INSTRUCTIVO DE ANÁLISIS
DETERMINACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

ALCANCE 

CAMPO DE APLICACIÓN

REFERENCIAS

FDA, 1992, Bacteriological Analytical Manual, 7ª Edición. 

AISLAMIENTO DE LISTERIA MONOCYTOGENES
	El método de determinación de este agente consta de 3 etapas:
1º Etapa: Enriquecimiento selectivo
2º Etapa: Aislamiento de colonias sospechosas
3º Etapa: Identificación

Procedimiento
1.- Etapa de enriquecimiento:
	Agregar 25 g de la muestra a 225 ml de caldo de enriquecimiento (anexo II, Nº14). Poner en mezcladora o stomacher durante el tiempo que se requiera para obtener una mezcla completa. Dejar el cultivo de caldo de enriquecimiento en la jarra o en la bolsa del stomacher, o transferir a un matraz de 500ml, e incubar por 2 días a 30ºC.

	En el caso de aquellas muestras en que se sospecha la presencia de Listerias dañadas por coagulación o calentamiento, se recomienda la incubación adicional en caldo de cultivo de enriquecimiento que contenga 0,1% (p/v) de piruvato de sodio, incubado a 30ºC por 6 horas sin agregar los agentes suplementarios. Luego de las 6 horas éstos pueden adicionarse en los niveles descritos, y continuar la incubación a 30ºC hasta completar el total de 48 horas, haciendo los traspasos a agares selectivos a las 24 y 48 horas. Este procedimiento permite la recuperación rápida de las células de Listeria que se encuentren dañadas.

2.- Etapa de aislamiento:
	A las 24 y 48 horas sembrar el cultivo del caldo de enriquecimiento en los medios OXA (anexo II, Nº13) y LPM (anexo II, Nº3). Incubar las placas con agar OXA a 35ºC por 24 a 48 horas y las placas con agar LPM a 30ºC por 24 a 48 horas. Examinar las placas LPM para obtener colonias sospechosas utilizando luz blanca con potencia suficiente para iluminar bien la placa. El haz de luz debe alcanzar el fondo de la placa en un ángulo de 45º, tal como se grafica en la figura 1:

Placa

Fuente de Rayo de Luz Blanca

Observación

45º

Tripode

45º

Espejo Plano

	
Figura 1: Examen de placas por iluminación Henry, para colonias sospechosas de Listeria spp.

Cuando se examina con esta luz oblicua –reflejada con una posición ocular directamente encima de la placa, ya sea a simple vista o con ayuda de una lupa, las colonias de Listeria spp se observan azules brillante, con aspecto de vidrio molido o bien blancas, en el agar LPM.

Se recomienda el uso de placas con colonias control positivos y negativos para entrenar el ojo del observador. Los componentes del sistema óptico utilizado pueden variar, los puntos importantes son el ángulo de incidencia del haz de luz en la placa (45º) y el de la luz emergente de ésta (90º).

	Transferir 5 o más colonias típicas del medio LPM y/o OXA a agar soya tripticasa con 0,6% de extracto de levadura (TSAYE) (anexo II, Nº11), sembrando de modo de obtener colonias puras aisladas. La purificación en medio TSAYE es un paso imprescindible en este análisis ya que las colonias aisladas en los medios OXA y LPM pueden estar aún en contacto con competidores débiles parcialmente inhibidos. Se requieren al menos 5 aislamientos, ya que de cada muestra puede ser aislada más de una especie de Listeria.

	Incubar las placas TSAYE a 30ºC por 24ª 48 horas.

3.- Identificación:
	La identificación se realiza por medio de los siguientes test clásicos:
a)	Examen de placas TSAYE para detección de colonias típicas con el sistema de iluminación de Henry. Las colonias se observan azules o azul grisáceo. Se recomienda comparar con cultivos controles.

b)	Tomar colonias típicas de las placas incubadas a 30ºC o menos y examinar por observación con lente de inmersión utilizando una solución salina al 0,25% como medio de suspención. Elegir aquella colonia con crecimiento suficiente para formar una suspención concentrada, y emulsificar bien. Si se utiliza una colonia pequeña, las pocas células presentes pueden adherirse al lente o a la placa y aparecer inmóviles. Las Listerias spp se observa como varillas delgadas y cortas con motilidad suave rotatoria. Siempre se debe comparar con un cultivo conocido. Cocos, varillas largas o varillas con motilidad progresiva rápida no corresponden a Listeria spp.. Alternativamente se puede utilizar el medio de 7 días para determinar motilidad.
c)	Realizar la prueba de catalasa (anexo II, Nº1); las especies de Listeria son catalasa (+).
d)	Tinción Gram en cultivos de 16 a 24 horas; todas las Listerias spp corresponden a bastones cortos Gram positivos, sin embargo, cultivos viejos pueden verse cocoides frente a una tinción Gram. Las células tienen tendencia a formar empalizada, con formación de una sustancia densa y viscosa. Esto puede llevar a un falso rechazo ya que aparece bastante similares a una bacteria difteroide.
e)	Tomar colonias típicas e introducir en un tubo con caldo soya tripticasa con 0,6% de extracto de levadura (TSBYE) (anexo II, Nº12) para inocular a su vez un medio de fermentación de carbohidratos (anexo II, Nº8) y otros medios de prueba. Incubar a 35ºC por 24 horas. Este cultivo debe ser mantenido a 4ºC por varios días y puede ser usado en forma repetida como inóculo.

f)	Inocular en forma abundante (utilizando las colonias obtenidas del agar TSAYE), un agar con % de sangre ovina, sembrando por estría. Las placas deben tener una capa delgada de este agar y estar bien secas (se recomienda chequear la humedad antes de usar). Dibujar un cuadriculado de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa. Sembrar un cultivo en cada uno de estos espacios. Se recomienda siempre sembrar controles positivos (L. monocytogenes, L. ivanovii) y negativos (L. innocual). Incubar por 48 horas a 35ºC. tratar de no golpear el fondo de la placa para que no se rompa la superficie del agar.
g)	Examinar las placas de agar sangre sembradas, con una luz brillante. L. monocytogenes y L. secligeri producen una delgada zona clara alrededor de la siembra, L. innocua no muestra esa zona de hemólisis, L. ivanovii produce una zona clara muy bien definida alrededor de la estría de la siembra. No se recomienda tratar de diferenciar especies en este punto, pero si es posible establecer la naturaleza y magnitud de la reacción hemolítica. Las reacciones dudosas deben ser confirmadas mediante el test de CAMP.

h)	Test de reducción a nitritos. Para este test utilice los cultivos obtenidos del caldo TSBYE para inocular el caldo nitrato (anexo II, Nº4). Incubar a 35ºC por 5 días. Adicionar 0,2 ml de reactivo B seguido de 0,2 ml del reactivo A (anexo II, Nº5). Un color rojo indica la presencia de nitritos, señala que el nitrato presente ha sido reducido. Si no se produce este color, adicionar polvo de Zinc y dejar 1 hora. La aparición del color rojo indica que el nitrato se encuentra aún presente y no ha sido reducido; sólo la L. murrayi reduce nitrato.

Como procedimiento alternativo, adicionar 0,2 ml de reactivo B seguido por 0,2 ml de reactivo C (anexo II, Nº5). El color naranja indica reducción del nitrato. Si no se produce el cambio de color adicional 0,2 ml de reactivo de cadmio. La producción de color naranja en este caso indica la presencia de nitrato no reducido. Este procedimiento permite eliminar el uso del carcinógeno a –naftilamina.
i)	Inocular los medios SIM (anexo II, Nº9) o MTM (anexo II, Nº10) con cultivo obtenido del caldo TSBYE. Incubar por 7 días a temperatura ambiente. Observar diariamente. La Listeria spp es móvil, proporcionando un patrón característico en forma de paragüas.
j)	Inocular con cultivo obtenido del caldo TSBYE, las siguientes soluciones al 0,5% de carbohidratos en caldo púrpura carbohidratos (anexo II, Nº8) (el uso de tubos Durham es opcional): dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar por 7 días a 35ºC, la reacción positiva a Listeria produce ácido pero no gas. Todas las especies son generalmente positivas para dextrosa, esculina y maltosa. Todas las Listerias excepto L. grayi y murrayi deberían ser manitol negativas.
Si se produce pigmentación rápida e inequívoca del aislado de OXA, el test de esculina puede ser omitido.
k)	Test de CAMP:
Sembrar una estría con cultivo puro de S. aureus  hemolítico, y otra de R. equi, en forma vertical, lo suficientemente separadas para poder sembrar horizontalmente entre ambas las cepas testadas, sin que toquen las estrías verticales. 

Luego de 24 y 48 horas de incubación a 35ºC examinar las placas a fin de evidenciar zonas de hemólisis cerca de las estrías de S. aureus y R. equi. La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri es mayor cercana a la estría de S. aureus; la zona de hemólisis de L. ivanovii se ubica cerca de la estría de R. equi.

Otras especies son no hemolíticas y no reaccionan frente a este test. El test de CAMP permite diferenciar L. ivanovii de L. seeligeri y puede hacer manifiesta la diferencia entre L. seeligeri de baja potencia hemolítica (que puede haber sido leída como no hemolítica) y una L. welshimeri. Todos aquellos aislados que den reacciones típicas de L. monocytogenes excepto la producción de hemolisína, deben ser sometidos al test de CAMP antes de ser considerados como Una L. innocua no hemolítica.
4.- Interpretación de los resultados de los análisis de determinación de especies:
	Todas las Listerias spp son pequeñas, catalasa positivas, con aspecto de varillas móviles, Gram (+). Utilizan la dextrosa, esculina y maltosa, y algunas especies utilizan el manitol, la ramnosa y xilosa con producción de ácido.

	La reducción de nitrato permite diferenciar entre L. grayi y L. murrayi ya que sólo esta última es capaz de producirla. L. monocytogenes, L. ivanovii, y L. seeligeri producen hemólisis al ser sembradas por estrías en agar sangre ovina y consecuentemente son positivas al test de CAMP. De las 3 sólo L. monocytogenes no utiliza la xilosa y es positiva a la utilización de la ramnosa. La dificultad de diferenciar L. ivanovii de L. Seeligeri puede ser resuelta por el test de CAMP, en el cual L. seeligeri muestra una marca de hemólisis cerca de la estría de S. aureus mientras que L. ivanovii muestra una marcada actividad hemolítica en el área cercana a la estría de R. equi.

	De las especies no hemolíticas L. innocua puede dar las mismas reacciones que L. monocytogenes con ramnosa y xilosa pero se diferencian porque L. innocua es negativa al test de CAMP. Esta es la única especie que puede en algunas oportunidades dar negativo al test de ramnosa y xilosa.

	L. welshimeri, que es ramnosa negativa, puede ser confundida con una L. seeligeri de actividad hemolítica débil, a menos que sea realizado un test de CAMP.

DIFERENCIACIÓN DE ESPECIES DE LISTERIA

Especies	 Hemolítica a	Reducción Nitrato	Producción de Ácido de
Manitol   Ramnosa   Xilosa	
L. monocytogenes	+	-	-            +            -	 
L. ivanovii	+	-	-            -            +	
L. innocua	-	-	-            vb            -	
L. welshimeri	-	-	-            v            +	
L. seeligeri	+	-	-            -            +	
L. garyi	-	-	+            -            -	
L. murrayi	-	+	+            v            -	
a = Estrías en sangre ovina.
b = v, variable.

REACCIÓN AL TEST DE CAMP DE LAS ESPECIES DE LISTERIA

Especies	Interacción Hemolítica
S. aureus              R. equi	
L. monocytogenes	+                     -	
L. ivanovii	-                    +	
L. innocua	-                    -	
L. welshimeri	-                    -	
L. seeligeri	+                    -	

ANEXO
I.- Materiales y Equipos
1.-	Balanza Analítica.
2.-	Incubadoras de 30 y 35ºC.
3.-	Mezclador y agitador (Stomacher) y bolsas especiales.
4.-	Microscopio de contraste de frases, con objetivo de inmersión (100 X).
5.-	Porta objetos.
6.-	Cubreobjetos.
7.-	Aceite de inmersión.
8.-	Lupa con fuente de luz.
9.-	Matraces Erlenmeyer 500 ml.
10.-	Tubos de 16 ? 125 ml u otro tamaño adecuado, con tapa.
11.-	Tubos de fermentación (Durham).
12.-	Pipetas de 25, 10 y 1 ml.
13.-	Placas de Petri.
14.-	Asas de inoculación.
15.-	Agujas de inoculación.
16.-	Agujas 26.G y 3/8 de pulgada.
17.-	Jeringas de tuberculina desechables y estériles.
18.-	Lápiz graso o marcador.

II.- Medios de Cultivo y Reactivos
1.-	Solución de peróxido de hidrógeno 3%, para el test de catalasa.
2.-	Hidrógeno de sodio, solución al 40%.
3.-	Agar Cloruro de litio –fenil etanol- moxalactam (LPM).
4.-	Medio de reducción de Nitrato.
5.-	Reactivos para la detección de Nitrato.
6.-	Caldo nutritivo.
7.-	Solución salina fisiológica, 0,85%.
8.-	Caldo base púrpura para fermentación de carbohidratos, conteniendo soluciones al 0,5% de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa.
9.-	Medio SIM.
10.-	Medio de medición de motilidad (MTM Difco).
11.-	Agar soya tripticasa con 0,6% de extracto de levadura (TSAYE).
12.-	Caldo soya tripticasa con 0,6% de extracto de levadura (TSBYE).
13.-	Medio Oxoid (OXA).
14.-	Caldo de enriquecimiento (EB).
15.-	Ácido acético, 5 N.
16.-	Acriflavina HCl.
17.-	Agar (Difco).
18.-	Alfa-Naftilamina.
19.-	Alfa-Naftol 5% en etanol absoluto.
20.-	Agar sangre base Nº2 (Unipath).
21.-	Cicloheximida.
22.-	Sangre ovina desfibrinada.
23.-	Etanol absoluto.
24.-	Solución tampón con anticuerpos fluorescentes (F.A.) (Difco).
25.-	Anhídrido de glicina.
26.-	Kit para cepas Gram.
27.-	Set de sueros para tipificación de Listerias (Difco).
28.-	Ácido Nalidixico, sal sódica.
29.-	Ácido sulfanílico.

1.- Test de catalasa: Poner 1 ml de peróxido de hidrógeno al 3% sobre colonias desarrolladas en un medio de cultivo. Las burbujas de gas indican reacción positiva. Alternativamente se puede emulsificar una colonia en una gota de peróxido de hidrógeno al 3% sobre un portaobjetos. El burbujeo inmediato determina positividad al test de catalasa. Si la colonia proviene de una placa con agar sangre, ésta debe ser extraída con cuidado para no arrastrar células sanguíneas que puedan dar una reacción falsa positiva.

2.- Solución de hidrógeno de potasio, 40%:
KOH						40 g
Agua destilada hasta completar		1 litro.

3.- Medio cloruro de litio-feniletanol-moxalactam (LPM):
Agar feniletanol (Difco)			35,5 g
Anhídrido de glicina (no glicina)		10 g
Cloruro de litio					5 g
Solución stock de moxalactam, en solución
tampón fosfato al 1%, pH 6			2 ml
Agua destilada

Esterilizar el medio, sin moxalactam, a 121ºC por 15 minutos. Enfriar a 48-50ºC y añadir solución de moxalactam esterilizada por filtración.

Solución stock moxalactam consiste en 1 g de sal moxalactam (amoniacal o sódica) en 100 ml de solución 0,1 M de buffer fosfato potásico, pH 6. Almacenar la solución esterilizada por filtración, en alícuotas de 2 ml.

El medio LPM es más efectivo frente al sistema de iluminación de Henry cuando está en capa delgada (12 – 15 ml por placa Petri tamaño standard).

Para evitar el secado de esta capa delgada de agar, refrigerar y usar las placas rápidamente.

El medio base LPM se encuentra disponible comercialmente en forma de polvo.

4.- Caldo Nitrato
Extracto de carne				3 g
Peptona						5 g
KNO3 (libre de nitritos)				1 g
Agua destilada					1 lt.

Disolver los ingredientes. Dividir en porciones de 5 ml en tubos de 16 ´ 125 mm. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. El pH final debe ser 70,2.

5.- Reactivos para reducción de nitratos:
Reactivo A: Disolver por calentamiento suave 0,5 g de alfa-naftalina (carcinogénico) en 100 ml de ácido acético 5 N. Preparar el ácido acético 5 N adicionando agua a 28,7 ml de ácido acético glacial (17,4 N), hasta completar un volumen final de 100 ml.

Reactivo B: Disolver 0,8 g de ácido sulfanílico en 100 ml de ácido acético 5 N, por calentamiento suave.

Reactivo C: Disolver 1 g de a-naftol en 200 ml de ácido acético.

Polvo de Zinc.

Reactivo de Cadmio: Poner discos de zinc en una solución de sulfato de cadmio al 20% por varias horas, secar el cadmio precipitando y agregarlo a ácido clorhídrico 1 N.

6.- Caldo Nutritivo:
Extracto de carne				3 g
Peptona						5 g
Agua destilada					1 lt

	Calentar para disolver. Disponer en porciones de 10 ml en tubos o porciones de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml.

	Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. pH final 6,8 0,2.

7.- Solución salina fisiológica, 0,85%
NaCl 						8,5 g
Agua destilada					1 lt
Disolver los 8,5 g de NaCl en el agua. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. Enfriar a temperatura ambiente.

8.- Caldo púrpura carbohidratos
Peptona proteosa Nº3				10 g
Extracto de carne				1 g
NaCl						5 g
Púrpura de Bromocresol			0,02 g
Agua destilada					1 lt

	Disolver por separado 5 g de dulcitol, 10 g de lactosa, 0 10 g de sacarosa en este caldo basal. Repartir en porciones de 2,5 ml en tubos 13 ´ 100 mm que contengan campana Durham. Autoclavar a 118ºC por 10 minutos pH final 6,8  0,2. Como alternativa, disolver los ingredientes, omitiendo los carbohidratos, en 800 ml de agua destilada por calentamiento y agitación ocasional. Repartir en cantidad de 2 ml en tubos de 13 ´ 100 mm con campana Durham. Autoclavar por 15 minutos a 118ºc y dejar enfriar. Disolver los carbohidratos con 200 ml de agua destilada y esterilizar por filtración. Añadir en forma aséptica 0,5 ml de filtrado estéril a cada tubo con caldo esterilizado luego que alcancen una temperatura menor a 45ºC. Agitar suavemente para mezclar, pH final 6,8  0,2.

9.- Medio Motilidad SIM:
Rehidratar y agregar 6 ml de medio a cada tubo con tapa rosca de 16 ´ 125 mm. Esterilizar de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

10.- Medio semisólido para test de motilidad
Extracto de carne				3 g
Peptona						10 g
NaCl						5 g
Agar						4 g
Agua destilada					1 lt
Calentar con agitación y hervir 1 – 2 minutos para disolver el agar. Repartir en porciones de 8 ml en tubos con tapa rosca 16 ´ 150 mm. Autoclavar 15 minutos a 121ºC, pH final 7,4  0,2.

11.- Agar soya tripticasa con 0,6% de extracto de levadura (TSAYE)
a)	Agar soya tripticasa
Peptona tripticasa				15 g
Peptona fitona					5 g
NaCl						5 g
Agar						15 g
Agua destilada					1 lt

	Calentar con agitación para disolver el agar. Hervir 1 minuto. Repartir en tubos o frascos adecuados. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC, pH final 7,3  0,2.

b)	Medio completo:
Agar soya tripticasa				40 g
Extracto de levadura				6 g
Agua destilada					1 lt

12.- Caldo soya tripticasa con 0,6% extracto de levadura (TSBYE)
a)	Caldo soya tripticasa:
Agar soya tripticasa				17 g
Peptona fitona					3 g
NaCl						5 g
K2HPO4						2,5 g
Glucosa						2,5 g
Agua destilada					1 lt

	Calentar con agitación suave para disolver.

	Disponer en cantidad de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml.

	Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC pH final 7,3  0,2.

b)	Medio completo:
Caldo soya tripticasa				30 g
Extracto de levadura				6 g
Agua destilada					1 lt

13.- Medio Oxford
Agar sangre base columbia			39 g
Esculina						1 g
Citrato férrico amoniacal			0,5 g
Cloruro de litio					15 g
Cicloheximida					0,4 g
Sulfato de colistina				0,02 g
Acriflavina					0,005 g
Cesfotetan					0,002 g
Fofomicina					0,01 g
Agua destilada					1 lt

	Agregar 55,5 g de los primeros 4 componentes del medio (medio basal) a 1 lt de agua destilada. Llevar lentamente a ebullición para disolver completamente.

	Esterilizar por autoclavado a 121ºC por 15 minutos.

	Enfriar a 50ºC y agregar el suplemento  (ver más abajo) en forma aséptica, mezclar y repartir en placas Petri estériles. Para preparar el suplemento disolver la cicloheximida, sulfato de colistina, acriflavina, cefotetan y fosfomicina en 10 ml de una mezcla 1:1 de etanol y agua destilada. Esterilizar este suplemento por filtración antes de usar. El medio base Oxford y la mezcla suplementaria se encuentra disponible en forma comercial.

14.- Caldo de enriquecimiento (EB), ph 7,3
Caldo TSBYE (anexo 6) suplementado con:
Acriflavina HCl					15 mg/l
Ácido Nalidixico (sal sólida)			40 mg/l
Cicloheximida					50 mg/l
Ácido pirúvico (sal sódica 10%
p/v, solución acuosa para Listeria
spp dañadas)					11,1 ml/l

	Adicionar los 3 elementos suplementarios en forma aséptica al TSBYE, luego del autoclavado y justo antes de su uso. Suplementar acriflavina y ácido nalidixico como solución 0,5% p/v en agua destilada. Agregar cicloheximida como solución 1% p/v en una solución 40% (v/v) de etanol en agua.

	Esterilizar por filtración los 3 elementos suplementarios. Adicionar 0,68 ml de solución de acriflavina, 1,8 ml de solución de ácido nalidixico y 1,16 ml de solución de cicloheximida a 225 ml de TSBYE para alcanzar las cantidades especificadas en mg/lt (con variación de  1,6%). Si es necesario recuperar Listerias dañadas agregar 2,5 ml de solución de piruvato de sodio al 10% (p/v) esterilizada por filtración en el tiempo cero, y retrasar la incorporación de los 3 suplementos hasta después de 6 horas de incubación a 30ºC.

	Nota: La cicloheximida es muy tóxica. Tener cuidado con su almacenamiento y utilización, especialmente si se utilizan grandes volúmenes de caldo de enriquecimiento.

DETERMINACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES
FDA Bacteriological Analytical Manual 1992

Etapa de Identificación

Etapa de
Aislamiento

Etapa de
Enriquecimiento

•	Examen de placas TSAYE (Iluminación de Henry)
•	Examinar colonias con lentes de inmersión
•	Catalasa
•	Tinción Gram
•	Fermentación de carbohidratos
•	Agar TSAYE con porcentaje de sangre ovina
•	Reducción de nitritos
•	SIM
•	Test de CAMP

5 colonias típicas
Agar Soya Tripticasa con 0.6% de extracto de levadura (TSAYE)
30°C por 24 – 48 hrs.  

Agar OXA  a 35°C por 24 – 48 hrs.
y
Agar LPM a 30°C por 24 – 48 hrs.

25 g de muestra
225 ml de Caldo Enriquecimiento (EB)
24 – 48 hrs a 30°C