APOPTOSIS

"muerte celular programada" o apoptosis. Normalmente existe un equilibrio entre la reproducción celular y la apoptosis a fin de mantener la población adecuada al momento en que los tejidos han llegado al estado adulto de desarrollo.

La división autosómica es permanente con excepción de algunos grupos celulares, como las neuronas y cardiomiocitos. Durante el desarrollo embriológico, la reproducción celular es mayor que la apoptosis, aunque en ciertos momentos, la segunda predomina cuando deben desaparecer tejidos como las membranas interdigitales, branquias, elementos cloacales, etc. cuya persistencia forman alteraciones congénitas. La división somática produce en forma constante miles de millones de células nuevas y para mantener la homeostasis tisular debe desaparecer alrededor de la mitad de ellas. Así mitosis y apoptosis mantienen el equilibrio celular en los tejidos. Un autor ha señalado en forma muy acertada, que la muerte del organismo humano es una tragedia; pero la muerte permanente de la mitad de sus células es esencial para su existencia.

La apoptosis es un fenómeno biológico fundamental, permanente , dinámico e interactivo. Existen mecanismos pro o anti apoptósicos, regulados genéticamente, que actúan en forma activa (pues consumen energía) y equilibrada. Como función necesaria para evitar la sobreproducción celular era sospechada por los biólogos; pero es un proceso ordenado y "silencioso" que no produce reacción tisular y por ello difícil de captar. Recién en 1972, Kerr y col., estudiando organelos en células neoplásicas, detectaron que muchas células desaparecían en los cultivos. Esto llevó al estudio de imágenes cinemáticas, que mostraron mediante microscopía electrónica las alteraciones que sufre la célula en un proceso que es de corta duración, demorando en tales cultivos menos de una hora.

La apoptosis puede estar frenada, en equilibrio o estimulada.Está estimulada cuando existen células envejecidas, mutadas neoplásicas o no neoplásicas, alteradas por tóxicos y las que están en proceso de metamorfosis o atresia. Se ha estudiado esta condición en neutrófilos envejecidos, en megacariocitos con citoplasma agotado por producción excesiva de plaquetas, en la atresia folicular del ovario, en folículos pilosos en evolución y en la mama durante la involución post-lactancia.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS

Condensación de la cromatina del núcleo y segmentación del núcleo, pérdida de la estructura en orgánulos del citoplasma celular, formación de burbujas en la membrana que finalmente dará lugar a la desintegración celular y a la formación de los cuerpos apoptóticos los cuales a su vez serán fagocitados por los macrófagos, sin pérdida alguna del contenido celular, aún activo, al exterior y evitando así inflamación y daño tisular. Esta es una gran diferencia con la necrosis, la cual es una muerte accidental celular y que implica la liberación del contenido celular de la célula necrótica al tejido con la consiguiente provocación de inflamación y daño tisular.

Dos formas de muerte celular son habituales en el organismo: necrosis y apoptosis. Las características morfológicas de ambas, permiten , en la mayoría de los tejidos establecer claras diferencias.

En la necrosis se observan numerosas células vecinas sometidas a este proceso, cubriendo una extensión variable con desintegración. La destrucción de la membrana celular permite el escape al exterior de elementos tóxicos que provocan un proceso inflamatorio que tendrá efecto nocivo en el organismo, según la extensión del proceso. El material cromatínico sufre una dispersión irregular. Las causas son agentes tóxicos, traumáticos e hipóxicos; siempre patológicos.

En la apoptosis el proceso afecta a determinadas células, no necesariamente contiguas y no a todas en un área tisular. La membrana celular no se destruye, lo que impide el escape al espacio extracelular de su contenido , resultando un proceso "silencioso", sin inflamación. En el citoplasma se produce granulación fina, con conservación de algunos organelos, en especial las mitocondrias que tienen un rol interactivo importante. A nivel nuclear la cromatina se condensa agrupada en varios sectores formando cuerpos apoptósicos. La membrana celular se recoge sobre las eminencias globuliformes que forman los elementos deteriorados del citoplasma y núcleo. Finalmente, fagocitos captan la célula en su totalidad impidiendo en una acción impecable, que se produzca alarma en el resto del tejido. Se ha demostrado, al menos en tejidos epiteliales, que si algo de material apoptósicos escapa a la acción de los fagocitos, es captado por células vecinas. La participación de células vecinas en este proceso se manifiesta además por la capacidad de éstas de enviar señales moleculares a la célula que debe morir, como mecanismo complementario al que desarrolla la célula misma cuando se determina molecularmente su autodestrucción. El proceso de apoptosis demora entre 30 y 60 minutos en células en cultivo. Uno de los más lentos se produce en células hepáticas empleando como promedio 3 horas.

El estudio e identificación específica de cuerpos apoptósicos se ha logrado con tinciones derivadas de la uridina ( aparece en publicaciones en inglés con el nombre de TUNEL en que la U corresponde a uridina). Sin embargo, en algunas células como las neuronas, la uridina tiñe también tejidos necróticos perdiendo la especificidad. En tales casos se recurre a anticuerpos monoclonales capaces de reconocer fragmentos de ADN integrados en los cuerpos apoptósicos. La imagen que da la apoptosis al microscopio electrónico se caracteriza por la presencia de fragmentos de cromatina agrupados en conglomerados globuliformes, la granulación fina del contenido citoplasmático, la persistencia de algunos organelos hasta el final del proceso, como las mitocondrias y la integridad de la membrana celular.

Dado que la apoptosis actúa como oponente a la mitosis, es muy importante su relación con el ciclo celular. En el ciclo celular hay cuatro fases: mitosis, fase de control celular G1, síntesis de ADN y fase de control G2. La apoptosis puede iniciarse en el tercio final de G1 para impedir que una célula dañada ingrese a la fase de síntesis de manera que las mutaciones no se reproduzcan durante la réplica del ADN ingresando así a la especie y en la fase G2 para impedir que las células que no hayan llegado a la madurez entren en mitosis.

Los motores del ciclo celular son complejos proteicos, formados por subunidades llamadas ciclinas y kinasas ciclino dependientes, sintetizados por genes específicos. La síntesis de estos complejos es constante porque son inestables. De ahí que el nivel de ellos varía de acuerdo al momento evolutivo de la fase a que están asignados. Así en el avance de la fase G1 a la de síntesis actúa la ciclina D asociada a las kinasas ciclinodependientes 2, 4 y 6 (cdk 2 4 6). En la segunda mitad del G 1 aumenta la presencia de ciclina E con la kinasa ciclinodependiente 2. En la fase de síntesis actúa la ciclina A con cdk 2 y en la fase G2, la ciclina B con cdk 2. En la fase G1 se han podido determinar dos puntos importantes: G o (en la mitad de la fase) donde el ciclo puede detenerse, la célula bloquea su crecimiento; pero se mantiene metabólicamente activa y un punto de restricción (en unión de los 2/3 con 1/3 final de esta fase) en que se puede detener el ciclo para corregir defectos celulares (en especial de su ADN), lo que si no se consigue induce el mecanismo de muerte celular. En la fase G2 también existen elementos de detección de inmadurez celular que inducen la apoptosis cuando la célula no está capacitada para entrar en mitosis.

De esta manera, durante el ciclo celular se determina cuándo la célula debe entrar en el proceso de autodestrucción o continuar el ciclo y dividirse. Se ejerce así un balance entre mitosis y apoptosis, regulando la población celular de cada tejido.

En el mecanismo molecular que controla la apoptosis actúan varios agentes , de los cuales uno de los más importantes y mejor estudiados es el complejo de cisteino-aspártico proteasas denominadas "caspasas". Se han descrito 10 caspasas en células humanas que provocan una degradación proteica bien definida hasta llegar a la formación de cuerpos apoptósicos. Algunas caspasas son "iniciadoras" y otras "efectoras" del proceso catalítico, actuando sobre endonucleasas que son las responsables directas de la fragmentación del ADN. La cadena de degradación proteica tiene sucesivos clivajes dependientes de la ubicación del ácido aspártico que se repite en la estructura de la enzima. Se han descrito hasta 40 substratos en la catálisis, proceso que en células cultivadas demora entre 30 y 40 minutos. La activación de las caspasas, que existen en calidad de procaspasas inactivas, se produce por diversas vías en que participan varios complejos moleculares.

La vía de "receptores transmembrana" establece conexiones con el espacio extracelular, recibiendo señales proapoptósicas desde el exterior y de las células vecinas. Dos familias de receptores se han identificado con estas características: la " proteína compleja Fas" y el factor de necrosis tumoral TNF (tumor necrosis factor).

La proteína transmembrana Fas en su porción intracelular enlaza con un factor intermedio denominado FADD (factor associated death domain), nombre que sólo señala que está comprometido con la zona de la molécula Fas que participa en la muerte celular, activando las caspasas 8 y 10. En cambio, si la parte interna de la molécula se asocia a otro factor llamado DaXX, se activan proteinoquinasas que conducen al efecto contrario; es decir, estimulan el ciclo celular y la mitosis. Esta vía Fas permanece inactiva hasta que se produce en su parte externa el enlace con un cofactor llamado Fas ligand, proteína que actúa como detonador que enciende la vía, en que solo las caspasas están inactivas y el resto de la cadena está preparado para recibir el enlace exterior. Esta característica permite actuar con gran rapidez sin necesidad de sintetizar otros factores .

Algo similar sucede con el otro "receptor de membrana" TNF. Su porción intracelular conecta con complejos intermedios como el Tradd (TNF receptor associated death domain) y Raidd (receptor associated interleukine death domain) que activan caspasas "iniciadoras" de la apoptosis. Pero si se asocian a otro complejo llamado Traf (TNF receptor associated factor) activan proteinoquinasas y estimulan la proliferación celular; es decir, el efecto contrario.

Las alternativas de una misma vía de actuar en pro o en contra de la apoptosis se repite en otros mecanismos.

Otra vía importante es la vía llamada "ceramida" que es un glucolípido sintetizado en el retículo plasmático y en las mitocondrias, cuya mayor concentración se ubica junto a la porción interna de la membrana plasmática. En el interior de la membrana misma existe otro fosfolípido, la esfingomielina. Se ha podido determinar que agentes externos como la radiación UV, agentes oxidantes y el calor activan la esfingomielinasa ácida, que provoca una reacción aún no bien conocida, sobre la esfingomielina, aumentando la concentración de ceramida. Las vias Fas y TNF también tienen una acción activadora sobre la ceramida. La ceramida actúa sobre las mitocondrias que tienen un doble rol en la apoptosis, como veremos enseguida.

Las mitocondrias, que son el último organelo que desaparece en el proceso de apoptosis, al ser fagocitado con los restos de la célula, ejercen un rol pro y antiapoptósico fundamental.

La ceramida puede ser activada por factores externos a través de receptores de membrana y directamente por glucocorticoides. Además las alteraciones no corregidas del ADN (en especial mutaciones cancerígenas) activan una proteína sintetizada por el gen p 53, que provoca apoptosis a través de la activación de la ceramida.

La ceramida provoca cambios iónicos entre la matriz de la mitocondria y el citosol del citoplasma, que producen un descenso del potencial transmembrana con aumento de la permeabilidad de su membrana interna, permitiendo el escape de citocromo C y de un factor inductor de apoptosis AIF (cuya estructura no se conoce bien), que estimulan a las caspasas 8 y 10 e indirectamente a la 3 y 9, conduciendo a la apoptosis.

El factor frenador de la apoptosis más importante que se conoce hasta hoy es la familia de proteínas sintetizadas por el gen bcl 2 y similares. Es interesante anotar que la familia de proteínas bcl se sintetiza justamente en la membrana de la mitocondria, apareciendo este organelo jugando un rol pro a antiapoptósico, ya que tales proteínas disminuyen la permeabilidad de la membrana hasta bloquear el escape de citocromo C y AIF. El bcl 2 es homólogo del proto-oncogen responsable del linfoma folicular humano.

Los factores proteicos del bcl 2 se producen entre ambas membranas de la mitocondria. Los elementos sintetizados por este gen son: el Bcl 2, el Bcl XL, el Bcl W y el BRAG. De estos, el BCL XL ha sido cristalizado, lo que permite un mejor estudio de su estructura y acción. Estos factores son antiapoptósicos; pero mediante fosforilación originan proteínas con acción proapoptósica y son: el Bax, Bak, Bad, y Bcl x 5, ya que producen una caída del potencial transmembrana favoreciendo la liberación de citocromo c y AIF. Además actúan como activadores de las vías proapoptósicas Fas y TNF y de algunas caspasas. Es otro ejemplo de reguladores pertenecientes a una misma familia de proteínas que actúan como pro o antiapoptósicos.

La apoptósis es una función biológica muy importante en la patogenia de varias enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cáncer, malformaciones, trastornos metabólicos, neuropatías, lesiones miocárdicas y trastornos del sistema inmunitario.

Respecto del cáncer, el factor biológico más importante antineoplásico parece ser la proteína 53 sintetizada por el gen humano p53. Es una fosfoproteína proapoptósica que se activa ente la presencia de mutaciones del ADN, actuando en la fase G1 del ciclo celular. Controla la reparación de lesiones del ADN efectuado por polimerasas específicas, (contribuye a frenar el ciclo en tales circunstancias) y es capaz de detectar células neoplásicas agresivas frenando su capacidad de producir angiogénesis para facilitar las metástasis. La p 53 se agota rápidamente por lo que debe ser sintetizada en forma constante. Su rol es frenar el ciclo destruyendo células mediante la apoptosis antes de llegar a la etapa de síntesis a fin de impedir que se repliquen mutaciones carcinogenéticas, que producirán nuevas cepas tumorales cada vez más agresivas.

Otro aspecto de importancia clínica es la relación entre apoptosis y neuropatías. En el desarrollo del sistema nervioso, las neuronas se generan a partir de células precursoras que una vez diferenciadas no se dividen más. Antes de emitir dendritas y axones, las neuronas inmaduras o las precursoras emigran desde el lugar de nacimiento en busca de la localización definitiva usando como camino el sistema glial. Esta migración tiene, además, como objetivo lograr las conexiones interneuronales correctas. Si ello no se efectúa la neurona no recibe la acción de factores de crecimiento secretados por la célula receptora a que pertenece el axón conectado y la célula que hizo la conexión equivocada muere por apoptosis. Cualitativamente, en estudios realizados en la formación de la vía óptica en la rata, por oligodendrocitos que milienizan axones, mueren por apoptosis alrededor del 50 % de ellos debido a conexiones erróneas. De esta manera contribuye la apoptosis en el desarrollo correcto del sistema nervioso.

Otro hecho de importancia observado recientemente es el rol que juegan la isquemia e hipoxia. En zonas periféricas de infartos cerebrales se han observado células en apoptosis con fragmentación de la cromatina y sobreexpresión de caspasas.

En enfermedades neurodegenerativas se ha observado apoptosis en biopsias de pacientes con Alzheimer, Huntington y Parkinson, fallecidos por otra causa. La apoptosis en la Enfermedad de Alzheimer no es sistematizada, sino difusa, que coincide con el polímorfismo de la lesión. Cotman en 1998 ha detectado que el Alzheimer muestra mayor número de células apoptósicas, especialmente en neuronas del hipocampo. Se ha postulado que estas lesiones puedan deberse a un descontrol genético de la apoptosis. El bloqueo de caspasas para frenar la apoptosis abre nuevos campos terapéuticos en enfermedades neurodegenerativas.

inductores, como la interacción entre el Fas(CD95 o APO-1) y el FasLigando, y se regula mediante los niveles de FasL

[El Fas actúa a través de una cascada de las enzimas caspasas, sistema proteolítico que corta el ADN, e induce principalmente tres tipos de apoptosis*Sobre la eliminación de células T maduras al final de la respuesta inmune. *Muerte de células diana, infectadas por virus o células cancerígenas, mediante los T citotóxicos,y a través de células Natural Killer (NK). *Muerte de células inflamatorias en los lugares de inmunidad]; también la interacción entre el antígeno/alérgeno y el TcR (receptor de la célula T). En este último ejemplo la apoptosis se induce a través del TcR y mediante nur-77, erg-1 y c-myc. Otros inductores son los corticoesteroides que actúan a través de RP-2 y RP-8, y las irradiaciones a bajas dosis de células cancerígenas que actúan a través del p53

*efectores, como el p53, c-myc, nur77, erg-1, ICE (subfamilia de enzima caspasa), RP-2, RP-8.

*inhibidores, como el Bcl-2 que bajoregula la apoptosis mediada por p53 y c-myc; y también el Bcl-XL.

*potenciadores, como el Bax que potencia la apoptosis tras unirse al Bcl-2 y suprimir su efecto inhibidor de la apoptosis; también el Bcl-xs.

La mayoría de genes de estos productos parecen estar envueltos en la regulación de la apoptosis

También la apoptosis puede ser inducida por estímulos fisiológicos como presencia de señales de muerte celular dadas por factores de necrosis tumoral (TNF), neorotransmisores, calcio; o por falta de factores de crecimiento…

FASES DE LA APOPTOSIS

*efectora, adopción sin retorno del compromiso hacia la muerte.

Se caracteriza por el incremento en el contenido intracelular de Ca++ libre debido a un influjo desde el exterior celular o desde el interior de orgánulos celulares (mitocondria, retículo endoplasmático). El incremento de Ca 2++ causa la activación de enzimas presentes endonucleasas y proteasas (caspasas) apoptóticas además de cambios en el citoesqueleto celular produciendo cambios en el tamaño y forma celular. Estas caspasas inactivan proteínas que protegen las células vivas de la apoptosis como es Bcl-2 y cortan moléculas como la actina, la laminina nuclear, la proteina Kinasa C y polimerasas. El incremento de Ca++ libre y de proteína Bax, permeabilizará la membrana de la mitocondria perdiéndose el potencial de transmembrana mitocondrial. Ello lleva a más liberación de Ca++ desde la mitocondria y a un desarreglo en la síntesis de ATP y a la generación de aniones de superóxido oxidando el ADN. La membrana permeabilizada de la mitocondria permitirá una entrada de agua a su interior y a la ruptura con liberación de citocromo C y de proteínas (como el factor inductor de apoptosis, AIF) todos ellos activadores de las caspasas.

También se activan algunos genes como el c-myc, el p53, el gen de la familia Bcl-2, clase de protooncogen. El c-myc es un protooncogen que en condiciones normales codifica un factor de transcripción (proteína c-Myc) y promueve la proliferación celular. Pero a falta de factores de crecimiento, c-Myc induce apoptosis. En la familia del Bcl-2 se puede encontrar miembros pro-vida: Bcl-2 y Bcl-x, y miembros pro-muerte: Bax y Bad. En ausencia de apoptosis está incrementado el Bcl-2 y en apoptosis está incrementado el Bax. El p53 es un oncosupresor. En las células que presentan un daño en el ADN, el p53 para el ciclo celular en fase G1/S lo cual permite la reparación de ese ADN. Si ese daño no puede ser reparado, p53 conduce a la célula a la apoptosis.

*degradativa, degradación de ácidos nucleicos, corte de proteínas, cambios en la membrana celular. Los cuerpos apoptóticos serán engullidos por los macrófagos vecinos impidiendo así la liberación del contenido celular al exterior y evitando inflamación y daño tisular. En esta fase se activan las endonucleadsas que cortan el ADN en fragmentos de unos 180 pares de bases, y también las transaglutaminasas. Además se reorganiza el citoesqueleto perdiendo las estructuras microtubulares, y se condensa la cromatina.

*limpieza, los macrófagos eliminan todas las células apoptóticas sin especiales cambios en el resto del tejido, atraídos por ligandos específicos para ellos y que están presenteçs en la superficie de las células apoptóticas con el fin de aumentar su eficacia.

Genes Bcl- 2 y Bcl- X en la regulación de la apoptosis

 El gen Bc1- 2 fue identificado por primera vez en un linfoma de celarlas B- 2, motivo al que debe su denominacion . Este gen presenta una expresion anormal en el 85% de los linfomas foliculares de celarlas B y en un 20% de los linfomas difusos. En estos tumores se produce una translocación cromosomica t(I4:18) que sitúa a Bc1- 2 en la misma orientación de transcripcion que el locus de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (Ig), lo que provoca la disregulacion de Bc1- 2. El gen se compone de 3 axones, de los que el primero no se traduce, y se puede producir una serie de ARN- m de tamaños heterogeneos. La proteína Bc1- 2 es una molecula integral de membrana de 26 kD que ha sido localizada en la membrana externa de las mitocondrias, el retículo endoplasmico liso y la envoltura perinuclear.

A diferencia de la mayoría de los oncogenes descritos previamente, Bc1- 2 se caracteriza funcionalmente por inhibir la muerte celular programada y no por estimular la proliferacion celular. Bc1- 2 es capaz de inhibir la apoptosis inducida por glucocorticoides, irradiacion con rayos y, deprivacion de factores de crecimiento o la muerte asociada a procesos de diferenciación celular. Sin embargo, no puede afirmarse que este efecto sea generalizado, dado que Bc1- 2 no inhibe la muerte de ciertas líneas celulares tras deprivación de determinados factores de crecimiento o mediante activación a través de ciertos receptores. Estudios de mutagénesis dirigida en el gen Bc1- 2 indican que su función inhibitoria de apoptosis, así como su capacidad de interaccionar con otras proteínas, se encuentra localizada principalmente en dos dominios, conocidos como BH1 y BH2 . Además, BH1 y BH2 son dos dominios altamente conservados que definen toda una familia de genes relacionados con Bc1- 2.

La distribución tisular de Bc1- 2 es amplia. Mediante tecnicas inmunohistoquímicas, se ha detectado su expresion en organos linfoides y hemopoyéticos, tiroides, próstata, intestino delgado, páncreas, sistema nervioso y riñón. En los embriones se ha observado que la distribucion de Bc1- 2 es más amplia que en los adultos, lo que le confiere un papel no sólo en la homeostasis tisular sino tambien en los procesos de morfogenesis.

Tabla 1. Genes de la famlia de Bcl- 2. Efeclo regulador de los fenómenos apoptóticos

Curiosamente, el patrón de expresión tisular de Bcl- 2 está restringido principalmente a los tejidos que se caracterizan por requerir supervivencia a largo plazo. Sin embargo, su expresión en las neuronas del sistema nervioso central es baja y no se observa en otras células con una supervivencia larga, como las celarlas musculares o los hepatocitos, indicando la existencia de otros genes capaces de realizar funciones similares en diferentes tejidos. En este senddo, se han aislado multiples genes relacionados estructural y/o funcionalmente con Bcl- 2. Esta familia de genes conocida como .familia de Bc1- 2. comprende hasta el momento actual los siguientes genes: Bcl- X, mcl- 1 , bax , A1/bfl- 1, bak ,bad y bik. La función de estos genes es en ocasiones contradictoria desde el punto de vista de la protección frente a la apoptosis (tabla 1).

Bcl- X presenta una homología del 56% con el gen Bcl- 2. En humanos se han descrito dos transcritos diferentes de este gen, producidos por corte y empalme (splicing altemativo del ARN- m, que se han denominado Bcl- X largo (Bcl- X,) y Bcl- X corto (BclXs). Esta última fomma carece de los dominios funcionales BH1 y BH2 presentes en Bc1- 2 y BCI- Xl. Al igual que Bc1- 2, BCI- Xl funciona como elemento inhibidor de la apoptosis cuando se eliminan del medio factores de crecimiento necesarios para el mantenimiento de la supervivencia de las celarlas y presenta una localización intracelular superponible a la descrita para Bc1- 2. Por el contrario, Bcl- Xs antagoniza el efecto inhibitorio de la apoptosis de Bcl- XL y Bc1- 2. En los ratones se ha descrito otra variante de Bcl- X que no posee el extremo carboxilo de anclaje a la membrana. Esta fomma, denominada Bcl- X , también actúa como inhibidor de la muerte celular.

Durante el desarrollo embrionario Bcl- Xl se expresa en la mayoría de los órganos, siendo esta expresión más percepdble en el cerebro y los riñones. En los adultos, Bcl- Xl se expresa en multiples órganos, tales como el sistema nervioso (especialmente en las neuronas sensoriales y ganglionares), linfocitos activados y células plasmáticas en ganglios linfáticos, células precursoras de la médula ósea, tejidos reproductores y una gran variedad de celarlas epiteliales. Estudios de inmunohistoquímica y <<Western blot >> en humanos indican que Bcl- Xl presenta un patrón de expresión tisular diferente al de Bc1- 2. En el timo, por ejemplo, Bcl- Xl se expresa predominantemente en la corteza, mientras que Bc1- 2 se expresa más en la región medular. Hasta el momento, no existen datos concluyentes sobre la expresión de Bcl- Xs tanto en humanos como en ratones.

Los mecanismos por los que Bc1- 2 y Bcl- Xl inhiben la muerte celular no han sido todavia esclarecidos. Sin embargo, el hecho de que ambas proteinas presenten una gran homologia, fundamentalmente en los dominios funcionales BH1 y BH2, y de que presenten una localización intracelular superponible, permite sugerir que los mecanismos por los que inhiben la apoptosis son idénticos. Estudios previos han demostrado cómo las células anucleadas pueden sufrir apoptosis, indicando que tales procedentes del citoplasma son indispensables para iniciar el programa de muerte celular. En este sentido, recientemente se ha demostrado que en las células en apoptosis, antes incluso de que comiencen a aparecer cambios a nivel nuclear, se observan,poros en la membrana mitocondrial, responsables de la reducción de su potencial transmembranal. Este fenómeno se ha analizado más en profundidad in vitro empleando agentes quimicos como el atractilósido (Atr) o el terbutil- hidroxiperóxido (ter BHP), que producen poros en las mitocondrias. La formación de estos poros en las mitocondrias coincide con la aparición de fenómenos apoptóticos en el núcleo, que pueden prevenirse utilizando fármacos que inhiben la formación de tales poros. El hecho de que Bc1- 2 se localice en la membrana mitocondrial, y que, además, sea capaz de inhibir la apoptosis inducida por Atr y ter- BHP, ha hecho pensar que la función antiapoptótica de Bc1- 2 podria relacionarse con el mantenimiento de la integridad de la membrana mitocondrial y, en un sentido más amplio, con la regulación de los procesos de tráfico intracelular. En este sentido, cabe destacar que la cooperaci6n de Bc1- 2 con c- myc inhibe la translocación de p53 desde el citoplasma al nucleo durante la fase GO/G1 del ciclo celular, periodo en el que la célula es suscepdble a la inducción de apoptosis dependiente de p53. Muy recientemente, se ha descrito que la liberación de citocromo C (componente de la cadena respiratoria mitocondrial) desde el espacio intermembranoso de la mitocondria al citosol es un fenómeno necesario para que se inicie la cadena apoptótica. Se ha sugerido que los genes de la familia de Bc1- 2 podrian regular los fenómenos de apoptosis inhibiendo el tráfico de citocromo C. Además de la posible implicación de Bc1- 2 en la regulación de los procesos de tráfico intracelular, se ha observado que esta proteina inhibe la activación de proteasas de la familia ICE/ced- 3, que constituyen uno de los elementos más distales en la via inductora de apoptosis. Finalmente, también se ha postulado que Bc1- 2 podria estar involucrado en el control de la producción de radicales libres de oxígeno .

Figura 1. Durante la diferenciación de los linfocitos B, éstos son susceptibles de entrar en un programa de muerte celular apoptótica en múltiplesestadios. En los estadios más tempranos, las células pro- B que no reordenen correctamente los genes de las Ig, así como las células B inmad arras quereconozcan Ag propios, sufrirán apoptosis. Postenormente, las células B maduras están expuestas a un nuevo proceso de selección tras el encarentro con el Ag en los órganos linfoides secundanos.

Apoptosis durante el desarrollo de los linfocitos

 El sistema inmunitario debe cumplir dos misiones fundamentales: asegurar una respuesta eficaz frente a cualquier agente externo y prevenir la reaccion frente a los componentes propios. Ambas funciones se basan en la existencia de elementos celulares, los linfocitos T y B, que disponen de receptores de membrana antigenospecíficos. La generacion de diversidad antigenica en el repertorio de estas células se logra mediante la recombinación al azar de los genes que codifican las regiones variables de las Ig y del TCR. Este proceso tiene lugar durante los períodos mas tempranos del desarrollo linfoide, en los estadios de células pro- B (fig. 1) y CD4- CD8- (fig. 2). A este nivel acontecen los primeros fenomenos de apoptosis en aquellas células que no logran culminar con exito la recombinacion genetica de las regiones variables de las Ig o del TCR. Los fenomenos de recombinacion genetica pueden dar lugar a mas de 10^9 regiones variables distintas en las Ig o incluso hasta 10^11 en el TCR. Adicionalmente, los genes reordenados de las regiones variables de las Ig sufren mutaciones puntuales somáticas tras el encuentro de la célula B madura con el antígeno (Ag) [54]. Este proceso multiplica la variabilidad de las Ig por un factor de 10^3- 10^4 .

El gran inconveniente de esta amplia gama de receptores antigenicos es que una elevada proporcion de linfocitos va a ser capaz de reconocer estructuras propias y, por lo tanto, de generar autorreactividad. En condiciones normales, estas celarlas sufren apoptosis cuando interaccionan con auto- Ag. Este fenomeno, conocido como seleccion negativa, tiene lugar sobre todo en etapas tempranas de la maduración de los linfocitos B y T (figs. 1 y 2). Los linfocitos T sufren un proceso de selección adicional en el timo. Este mecanismo, conocido como seleccion positiva, consiste en que solo recibirán una señal positiva de maduracion los timocitos cuyo receptor TCR sea capaz de interaccionar con las moléculas MHC de las células del estroma tímico (fig. 2).

+Figura 2. Configuración del repertorio de linfocitos Ten el timo. El reordenamiento de los genes del TCR tiene lugar en los precursores de células T CD4- CD8- . Las células que completan correctamente el reordenamiento se exponen a los procesos de selección positiva y negativa. El primero consiste en la eliminación de aquellos timocitos que no reconozcan las moléculas MHC propias, mientras que en el segundo son eliminadas aquellas células que, además de reconocer moléculas MHC propias, reaccionen frente a los Ag existentes en el timo (auto- Ag). Las abrevlaturas <<hi>> y <<lo>> que aparecen en lafigura se refieren, respectivamente, a expresión alta o baja de la molécula en cuestión.

El sistema inmunitario gasta la mayor parte de su energía en estos procesos de selección, de tal forma que más de un 90% de los linfocitos inmaduros (celulas T CD4+CD8+TCR low y células B IgM+IgD- ) mueren por apoptosis antes de convertirse en células maduras. Las celulas que sobreviven van a emigrar a la periferia, donde podran iniciar una segunda fase de diferenciación funcional dependiente del encuentro con el Ag.

Las células B maduras están sujetas a un nuevo proceso de selección en los órganos linfoides secundarios como consecuencia del encuentro con el Ag (fig. 1). Cuando estas células B reconocen al Ag y reciben las señales coestimuladoras adecuadas se activan y pasan a formar parte de los centros germinales. Allí, los linfocitos B entran en fase de proliferación, en cuyo proceso son altamente susceptibles de experimentar mutaciones puntuales al azar en los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de sus Ig. El objetivo de este proceso es incrementar la afinidad por el Ag primitivo. El destino posterior de estas células B va a estar en función de la nueva afinidad por el Ag primitivo tras el proceso de mutación: las células con gran avidez por el Ag sobreviven y se expenden, mientras que las de baja afinidad sufren apoptosis. En esta selección positiva son esenciales las células dendríticas foliculares, que van a presentar el Ag a la célula B estimulada. Además de encontrarse de nuevo con el Ag, las células B van a establecer una interacción clave para el rescate de la apoptosis: la unión del CD40 con su ligando (CD40L) en la célula dendrítica (fig. 1). Las células cuya afinidad por el Ag disminuye no reciben la señal accesoria a través del CD40 y mueren.

Estos fenómenos de hipermutación somática pueden convertir en autorreactivos a algunos linfocitos B que no lo eran antes del encuentro con el Ag. Estas células, potencialmente dañinas para el organismo, pueden ser neutralizadas por dos mecanismos. Por un lado, pueden sufrir la selección negativa anteriormente señalada, como consecuencia de su perdida de afinidad por el Ag primitivo [68]. Por otro lado, pueden entrar en un estado de anergia si reconocen el auto- Ag para el que se acaban de hacer específicas, pero no reciben señales accesorias de linfocitos T cooperadores específicos para el mismo auto- Ag. Si las células autorreactivas superan estos procesos de inactivación podrían ocasionar una enfermedad autoinmune, como se comenta mas adelante.

Las células que reconocen auto- Ag no son las únicas expuestas a sufrir apoptosis. Los linfocitos B y T que reconocen un Ag extraño y reciben las señales coestimuladoras adecuadas experimentan un proceso de activación. Esta activación puede tener como resultado la proliferación y posterior diferenciación del linfocito hacia célula efectora. Algunas células no completan

so de diferenciación y permanecen en un estadio intermedio, subsidiario a experimentar una futura activación ante un nuevo contacto con el Ag, denominado linfocito B o T memoria [62- 64]. Estos linfocitos van a tener una vida media muy larga (del orden de meses o de años) y son los responsables de que la respuesta ante un segundo contacto con el Ag sea mas rápida y de mayor intensidad (respuesta secundaria). Los que completan el proceso de diferenciación van a convertirse en células efectoras: célula plasmática, linfocito T- citolítico o T- cooperador. Sin embargo, el sistema inmunitario debe ejercer un estrecho control sobre estas células, cuyo número se ha multiplicado de forma considerable tras el encuentro con el Ag. La potente actividad biológica de estas células puede representar un grave peligro para la integridad del organismo, en el caso de que permaneciesen activadas de forma indefinida. En este sentido, se ha descrito una forma de muerte celular, denominada <<apoptosis inducida por activación>>, en la que están implicados la molecula Fas y su ligando (Fas- L) [70- 72].

Las células activadas expresan en su membrana concentraciones altas de ambas moléculas, y se establecen interacciones Fas/Fas- L bidireccionales, mediante las cuales las celarlas activadas se aniquilan entre sí. Estas moléculas no tienen ninguna relación estructural con la familia de Bc1- 2.

Finalmente, la mayoría de los linfocitos no llega a reconocer ningún Ag a lo largo de su existencia. Estas células no activadas sufren apoptosis a las pocas semanas de vida. En este caso la muerte celular no parece depender de Fas, y se desconocen en la actualidad los mecanismos moleculares implicados [73].

En definitiva, la apoptosis durante el desarrollo linfoide tiene por objetivo eliminar los linfocitos defectuosos o autorreactivos, en las fases tempranas, y los linfocitos innecesarios o potencialmente dañinos en las fases mas avanzadas.

Regulación de Bcl- 2 y Bcl- X durante el desarrollo linfoide

 Los procesos de muerte y supervivencia celular durante el desarrollo linfocitario deben estar sujetos a un minucioso control, en el que cabe creer que Bc1- 2 y Bcl- Xl pudieran actuar como proteínas inhibidoras de la apoptosis a múltiples niveles. Esta posibilidad se ha analizado durante el desarrollo de los linfocitos B y T utilizando técnicas de <<Western blot>> y citometría de flujo. Con estas técnicas se ha caracterizado la expresión de Bc1- 2 y Bcl- Xl en los diferentes estadios de diferenciación linfocitaria, correlacionandola con la aparición o ausencia de fenómenos apoptóticos. Además, empleando animales que hiperexpresan (transgenicos) o que son deficientes (knockout) en estos genes, se ha evaluado in vivo su influencia en tales procesos de diferenciación. A continuación se describen las conclusiones mas destacadas de estos estudios.

El análisis de la expresión de Bc1- 2 y Bcl- Xl en el timo o en la medula ósea indica que estas proteínas se regulan de forma distinta durante la diferenciación linfocitaria (fig. 3). Bc1- 2 se expresa en los estadios mas primitivos de diferenciación, las células pro- B y los timocitos CD4- CD8- , así como en linfocitos B y T maduros [74- 77]. Por el contrario, Bcl- Xl se expresa en los estadios de celarla pre- B y timocitos T CD4+CD8+TCRlow [78- 80], así como tras la activación de células T y B maduras [78,81,82]. Cabe destacar que Bc1- 2 y/o Bcl- Xl son prácticamente indetectables en dos estadios de la diferenciación en donde son especialmente frecuentes los procesos de apoptosis: a) la transición de célula pro- B a pre- B o de timocito CD4- CD8- a CD4+CD8+TCRlow, períodos en los que tienen lugar los reordenamientos en los genes de las Ig y del TCR, respectivamente, y b) en linfocitos inmaduros B/IgM+IgD- y T/CD4+CD8+TCRlow, estadios ambos en los que ocurren los procesos de selección negativa tras reconocimiento de auto- Ag[74- 80].

Figura 3. Regulación de la expresión de Bc1- 2y Bcl- X a lo largo del desarrollo de los linfocitos T (A) y de los linfocitos B (B). Se aprecia cómo ambas proteinas se regulan de manera reciproca durante el desarrollo de las céIulas linfoides. Como se comenta en el texto, las dos proteínas podrían desempeñar papeles diferentes y complementarios en los procesos de selección y homeostasis linfoide.

 Los resultados descritos anteriormente son muy esclarecedores del papel que estas dos proteínas pueden desempeñar en la regulación de la muerte celular programada en las células linfoides. En primer lugar, se observa que, con la excepción de los linfocitos B inmaduros IgM+IgD- , todas las poblaciones linfocitarias analizadas expresan concentraciones elevadas de alguna de estas proteínas inhibidoras de la apoptosis. Esto indica que se requiere una mínima actividad protectora de la muerte celular para permitir una linfopoyesis adecuada. De hecho, la hiperexpresión de Bc1- 2 o Bcl- Xl en linajes T y B provoca un aumento significativo en todas las poblaciones linfoides, aunque en mayor grado en linfocitos T o B maduros [83- 89]. Esta hipótesis se ha visto confirmada tras el estudio de ratones deficientes en Bcl- X, donde se observa una disminución selectiva en el número de células pre- B y CD4+CD8+TCRlow [90], y en animales deficientes en Bcl- 2, en los que el sistema inmunitario prácticamente desaparece en las primeras semanas de vida [91- 94].

En segundo lugar, se observan concentraciones muy bajas o indetectables de Bcl- 2 y Bcl- Xl en poblaciones celulares que experimentan reordenamientos en los genes que codifican para las regiones variables de las Ig o del TCR. En estas células, los fenómenos de apoptosis son muy abundantes como consecuencia de la elevada tasa de reordenamientos inadecuados. De hecho, se ha observado recientemente que animales transgénicos que hiperexpresan Bcl- Xl en el linaje B presentan un aumento significativo en el número de células pro- B con reordenamientos inadecuados de las cadenas pasadas de las Ig. No obstante, estas células defectuosas son incapaces de continuar su proceso de maduración y acaban siendo eliminadas [95]. Esto indica, o al menos sugiere, que en los precursores de linfocitos B y T las concentraciones de Bcl- 2 y Bcl- Xl sólo regulan la susceptibilidad a la muerte celular de un determinado clon, pero no intervienen en su diferenciación.

La situación contraria a la previamente descrita ocurre en linfocitos T y B activados. En condiciones basales, las células T y B maduras presentan concentraciones elevadas de Bcl- 2, pero no expresan Bcl- Xl. Tras la activación de las células T, vía TCR o CD28, o de las células B, vía IgM de superficie o CD40, las concentraciones endógenas de Bcl- Xl aumentan considerablemente, sin que se modifiquen las de Bcl- 2 [78,81,82]. Sin embargo, las concentraciones elevadas de Bcl- Xl no se mantienen indefinidamente y retornan a su estado basal en el curso de la activación [78,81,82]. Múltiples estudios han demostrado que la activación linfocitaria, al mismo tiempo que promueve la proliferación celular, induce apoptosis. Como se señaló en el apartado anterior, este fenómeno es crucial para limitar la duración y la intensidad de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, cabe especular que la presencia de Bcl- 2 y Bcl- Xl durante al menos las primeras fases de la activación linfocitaria es fundamental para permitir la proliferación celular y la diferenciación ulterior a linfocito T o B memoria. En este sentido, se ha demostrado que la hiperexpresión conjunta de Bcl- 2 y Bcl- Xl en los linfocitos B inhibe la aparición de apoptosis secundaria a la activación celular in vivo [78]. Así mismo, la hiperexpresión de Bcl- 2 incrementa la formación de linfocitos B memoria [95].

Modificación de los patrones de apoptosis y su relación con el desarrollo de autoinmunidad

Como se ha expuesto previamente, durante el desarrollo de los linfocitos los fenómenos de selección deben guardar un equilibrio taI que, conservando el máximo de efectivos para no menoscabar la resistencia del organismo frente al microentorno, se evite cualquier riesgo de reacción autoinmune [96]. No obstante, en algunas ocasiones este equilibrio se rompe en uno u otro sentido originando alteraciones patoIógicas. Así, uno de los factores a los que se ha atribuido un papel patogénico en autoinmunidad es la alteración en los procesos de muerte apoptótica [97]. Un ejemplo de ello son las manifestaciones autoinmunes asociadas a dos defectos genéticos, las alteraciones Ipry gld, descritas en modelos experimentales murinos [98,99]. Recientemente, se ha demostrado que la mutación Ipr consiste en un defecto en la expresión del Ag Fas, proteína traductora de señales de apoptosis1 , mientras que gld se ha caracterizado como una mutación puntual en el ligando de Fas [101]. Estas asociaciones clínicas y experimentales entre modificaciones en la apoptosis y autoinmunidad han dado pie a varios estudios tratando de implicar otros genes relacionados con la muerte celular, como Bcl- 2. Sin embargo, hasta la fecha ningún estudio ha demostrado datos consistentes de alteraciones en los patrones de expresión de estos genes en los pacientes con enfermedades autoinmunes. A pesar de ello el empleo de modelos experimentales, en los que se induce una expresión aumentada y/o mantenida de Bcl- 2 o Bcl- X, puede resultar una herramienta útil para analizar si la alteración de la muerte celular de los linfocitos puede influir en la eliminación de células autorreactivas y en la producción de reacciones autoinmunes.

Estos modelos han consistido básicamente en la construcción de ratones transgénicos de Bcl- 2 y Bcl- X, en los que el transgén se expresa selectivamente en linfocitos B o T, y en la transfección de líneas celulares con estos genes. Respecto a la influencia que la hiperexpresión de estas proteínas inhibidoras de apoptosis pudiera tener sobre la selección negativa de linfocitos B o T, los resultados son contradictorios. Por un lado, la hiperexpresión tanto de Bcl- 2 como de Bcl- Xl no evita la deleción de linfocitos T específicos para ciertos super- Ag propios. Así mismo, en un modelo in vitro con una línea de linfoma de células B inmaduras (células WEHI- 231), la hiperexpresión de Bcl- 2 no fue capaz de proteger a estas células de la muerte por entrecruzamiento de la IgM de superficie. Sin embargo, utilizando otra línea de linfoma B inmaduro, CH31, Bcl- 2 protegió parcialmente de la apoptosis inducida por un anticuerpo (Ac) anti- IgM. En experimentos in vivo, Hartley et al demostraron que la hiperexpresión de Bcl- 2 previene la eliminación de las células B autorreactivas en la médula ósea. No obstante, las células autorreactivas rescatadas de la selección negativa permanecían en estado inmaduro y terminaban muriendo. Por último, otros experimentos han demostrado que Bcl- 2 y Bcl- Xl son capaces de inhibir en los órganos linfoides periféricos la deleción de linfocitos T y B autorreactivos.

Las discordancias observadas entre los estudios previamente descritos podrían atribuirse a diferencias en la afinidad entre el receptor linfocitario y el autoAg. En este sentido, se ha demostrado que células WEHI- 231 transfectadas con Bcl- Xl sufren apoptosis tras incubación con un Ac anti- IgM de alta afinidad, pero sobreviven si el Ac anti- IgM es de afinidad intermedia o baja. Por otro lado, la apoptosis inducida con Ac anti- IgM puede ser regulada por el nivel de expresión del transgén en las células B, tanto en el caso de Bcl- 2 (Merino y Núñez, observaciones no publicadas) como de Bcl- Xl.

La persistencia de linfocitos autorreactivos, por modificación de sus patrones de muerte celular, debería repercutir en la producción de manifestaciones clínicas autoinmunes. En efecto, la hiperexpresión de un transgén de Bcl- 2 en linfocitos B provoca una enfermedad lupus- like en ratones de la estirpe SJL, caracterizada por producción de diversos Auto- At y glomerulonefritis. Sin embargo, en otros ratones transgénicos de Bcl- 2 o Bcl- Xl, construidos en estirpes de base genética diferente, no se han reproducido estas observaciones patológicas. El hecho de que en la estirpe SJL se hayan descrito rasgos genéticos asociados a autoinmunidad indica que, por sí sola, la alteración de los mecanismos de apoptosis no provoca manifestaciones autoinmunes, requiriendo para ello la intervención de otros factores genéticos y/o ambientales.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es el prototipo de enfermedad autoinmune mediada por aflto- Ac, la mayoría de los cuales van dirigidos contra componentes celulares no organospecíficos. Existe un acuerdo general en considerar la activación de las células B autorreactivas de los pacientes con lupus como un fenómeno dependiente de los linfocitos T. A este respecto, se está concediendo cada día más relevancia al subtipo funcional Th2. Sin embargo, aún quedan numerosas incógnitas por desvelar en la colaboración T/B responsable de la producción de aflto- Ac en estos pacientes. Como se ha mencionado previamente, en los últimos años se ha observado un creciente interés en analizar la implicación de las alteraciones en los patrones de muerte celular en diversas enfermedades autoinmunes, entre ellas e1 LES. Según esto, se ha evaluado si la suma de una activación policlonal de células B, dependiente de células Th2, junto con una alteración en sus programas de muerte celular es suficiente para que se desencadene autoinmunidad.

Para ello, se ha utilizado un modelo experimental de enfermedad autoinmune lupus- like, la enfermedad hospedador contra injerto Esta enfermedad se induce mediante inyección de células esplénicas de un ratón híbrido F1 en ratones neonatos de estirpe paterna. De este modo, se consigue un estado de tolerancia a los aloinjertos del donante, junto a un síndrome autoinmune autolimitado, que no acelera la mortalidad de los ratones. Este síndrome esta causado por la activación policlonal de las células B del donante F1, las cuales son estimuladas por células Th2 alorreactivas del receptor (fig. 4). La estrategia empleada para alterar los patrones de apoptosis fue utilizar ratones F1 transgénicos de Bcl- 2 que hiperexpresan la proteína en las células B. Los resultados demostraron, en primer lugar, que la prolongación en la vida media de las células B del donante incrementó las concentraciones aflto- Ac en los ratones tolerantes. Sin embargo, el dato mas significativo fue la modificación del repertorio del auto- Ac producido por estas células B, con aparición de auto- Ac con alto poder patogénico108. Este cambio en el repertorio puede atribuirse a dos motivos, no excluyentes entre sí. Por un lado, la hiperexpresión de Bc l- 2 podría evitar la eliminación de las célu las B autorreactivas durante su desarrollo. Estas células, que en el donante F1 no serían capaces de madurar al faltarles la cooperación de células T, al ser colocadas en el contexto de la interacción alogénica se diferenciarían hasta células productoras de autoAc. Ademas, Bcl- 2 prolongaría la supervivencia de los clones de células B autorreactivas capaces de escapar a la periferia, que normalmente no producen concentraciones altas de auto- Ac.

Figura 4. Interacción celular que se establece en eI modelo de enfermedad del buésped contra injerto. La interacción entre las células T CD4+ del huésped, capaces de reconocer a los aloantígenos MHC de clase II del donante F1, y las células B del donanteprovoca la activación policlonal de estas uItimas. Este becho desencadena la producción de una gran variedad de auto- Ac, muchos de ellos clásicamente asociados a enfermedades autoinmunes como e1lupus eritematoso sistémico (LES).

A la luz de estos datos, podrían explicarse algunas de las manifestaciones autoinmunes observadas en las enfermedades linfoproliferativas. Los procesos mencionados incluyen entre otros leucemias linfocíticas crónicas de células B o linfomas, tanto el hodgkiniano como linfomas no hodgkiniano. En estos procesos se ha descrito la aparición de hipergammaglobulinemia policlonal con presencia de múltiples auto- Ac

Modelo conjunto de Bcl- 2 y Bcl- X en el desarrollo linfoide

A partir de los datos expuestos anteriormente, se puede establecer un modelo en el que las dos proteínas podrían desempeñar papeles diferentes y complementarios en los procesos de selección y homeostasis linfoide.

En el desarrollo de las células B, sería Bcl- 2 el primero en expresarse de forma clara en las células pro- B, facilitando así la formación de una enorme reserva de células en el estadio previo al de célula pre- B. Entonces, Bcl- 2 decae facilitando el que puedan morir los precursores B que no hayan reordenado convenientemente los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las Ig. Sólo sobrevivirán aquellas células pre- B que posean un receptor funcional. Es en este momento cuando se incrementa significativamente la expresión de Bcl- Xl para permitir la viabilidad de la pequeña población de células pre-B que han realizado un reordenamiento productivo. Posteriormente, la expresión de ambas proteínas decae en el estadio inmaduro IgM+IgD- , lo que facilita la eliminación de las células B autorreactivas. Por último, en el estadio de célula B madura se induce Bcl- 2, lo que va a ayudar a mantener las células B periféricas.

En células T, la expresión de Bcl- Xl es máxima en el timocito CD4+CD8+. Mas tarde, en la población CD4+CD8+ que no se selecciona positivamente, Bcl- Xl disminuye y no se expresa Bcl- 2. En cambio, en los timocitos CD4+CD8+ una señal asociada con la selección positiva es el aumento en la expresión de Bcl- 2. De este modo, Bcl- 2 actuaría mas tarde que Bcl- Xl y funcionaría como una señal de supervivencia para los timocitos CD4+CD8+ durante el proceso de selección positiva.

Por otro lado, el distinto patrón de regulación demostrado por Bcl- 2 y Bcl- X l es consistente con un mecanismo sensor por el que se coordinarían de forma alterna la expresión de Bcl- 2 y Bcl- Xl durante el desarrollo linfoide. Sería un ejemplo de genes homólogos con redundancia funcional y que tendrían papeles fisiológicos ligeramente diferentes en el mantenimiento de las células durante su ontogenia. En definitiva, dada la importancia de Bcl- 2 y Bcl- X durante el desarrollo linfoide, las posibles alteraciones funcionales de estos genes pueden modificar la formación de un repertorio linfoide normal con persistencia de células autorreactivas en la periferia y la consiguiente aparición de fenómenos autoinmunes.

este proceso de diferenciación y permanecen en un estadio intermedio, subsidiario a experimentar una futura activación ante un nuevo contacto con el Ag, denominado linfocito B o T memoria. Estos linfocitos van a tener una vida media muy larga (del orden de meses o de años) y son los responsables de que la respuesta ante un segundo contacto con el Ag sea mas rápida y de mayor intensidad (respuesta secundaria). Los que completan el proceso de diferenciación van a convertirse en células efectoras: célula plasmática, linfocito T- citolítico o T- cooperador. Sin embargo, el sistema inmunitario debe ejercer un estrecho control sobre estas células, cuyo número se ha multiplicado de forma considerable tras el encuentro con el Ag. La potente actividad biológica de estas células puede representar un grave peligro para la integridad del organismo, en el caso de que permaneciesen activadas de forma indefinida. En este sentido, se ha descrito una forma de muerte celular, denominada <<apoptosis inducida por activación>>, en la que están implicados la molecula Fas y su ligando (Fas- L).

Las células activadas expresan en su membrana concentraciones altas de ambas moléculas, y se establecen interacciones Fas/Fas- L bidireccionales, mediante las cuales las celarlas activadas se aniquilan entre sí. Estas moléculas no tienen ninguna relación estructural con la familia de Bc1- 2.

Finalmente, la mayoría de los linfocitos no llega a reconocer ningún Ag a lo largo de su existencia. Estas células no activadas sufren apoptosis a las pocas semanas de vida. En este caso la muerte celular no parece depender de Fas, y se desconocen en la actualidad los mecanismos moleculares implicados.

En definitiva, la apoptosis durante el desarrollo linfoide tiene por objetivo eliminar los linfocitos defectuosos o autorreactivos, en las fases tempranas, y los linfocitos innecesarios o potencialmente dañinos en las fases mas avanzadas.

Regulación de Bcl- 2 y Bcl- X durante el desarrollo linfoide

 Los procesos de muerte y supervivencia celular durante el desarrollo linfocitario deben estar sujetos a un minucioso control, en el que cabe creer que Bc1- 2 y Bcl- Xl pudieran actuar como proteínas inhibidoras de la apoptosis a múltiples niveles. Esta posibilidad se ha analizado durante el desarrollo de los linfocitos B y T utilizando técnicas de <<Western blot>> y citometría de flujo. Con estas técnicas se ha caracterizado la expresión de Bc1- 2 y Bcl- Xl en los diferentes estadios de diferenciación linfocitaria, correlacionandola con la aparición o ausencia de fenómenos apoptóticos. Además, empleando animales que hiperexpresan (transgenicos) o que son deficientes (knockout) en estos genes, se ha evaluado in vivo su influencia en tales procesos de diferenciación. A continuación se describen las conclusiones mas destacadas de estos estudios.

El análisis de la expresión de Bc1- 2 y Bcl- Xl en el timo o en la medula ósea indica que estas proteínas se regulan de forma distinta durante la diferenciación linfocitaria (fig. 3). Bc1- 2 se expresa en los estadios mas primitivos de diferenciación, las células pro- B y los timocitos CD4- CD8- , así como en linfocitos B y T maduros. Por el contrario, Bcl- Xl se expresa en los estadios de celarla pre- B y timocitos T CD4+CD8+TCRlow, así como tras la activación de células T y B maduras. Cabe destacar que Bc1- 2 y/o Bcl- Xl son prácticamente indetectables en dos estadios de la diferenciación en donde son especialmente frecuentes los procesos de apoptosis: a) la transición de célula pro- B a pre- B o de timocito CD4- CD8- a CD4+CD8+TCRlow, períodos en los que tienen lugar los reordenamientos en los genes de las Ig y del TCR, respectivamente, y b) en linfocitos inmaduros B/IgM+IgD- y T/CD4+CD8+TCRlow, estadios ambos en los que ocurren los procesos de selección negativa tras reconocimiento de auto- Ag.

Figura 3. Regulación de la expresión de Bc1- 2y Bcl- X a lo largo del desarrollo de los linfocitos T (A) y de los linfocitos B (B). Se aprecia cómo ambas proteinas se regulan de manera reciproca durante el desarrollo de las céIulas linfoides. Como se comenta en el texto, las dos proteínas podrían desempeñar papeles diferentes y complementarios en los procesos de selección y homeostasis linfoide.

 Los resultados descritos anteriormente son muy esclarecedores del papel que estas dos proteínas pueden desempeñar en la regulación de la muerte celular programada en las células linfoides. En primer lugar, se observa que, con la excepción de los linfocitos B inmaduros IgM+IgD- , todas las poblaciones linfocitarias analizadas expresan concentraciones elevadas de alguna de estas proteínas inhibidoras de la apoptosis. Esto indica que se requiere una mínima actividad protectora de la muerte celular para permitir una linfopoyesis adecuada. De hecho, la hiperexpresión de Bc1- 2 o Bcl- Xl en linajes T y B provoca un aumento significativo en todas las poblaciones linfoides, aunque en mayor grado en linfocitos T o B maduros. Esta hipótesis se ha visto confirmada tras el estudio de ratones deficientes en Bcl- X, donde se observa una disminución selectiva en el número de células pre- B y CD4+CD8+TCRlow, y en animales deficientes en Bcl- 2, en los que el sistema inmunitario prácticamente desaparece en las primeras semanas de vida.

En segundo lugar, se observan concentraciones muy bajas o indetectables de Bcl- 2 y Bcl- Xl en poblaciones celulares que experimentan reordenamientos en los genes que codifican para las regiones variables de las Ig o del TCR. En estas células, los fenómenos de apoptosis son muy abundantes como consecuencia de la elevada tasa de reordenamientos inadecuados. De hecho, se ha observado recientemente que animales transgénicos que hiperexpresan Bcl- Xl en el linaje B presentan un aumento significativo en el número de células pro- B con reordenamientos inadecuados de las cadenas pasadas de las Ig. No obstante, estas células defectuosas son incapaces de continuar su proceso de maduración y acaban siendo eliminadas. Esto indica, o al menos sugiere, que en los precursores de linfocitos B y T las concentraciones de Bcl- 2 y Bcl- Xl sólo regulan la susceptibilidad a la muerte celular de un determinado clon, pero no intervienen en su diferenciación.

La situación contraria a la previamente descrita ocurre en linfocitos T y B activados. En condiciones basales, las células T y B maduras presentan concentraciones elevadas de Bcl- 2, pero no expresan Bcl- Xl. Tras la activación de las células T, vía TCR o CD28, o de las células B, vía IgM de superficie o CD40, las concentraciones endógenas de Bcl- Xl aumentan considerablemente, sin que se modifiquen las de Bcl- 2 . Sin embargo, las concentraciones elevadas de Bcl- Xl no se mantienen indefinidamente y retornan a su estado basal en el curso de la activación. Múltiples estudios han demostrado que la activación linfocitaria, al mismo tiempo que promueve la proliferación celular, induce apoptosis. Como se señaló en el apartado anterior, este fenómeno es crucial para limitar la duración y la intensidad de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, cabe especular que la presencia de Bcl- 2 y Bcl- Xl durante al menos las primeras fases de la activación linfocitaria es fundamental para permitir la proliferación celular y la diferenciación ulterior a linfocito T o B memoria. En este sentido, se ha demostrado que la hiperexpresión conjunta de Bcl- 2 y Bcl- Xl en los linfocitos B inhibe la aparición de apoptosis secundaria a la activación celular in vivo [78]. Así mismo, la hiperexpresión de Bcl- 2 incrementa la formación de linfocitos B memoria.

Modificación de los patrones de apoptosis y su relación con el desarrollo de autoinmunidad

Como se ha expuesto previamente, durante el desarrollo de los linfocitos los fenómenos de selección deben guardar un equilibrio taI que, conservando el máximo de efectivos para no menoscabar la resistencia del organismo frente al microentorno, se evite cualquier riesgo de reacción autoinmune [96]. No obstante, en algunas ocasiones este equilibrio se rompe en uno u otro sentido originando alteraciones patoIógicas. Así, uno de los factores a los que se ha atribuido un papel patogénico en autoinmunidad es la alteración en los procesos de muerte apoptótica [97]. Un ejemplo de ello son las manifestaciones autoinmunes asociadas a dos defectos genéticos, las alteraciones Ipry gld, descritas en modelos experimentales murinos [98,99]. Recientemente, se ha demostrado que la mutación Ipr consiste en un defecto en la expresión del Ag Fas, proteína traductora de señales de apoptosis1 , mientras que gld se ha caracterizado como una mutación puntual en el ligando de Fas [101]. Estas asociaciones clínicas y experimentales entre modificaciones en la apoptosis y autoinmunidad han dado pie a varios estudios tratando de implicar otros genes relacionados con la muerte celular, como Bcl- 2. Sin embargo, hasta la fecha ningún estudio ha demostrado datos consistentes de alteraciones en los patrones de expresión de estos genes en los pacientes con enfermedades autoinmunes. A pesar de ello el empleo de modelos experimentales, en los que se induce una expresión aumentada y/o mantenida de Bcl- 2 o Bcl- X, puede resultar una herramienta útil para analizar si la alteración de la muerte celular de los linfocitos puede influir en la eliminación de células autorreactivas y en la producción de reacciones autoinmunes.

Estos modelos han consistido básicamente en la construcción de ratones transgénicos de Bcl- 2 y Bcl- X, en los que el transgén se expresa selectivamente en linfocitos B o T, y en la transfección de líneas celulares con estos genes. Respecto a la influencia que la hiperexpresión de estas proteínas inhibidoras de apoptosis pudiera tener sobre la selección negativa de linfocitos B o T, los resultados son contradictorios. Por un lado, la hiperexpresión tanto de Bcl- 2 como de Bcl- Xl no evita la deleción de linfocitos T específicos para ciertos super- Ag propios [79,83,85]. Así mismo, en un modelo in vitro con una línea de linfoma de células B inmaduras (células WEHI- 231), la hiperexpresión de Bcl- 2 no fue capaz de proteger a estas células de la muerte por entrecruzamiento de la IgM de superficie [102]. Sin embargo, utilizando otra línea de linfoma B inmaduro, CH31, Bcl- 2 protegió parcialmente de la apoptosis inducida por un anticuerpo (Ac) anti- IgM [103]. En experimentos in vivo, Hartley et al [104] demostraron que la hiperexpresión de Bcl- 2 previene la eliminación de las células B autorreactivas en la médula ósea. No obstante, las células autorreactivas rescatadas de la selección negativa permanecían en estado inmaduro y terminaban muriendo. Por último, otros experimentos han demostrado que Bcl- 2 y Bcl- Xl son capaces de inhibir en los órganos linfoides periféricos la deleción de linfocitos T y B autorreactivos [105,106].

Las discordancias observadas entre los estudios previamente descritos podrían atribuirse a diferencias en la afinidad entre el receptor linfocitario y el autoAg. En este sentido, se ha demostrado que células WEHI- 231 transfectadas con Bcl- Xl sufren apoptosis tras incubación con un Ac anti- IgM de alta afinidad, pero sobreviven si el Ac anti- IgM es de afinidad intermedia o baja [107]. Por otro lado, la apoptosis inducida con Ac anti- IgM puede ser regulada por el nivel de expresión del transgén en las células B, tanto en el caso de Bcl- 2 (Merino y Núñez, observaciones no publicadas) como de Bcl- Xl [107].

La persistencia de linfocitos autorreactivos, por modificación de sus patrones de muerte celular, debería repercutir en la producción de manifestaciones clínicas autoinmunes. En efecto, la hiperexpresión de un transgén de Bcl- 2 en linfocitos B provoca una enfermedad lupus- like en ratones de la estirpe SJL, caracterizada por producción de diversos Auto- At y glomerulonefritis [89]. Sin embargo, en otros ratones transgénicos de Bcl- 2 o Bcl- Xl, construidos en estirpes de base genética diferente, no se han reproducido estas observaciones patológicas [78,87,88]. El hecho de que en la estirpe SJL se hayan descrito rasgos genéticos asociados a autoinmunidad indica que, por sí sola, la alteración de los mecanismos de apoptosis no provoca manifestaciones autoinmunes, requiriendo para ello la intervención de otros factores genéticos y/o ambientales.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es el prototipo de enfermedad autoinmune mediada por aflto- Ac, la mayoría de los cuales van dirigidos contra componentes celulares no organospecíficos. Existe un acuerdo general en considerar la activación de las células B autorreactivas de los pacientes con lupus como un fenómeno dependiente de los linfocitos T. A este respecto, se está concediendo cada día más relevancia al subtipo funcional Th2. Sin embargo, aún quedan numerosas incógnitas por desvelar en la colaboración T/B responsable de la producción de aflto- Ac en estos pacientes. Como se ha mencionado previamente, en los últimos años se ha observado un creciente interés en analizar la implicación de las alteraciones en los patrones de muerte celular en diversas enfermedades autoinmunes, entre ellas e1 LES. Según esto, se ha evaluado si la suma de una activación policlonal de células B, dependiente de células Th2, junto con una alteración en sus programas de muerte celular es suficiente para que se desencadene autoinmunidad [108].

Para ello, se ha utilizado un modelo experimental de enfermedad autoinmune lupus- like, la enfermedad hospedador contra injerto [108] Esta enfermedad se induce mediante inyección de células esplénicas de un ratón híbrido F1 en ratones neonatos de estirpe paterna. De este modo, se consigue un estado de tolerancia a los aloinjertos del donante [109], junto a un síndrome autoinmune autolimitado, que no acelera la mortalidad de los ratones. Este síndrome esta causado por la activación policlonal de las células B del donante F1, las cuales son estimuladas por células Th2 alorreactivas del receptor (fig. 4) [110,111]. La estrategia empleada para alterar los patrones de apoptosis fue utilizar ratones F1 transgénicos de Bcl- 2 que hiperexpresan la proteína en las células B. Los resultados demostraron, en primer lugar, que la prolongación en la vida media de las células B del donante incrementó las concentraciones aflto- Ac en los ratones tolerantes. Sin embargo, el dato mas significativo fue la modificación del repertorio del auto- Ac producido por estas células B, con aparición de auto- Ac con alto poder patogénico108. Este cambio en el repertorio puede atribuirse a dos motivos, no excluyentes entre sí. Por un lado, la hiperexpresión de Bc l- 2 podría evitar la eliminación de las célu las B autorreactivas durante su desarrollo. Estas células, que en el donante F1 no serían capaces de madurar al faltarles la cooperación de células T, al ser colocadas en el contexto de la interacción alogénica se diferenciarían hasta células productoras de autoAc [108,111]. Ademas, Bcl- 2 prolongaría la supervivencia de los clones de células B autorreactivas capaces de escapar a la periferia, que normalmente no producen concentraciones altas de auto- Ac.

Figura 4. Interacción celular que se establece en eI modelo de enfermedad del buésped contra injerto. La interacción entre las células T CD4+ del huésped, capaces de reconocer a los aloantígenos MHC de clase II del donante F1, y las células B del donanteprovoca la activación policlonal de estas uItimas. Este becho desencadena la producción de una gran variedad de auto- Ac, muchos de ellos clásicamente asociados a enfermedades autoinmunes como e1lupus eritematoso sistémico (LES).

A la luz de estos datos, podrían explicarse algunas de las manifestaciones autoinmunes observadas en las enfermedades linfoproliferativas. Los procesos mencionados incluyen entre otros leucemias linfocíticas crónicas de células B o linfomas, tanto el hodgkiniano como linfomas no hodgkiniano. En estos procesos se ha descrito la aparición de hipergammaglobulinemia policlonal con presencia de múltiples auto- Ac [112,113]

Modelo conjunto de Bcl- 2 y Bcl- X en el desarrollo linfoide

A partir de los datos expuestos anteriormente, se puede establecer un modelo en el que las dos proteínas podrían desempeñar papeles diferentes y complementarios en los procesos de selección y homeostasis linfoide.

En el desarrollo de las células B, sería Bcl- 2 el primero en expresarse de forma clara en las células pro- B, facilitando así la formación de una enorme reserva de células en el estadio previo al de célula pre- B. Entonces, Bcl- 2 decae facilitando el que puedan morir los precursores B que no hayan reordenado convenientemente los genes de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de las Ig. Sólo sobrevivirán aquellas células pre- B que posean un receptor funcional. Es en este momento cuando se incrementa significativamente la expresión de Bcl- Xl para permitir la viabilidad de la pequeña población de células pre-B que han realizado un reordenamiento productivo. Posteriormente, la expresión de ambas proteínas decae en el estadio inmaduro IgM+IgD- , lo que facilita la eliminación de las células B autorreactivas. Por último, en el estadio de célula B madura se induce Bcl- 2, lo que va a ayudar a mantener las células B periféricas.

En células T, la expresión de Bcl- Xl es máxima en el timocito CD4+CD8+. Mas tarde, en la población CD4+CD8+ que no se selecciona positivamente, Bcl- Xl disminuye y no se expresa Bcl- 2. En cambio, en los timocitos CD4+CD8+ una señal asociada con la selección positiva es el aumento en la expresión de Bcl- 2 [114,115]. De este modo, Bcl- 2 actuaría mas tarde que Bcl- Xl y funcionaría como una señal de supervivencia para los timocitos CD4+CD8+ durante el proceso de selección positiva.

Por otro lado, el distinto patrón de regulación demostrado por Bcl- 2 y Bcl- X l es consistente con un mecanismo sensor por el que se coordinarían de forma alterna la expresión de Bcl- 2 y Bcl- Xl durante el desarrollo linfoide. Sería un ejemplo de genes homólogos con redundancia funcional y que tendrían papeles fisiológicos ligeramente diferentes en el mantenimiento de las células durante su ontogenia. En definitiva, dada la importancia de Bcl- 2 y Bcl- X durante el desarrollo linfoide, las posibles alteraciones funcionales de estos genes pueden modificar la formación de un repertorio linfoide normal con persistencia de células autorreactivas en la periferia y la consiguiente aparición de fenómenos autoinmunes.