En 1481, cuando ya se había establecido por su cuenta, los monjes del convento de San Donato de Spoleto le encargaron la Adoración de los Magos, que quedó inacabada; en ella aparecen ya los principales rasgos innovadores de la pintura de Leonardo: los nuevos modelos iconográficos, su forma de distribuir las masas y el uso del sfumato, técnica creada por él y de la que se sirve en casi todas sus obras para crear una realidad plástica más expresiva y poética a base de diluir los contornos y suavizar los colores.

En 1482, al enterarse de que Ludovico el Moro quería levantar una estatua en memoria de su padre, Leonardo da Vinci se trasladó a Milán para ofrecerle sus servicios; obtuvo el encargo, lo cual le proporcionó bienestar material.

Para el duque de Milán realizó trabajos de muy diversa índole (organización de torneos y fiestas, decoración del castillo de los Sforza, etcétera), sin abandonar en ningún momento la pintura, hasta el punto de que a esta etapa de su vida corresponden dos de sus mejores creaciones: La Virgen de las Rocas, donde el magistral empleo de la luz y el sfumato crean esa atmósfera irreal tan característica de su estilo, y La última Cena, fresco que supuso la consagración definitiva de Leonardo da Vinci.

Puede considerarse esta obra como uno de los puntales del arte del Renacimiento por su equilibrio compositivo y la impresión de profundidad que produce en el espectador el paisaje de fondo. La caída del ducado de Milán en 1499 supuso para Leonardo da Vinci el final de una etapa especialmente satisfactoria de su carrera.

Leonardo marchó en primer lugar a Mantua, a la corte de Isabel de Este, después se trasladó a Venecia (1500), a Romaña (1502) y finalmente regresó a Florencia, donde dio muestras de la madurez de su arte en una serie de obras geniales, entre las que destacan La Gioconda y Leda y el cisne. Son obras que definen el arte idealizado de Leonardo a través de los rostros melancólicos y enigmáticos de las figuras, iluminados por una peculiar sonrisa.

Tras el fracaso de sus estudios y planos para desviar el curso del Arno, Leonardo da Vinci volvió de nuevo a Milán, donde realizó una estatua ecuestre para la tumba de Trivulzio (1511-1512). Después marchó a Roma, donde permaneció dos años, y en 1516, por invitación de Francisco I, se trasladó a Francia. Pasó sus últimos años en el castillo de Clos-Lucé, cerca de Amboise, donde se dedicó a sus investigaciones y realizó proyectos arquitectónicos para el rey francés. Ninguno de sus proyectos arquitectónicos ni escultóricos llegó a concretarse, de manera que se conocen tan sólo a través de sus dibujos y croquis.

La personalidad de Leonardo, sin embargo, supera ampliamente sus facetas artísticas. Se le puede considerar como el máximo ejemplo del universalismo renacentista, por cuanto sus intereses abarcaban casi todos los campos del saber. Leonardo da Vinci se adelantó a su época al comprender la importancia de la observación rigurosa para la ciencia; en este sentido, produjo multitud de anotaciones, croquis y comentarios a propósito de los más variados temas, aunque nunca llegó a plasmarlos en un tratado sistemático.

La novedad radical de sus estudios e investigaciones hizo que en buena parte pasaran desapercibidos en su tiempo, al que se adelantó en demasía. Entre sus muchas aportaciones, destacan las efectuadas en el campo de la anatomía, pues estudió la circulación sanguínea y el funcionamiento del ojo; en el de la meteorología, anticipó la influencia de la Luna sobre las mareas y las teorías modernas acerca de la formación de los continentes. Leonardo da Vinci sentó así mismo las bases de la hidráulica, y destacó como inventor: llegó a construir un traje de buzo, y son célebres sus experimentos con máquinas voladoras que, a pesar de su fracaso práctico, adelantaron muchos aspectos de la aerodinámica.