PRODUÇÃO DE BIOFUNGICIDA BACTERIANO EM FERMENTADOR DE
BANCADA
Campos, E¹ ., Alcocer,
I¹.; CESARE VIDAURRE, T. (2);
CASTRO GOMEZ, Raul J. H.(1). 401,
Londrina PR. 1Departamento de Tecnologia de Alimentos, TAM/CCA/UEL.
Londrina PR.
2 Faculdade de Engenharia de
Alimentos, UNIVERSIDADE DO NORTE DO PARANA C.postal E-mail: [email protected]
Resumo
O crescente aumento da
resistência dos fungos fitopatogênicos aos pesticidas químicos tem incentivado
o uso de agentes biológicos para o controle destes fungos. Este trabalho faz
parte do desenvolvimento de fungicida bacteriano, para o controle de doenças de plantas, frutos e grãos causadas
por fungos em pré e pós-colheita e sem
controle efetivo até o momento.
O objetivo
foi estudar a produção de Bacillus
subtilis, antagonista de fitopatôgenos, a nível de fermentador de bancada,
utilizando-se meio de cultura a partir
de resíduos agro-industriais previamente otimizado a nível de agitador
rotativo. O teste foi conduzido com 5
litros de meio de cultura em condições fermentativas determinadas em etapas
anteriores. As condições foram: 30oC,
pH inicial de 7.3 e 10 % (v/v) de inóculo. O meio de cultura foi composto de: Melaço, 0,3% (p/v);
“Corn-steep”, 0,15 % (p/v) e K2HPO4
de 0,2 %. A produção de biomassa
foi realizada em fermentador aeróbico de bancada 5000 mL, marca Marconi, modelo MA-502, com cuba de
vidro com sistema de água termostatizado e sistema de agitação constante
através de motor com rpm controlada e sistema de aeração estéril. O fermentador foi esterilizado com gerador
de vapor a 120oC por 30 minutos, utilizando-se 4.5 litros de meio previamente autoclavados
e inoculado com 500 ml de caldo de cultura de Bacilllus subtilis crescidos por 24 horas em kitassato areado
com (10 L/min) de ar comprimido
estéril. A contagem inicial de células
foi de 1.67 x 107 de ufc /ml.
Durante o processo de fermentação foram avaliados a variação do pH,
carboidratos totais e crescimento do microrganismo por leituras de densidade
ótica (660 nm) assim como as variações do oxigênio dissolvido no meio de
cultura, através das variações da agitação e aeração durante o processo. A
velocidade específica do crescimento do microrganismo foi de 0.51h-1
. Foram realizadas contagens celulares as 48 h de 2.48 x 109 ufc/ml
e após de 72 horas obtendo-se contagens de
1.36 x 1010 ufc/ml.
Este resultados mostram
potencial deste microrganismo para futuros testes de escalonamento do
processo de produção do biofungicida.
Palavras chaves: Biofungicidas, Bacillus subtilis, fitopatôgenos.
1. Introdução
O Brasil é considerado
um dos maiores produtores mundiais de graõs e frutas, tendo na agricultura uma
das mais importantes bases da economia nacional. Contudo alguns problemas
como a falta de infra-estrutura leva à perda
considerável da produção durante
o cultivo, colheita, transporte e armazenagem (ANON, 1993). Assim, os índices de perdas pós-colheita,
atingem a cifra de 10 milhões de toneladas do total de 30 milhões produzidas no
país (Sigrist, 1993). O crescente
aumento da resistência dos fungos fitopatogênicos aos fungicidas
químicos tem elevado o uso destes pesticidas químicos no controle destes
microrganismos, causando prejuízos ao meio ambiente, com aplicações em
intervalos menores com produtos cada vez mais tóxicos e potentes. Isto tem
preocupado os pesquisadores, incentivando-os a investigar novas substâncias de
origem natural (KRETZSCHMAR, 1991; Lange,
1993, Prusky, 1996; Dickson et al., 1995).
A
contaminação fúngica é o principal fator responsável pela doença e deterioração
de grãos no campo e posteriormente, na produção de micotoxinas durante a
armazenagem. Considerando que os cereais constituem a fonte primordial da
alimentação, a contaminação por micotoxinas repercute diretamente tanto na
saúde humana quanto na animal (HIROOKA et al., 1997).
O Bacillus spp.
é uma bactéria esporulada que permite cultivo fácil em grande escala e em meio
simples. Seu potencial inibitório sobre o crescimento de microrganismos
indesejáveis já tem sido comprovado, com diversas aplicações nas áreas
farmacêuticas, alimentícias e agronômicas, inclusive com vários produtos
comercializados com bons resultados (BULLA & HOCH, 1983). Numerosas
pesquisas tem demonstrado o efeito inibitório de substâncias obtidas de Bacillus subtilis no controle de microrganismos
fitopatogênicos, seja bactéria ou fungo (ONO & KIMURA, 1991; Lange, 1993, Prusky, 1996; Dickson et
al., 1995).
Departamento de Tecnologia de Alimentos,
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina.
TAM/CCA/UEL. Brasil. Campus Universitário, Caixa postal 6001. CEP
86051-970. Londrina PR. Fax: 051-43-3714079. E-mail:
cesare@Sercomtel com.br.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Microrganismo
O isolado BS1 de Bacillus
subtilis foi fornecido por Produtos Biológicos y Control de Calidad
(PROBICAL), Cia Ltda, Santiago, Chile. Apresenta efeito antagônico contra os
fitopatogênicos Aspergillus, Botrytis,
Colletotrichum, Penicillium e Sclerotinia
2.2. Condições e Meio de cultura
O meio de cultura foi
composto de: Melaço: 0,3 % (p/v); “Corn-steep”: 0,15 % (p/v) e K2HPO4
de 0,2 % (p/v) segundo Césare Vidaurre et al., 1997. O volume de ar foi
de 10 L/min e a temperatura de 300C, mantidos constantes. Para
ajustar o pH a 7,3 foi utilizado NaOH autoclavado. A freqüência de agitação
(rpm) variou de acordo com o teor de oxigênio dissolvido.
2.3. Fermentador
A produção de biomassa
foi realizada em fermentador aeróbico de bancada 5000 mL, marca Marconi, modelo
MA-502, com cuba de vidro com sistema de água termostatizado e sistema de
agitação constante através de motor com agitação controlada e sistema de
aeração estéril controlado através de rotâmetro, acoplado com potenciômetro
para monitoramento constante do pH, e medidor de oxigênio dissolvido.
2.4. Processamento do inóculo
2.4.1.Ativação do microrganismo: o microrganismo foi
mantido em câmara refrigerada, em tubo com ágar nutriente, sendo ativada
riscando-se uma alçada em placa de ágar nutriente, incubada a 300C por 24 horas
2.4.2. Pré-inóculo: foi preparado através de alçada da cultura
em 100 ml de caldo formulado, em frasco erlenmeyer de 250 ml, mantido em
agitador rotativo a 30OC e 200 rpm por 27 horas
2.4.3.
Inóculo:
a partir do pré-inóculo, foi preparado 500 ml de inóculo para o fermentador,
utilizando-se o mesmo meio de cultura formulado, com a adição de antiespumante.
O processo foi realizado em frasco erlenmeyer de 1000 ml, este frasco munido
com tampa perfurada para passagem de tubos de aeração, respiro e coleta de
amostra; o frasco, juntamente com o meio, foi esterilizado a 1210 C
por 20 min. Após o resfriamento foi semeado com 10% (v/v) de caldo fermentado
obtido conforme o item anterior. O frasco permaneceu a temperatura ambiente por
46 horas, sob aeração constante.
2.5.
Monitoramento dos parâmetros analisados durante a fermentação
2.5.1. Comportamento do pH e oxigênio
dissolvido: foram monitorados mediante o acoplamento respectivamente do
potenciômetro e da sonda de oxigênio dissolvido, verificados em intervalos de 1
hora.
2.5.2. Açucares totais e finais do processo:
estas análises foram realizadas com o método fenol-sulfúrico de DUBOIS (1956).
2.5.3. Determinação do crescimento celular: as
amostras para determinação do crescimento celular foram retiradas em intervalos
de uma hora, e realizadas através de medições de absorbância em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 660 nm, utilizando-se o meio de
cultura como branco. Foi determinada a velocidade específica de crescimento (m) pelo método de Monot, no qual as velocidades
específicas são calculadas ajustando uma relação linear do tempo e crescimento,
na fase logarítmica de crescimento, pelo método dos mínimos quadrados.
Contagem de microrganismos viáveis: número de
células por ml, expressa em log 10 das ufc/ml. Frações da suspensão foram coletadas
em tempo zero (inóculo), após 48 horas, e após 6 dias; diluídas, semeando-se
alíquotas na superfície de meio ágar nutriente, em placas de petri, incubados a
30O C por 24 horas.
2.5.4. Rpm: aumentada de acordo com o decréscimo
de oxigênio dissolvido, inicialmente de 200 rpm a uma potência máxima de 550
rpm.
3.
Resultados
e discussão
Durante o processo de
fermentação foram avaliados a variação do pH, carboidratos totais e crescimento
do microrganismo por leituras de densidade ótica (DO660) assim como
as variações do oxigênio dissolvido no meio de cultura, através das variações
da agitação e aeração durante o processo.
A
condição de aeração testada, com o fornecimento constante de 10 l/min, revela
que o máximo de 75 % de oxigênio dissolvido no meio foi obtido no tempo inicial
do processo de fermentação, como mostra o Gráfico 1. Na fase lag o teor de
oxigênio dissolvido é de aproximadamente 75 %, na fase de crescimento
logaritmico a taxa de oxigênio decresce proporcionalmente ao aumento da D.O.,
chegando a 7 %, por volta da 11ª hora, após esta fase o oxigênio dissolvido
eleva-se a mais de 60 % na 13ª hora de fermentação.
A
velocidade de crescimento é diretamente influenciada pela aeração. O
crescimento microbiano foi favorecido até a 10ª hora, quando então a quantidade
de oxigênio fornecida atuou como fator limitante. O crescimento exponencial foi
interrompido com a queda da concentração de oxigênio dissolvido no meio, que
por sua vez, foi consequência da capacidade da bomba de oxigênio, que não
forneceu oxigênio suficiente para a massa celular do meio. Além da potência
limitada, acredita-se que a utilização de hélices não adequadas ou até, por seu
mal posicionamento, prejudicando a distribuição da aeração, atuou limitando o
crescimento microbiano.
Após
a 11ª hora da fermentação, observa-se um aumento gradativo na concentração de
oxigênio dissolvido no meio, comportamento este relacionado à fase de morte
e lise celulares.
Figura 1: Crescimento do Bacillus subtilis ( O )e comportamento do oxigênio dissolvido (‘) em fermentador de
bancada
A figura 2, mostra o comportamento do pH e
crescimento (D.O660.), observando-se que o pH inicial sofreu pequeno aumento durante as primeiras
horas de desenvolvimento microbiano variando de 7,03 a 7,09. Em decorrência do
metabolismo normal do microrganismo, que produz compostos intermediários
ácidos, como o ácido pirúvico e o
cítrico, o pH sofreu uma queda significativa, observada durante a fase
de crescimento exponencial da bactéria. Após a décima hora de cultivo, os
valores de pH observados foram maiores,
devido à oxidação (consumo) dos ácidos pela maquinaria metabólica microbiana
(BULLA & HOCH, 1983)
Figura 2: Crescimento do Bacillus subtilis (‹) e comportamento do
pH (o) em fermentador de
bancada
A velocidade específica
do crescimento do microrganismo foi de 0.51h-1 . A contagem inicial
de células foi de 1.67 x 107 de ufc /ml. Foram realizadas contagens celulares as 48 h de 2.48 x 109
ufc/ml e após de 72 horas obtendo-se contagens de 1.36 x 1010 ufc/ml.
Este resultados mostram o potencial deste microrganismo para futuros
testes de escalonamento do processo de produção do biofungicida.
4. CONCLUSÃO
O
oxigênio dissolvido foi o fator limitante na produção de biomassa. O
equipamento teve limitações quanto a manutenção do oxigênio dissolvido. Talvez
seja necessário o uso de sistemas computarizados de controle, bem como
redesenhar as turbinas do equipamento e adequar a posição da saída de ar no
fermentador. Com estes ajustes, a fase crescimento poderia ter sido prolongada
gerando melhores condições para o crescimento do microrganismo, obtendo-se,
portanto, maiores rendimentos da fermentação.
5.
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