiratorios, cutáneos...

 

Sin embargo la clasificación más general va a ser en función de sus propiedades físico químicos:

 

-          material genético: DNA y RNA  bi o monocatenarios

-          envoltura o no (sensibilidad a éter)

-          polaridad positiva o negativa

-          genoma segmentado o no

-          estructura de la cápsida: icosaédrica, helicoidal...

-          tamaño y forma

 

Los más importantes en alimentación van a ser:  picornavirus (hepatitis A, polio), calicivirus (Norwalk) y reovirus

 

ETAPAS DE LA ACCIÓN PATÓGENA DE LOS VIRUS

 

1. Interacción con el epitelio intestinal mediada por receptores específicos. Para llegar hasta allí debe atravesar las defensas naturales del cuerpo:              jugo gástrico, Inmunoglobulina de la mucosa, sales biliares [efectivas si el virus presenta envuelta]

 

2. Penetración en el organismo

 

3. Acción sobre las células

 

1. infecciones productivas
2. infecciones persistentes

 

4. Lesión de los tejidos bien a consecuencia de su ciclo vital, bien a causa de la respuesta inmune del organismo

 

La incidencia de los virus en infecciones alimentarias no es bien conocida porque:

 

-          no crecen en medios tradicionales de cultivo e, incluso, para algunos (calicivirus) no se conocen técnicas para desarrollarlos

-          en los alimentos se encuentran en número bajo, y no se multiplican

 

En ese caso ¿como se diagnostica la infección por virus?

 

-          cuando es posible se aísla el virus en laboratorios especializados

-          examen de heces mediante microscopio electrónico

-          detección de anticuerpos

-          métodos de sondas de ácidos nucleicos como PCR o hibridación

 

Cualquiera de estos métodos es relativamente caro, con lo que no se realiza rutinariamente en control de calidad.

 

ALIMENTOS IMPLICADOS

 

Los alimentos que principalmente se encuentran implicados en infecciones alimentarias víricas son

 

1. mariscos que se alimentan mediante filtración de agua
2. alimentos que sufren de mucha manipulación como los sandwiches de Rodilla, bollos o ensaladas

 

VIRUS DE LA HEPATITIS A

 

Es un picornavirus, virus DNA sin envuelta y con polaridad positiva. EL desarrollo de la hepatitis pasas por varias fases:

 

1. multiplicación en epitelio intestinal
2. acumulación en ganglios linfáticos
3. infección hepática: fiebre, malestar, nauseas, cansancio, etc

 

EPIDEMIOLOGÍA

 

El hombre es el único portador, se contagia por contaminación fecal. Generalmente se lleva a cabo por manipuladores portadores asintomáticos (la enfermedad tiene un mes de incubación). Una vez pasada la enfermedad produce una inmunidad permanente.

Es más frecuente en zonas con pobres condiciones higiénico-sanitarias; al ser endémico la población adulta es inmune, y afecta a jóvenes con síntomas leves e incluso inexistentes. En países desarrollados sin embargo surgen epidemias al no ser la población inmune. Afecta adultos a partir de agua y alimentos contaminados por portadores. Los alimentos más comúnmente implicados son:

 

-          Moluscos bivalvos: ostras, almejas...

-          Hortalizas regadas con aguas residuales o contaminadas

-          Alimentos manipulados por portadores asintomáticos y utensilios

 

CARACTERÍSTICAS

 

Sus características más importantes:

 

-          sobreviven en superficies y son resistentes a la pasteurización normal

-          toleran pH ácido

-          más resistente que bacterias a irradiación

-          resiste cloración del agua

 

PREVENCIÓN

 

Como acabamos de ver los virus son en general más resistentes que las bacterias, es por eso que es importante la prevención para evitar infecciones. Las acciones más eficaces son las habituales higiénico sanitarias y tal:

 

-          inactivación de virus mediante calentamiento y cocinado de alimentos

-          control higiénico de manipuladores, e inmunización por medio de vacuna o gamma globulina (recordar que la inmunidad es permanente)

-          depuración de marisco con agua potable

 

VIRUS NORWALK Y SRSV

 

Son calicivirus, RNA monocatenarios de polaridad positiva. Se transmiten por el agua. Estos virus no han podido ser crecidos en cultivo de tejidos, con lo que el diagnóstico se realiza a partir de microscopía electrónica. Producen gastroenteritis epidémica con un cuadro sintomático compuesto por nauseas, vómitos (efecto aerosol [favorece contaminación cruzada]), en adultos también diarrea y dolor abdominal. El periodo de incubación es más corto que en hepatitis A, aproximadamente 1-2 días y tiene una fase aguda de otros  2. Enfermedad benigna y autolimitante, es la conocida como “diarrea del viajero” A edades jóvenes se desarrolla cierta inmunidad, pero no en adultos. Son muy resistentes a la cloración, pero menos al calor que el virus de Hepatitis. No se conocen vacunas contra este tipo de virus.

 

ROTAVIRUS

 

Reovirus, RNA bicatenario segmentado. Produce enteritis aguda esporádica en lactantes y niños. Tres de los seis tipos conocidos de rotavirus son infectivos.

 

1. es endémico en todo el mundo. Afecta a niños menores de cuatro años que después  permanecen inmunes. Es asintomático en adultos.
2. Afecta a adultos, epidémico
3. infecta a jóvenes esporádicamente

 

Un rotavirus tiene un periodo de incubación de unos 2 días. Los síntomas de la infección son vómitos y diarrea, dolor abdominal y fiebre durante 3-8 días. Se transmite de forma fecal-oral normalmente a través del agua. Las heces producen 10⁸-10⁹ partículas/ml.

 

PRIONES

El término "prion" es usado para describir el agente infeccioso responsable de varias enfermedades neurodegenerativas encontradas en los mamíferos. La palabra en sí deriva de "proteinaceous infectious particle" este agente infeccioso consiste únicamente en una proteína, carente de genoma y ácidos nucleico. Se ha observado esta proteína en las membranas neuronales de los mamíferos sin causar enfermedad alguna, pero se sabe que un cambio conformacional de su estructura terciaria puede provocar la aparición de la enfermedad. En su forma patógena se multiplican exponencialmente al ponerse en contacto con las proteínas normales, ya que les inducen el cambio conformacional que las vuelve infecciosas. La aparición de estos desordenes estructurales en las proteínas, pueden ser transmisibles o heredados. Las enfermedades prion (colectivamente llamadas "encefalopatías espongiformes transmisibles") conocidas hasta ahora son fatales, afectan al sistema nervioso y se cree que también a los músculos. Estas enfermedades pueden incubarse durante años o incluso décadas en humanos. Las enfermedades asociadas con la aparición de prion son:

-          Kuru: afecta solo a humanos, por prácticas caníbales

-          Kreutzfeldt-jakob: enfermedad en principio asociada a ganado vacuno “vacas locas” que ha llegado a infectar también a humanos

Son resistentes a irradiación (carecen de ácidos nucleicos) pero sensibles a proteasas. No producen respuesta inmune y son estables a altas temperaturas, para desactivar un prion hacen falta 130ºC durante 3 horas.