DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN 
DE 
COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI

ALCANCE 

CAMPO DE APLICACIÓN

REFERENCIAS
Directiva 20.83-05	Productos Pesqueros de Exportación. Métodos Estandarizados de Análisis Microbiológico

DETERMINACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI
Referencias
•	FAO EC/MICROBIOL/75/REP. 1/ANEXO V
•	LABORATORY PROCEDURES, FOR THE EXAMINATION OF SEAWATER AND SHELLFISH 
ARNOLD E. GRUNBERG. DANIEL A HUNT. EDITORS.
FIFTH EDITION, 1985 THE AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION
•	PROCEDIMIENTOS Y TÉCNICA DE LABORATORIO VOL III
BACTERIOLOGÍA ESPECIAL Y BROMATOLOGÍA Dr. H. LOBOS R.
Dr. J. GARCIA M. STGO. 1983 DE CHILE

1. Principio
	Este método se basa en la hipótesis de que las células microbianas que contiene una muestra mezclada con un medio de agar forman, cada una, colonias visibles y separadas. Para ello se mezclan diluciones decimales de la muestra del alimento homogenizado con el medio. Después de incubar las placas a 35±0.5ºC por 48±3 hr., se calcula el número de colonias obtenidas en cápsulas de Petri elegidas con diluciones que den resultados significativos.
1.2 Materiales
•	 Tubos de ensayo de 18 x 180 mm.
•	 Tubos Durham de 10 x 75 mm.
•	 Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml. (flujo total)
•	 Incubadoras de 35±0.5ºC
•	 Baño de agua termostatado 44,5±0.5ºC
•	Cuenta colonia
1.3 Medios de cultivos y reactivos
•	 Caldo 2% de verde brillante, bilis y lactosa
•	 Solución reguladora de peptona
•	 Medio y reactivo de indol
•	 Citrato de Koser o Simmons
•	 Caldo de Triptosa y sulfato de lauril 
•	 Agar de Levine, con eosina y azul de metileno 
•	 Medio de Voger-Proskauer
•	 Agar para computo bacteriano

1.4 Procedimiento
	1.4.1 Homogenización del alimento.
- Se pesan 25 g. de la muestra, mezclada asépticamente, en una mezcladora esterilizada o en una bolsa de Stomacher y se añaden 225 ml. de solución reguladora de peptona. Se agita a la velocidad de 15.000 a 20.000 rpm durante 2,5 minutos como máximo, se mezcla en la bolsa Stomacher durante 20 segundos.	
	1.4.2 Dilución
a) Se mezcla el alimento homogenizado, agitándolo; se toma 1,0 ml. con una pipeta y se vierte en un tubo que contenga 9 ml. de solución reguladora de peptona; se mezcla cuidadosamente, aspirando diez veces con una pipeta.
b) Con la misma pipeta, se toma 1,0 ml. de la primera dilución y se vierte en el yibo de la segunda dilución, que contiene 9 ml. de solución reguladora de peptona; se mezcla ésta con una pipeta nueva y se repite la operación con un tercer tubo completando el número de diluciones requeridas.

2. Prueba Presuntiva.
2.1 Antes de usar cada dilución, se deben agitar a fin de verificar su homogenización.
2.1.2 El test presuntivo consiste en la incubación selectiva de muestras en caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST). Se transfiere 1 ml. de inóculo de las diluciones preparadas (1.4.2), 1:10 - 1:100 y 1:1000 a 3 tubos de caldo LST por cada dilución, las muestras se incubarán por 48±2 hr., en una estufa a 35±0.5ºC. 

2.1.3 Los tubos se examinarán a las 24±2 hr. y serán positivos aquellos que tengan presencia de gas evidenciando en el tubo de fermentación Durham. Los tubos negativos, continuarán en incubación hasta completar las 48 hr. en que se procederá nuevamente a examinar la presencia de gas.

3. Prueba Confirmativa.

3.1 Después de incubar en caldo LST, transfiera de todos los tubos gas positivo a caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB). Se considera positivo para el grupo de coliformes totales, a los organismos que pueden crecer y producir gas dentro de las 48±2 hr. a 35±0.5ºC cuando se incuban en este caldo.
3.2 Lectura de los resultados
Registre el número de tubos gas positivo de cada dilución. De la tabla NMP (Anexo 1), determine el valor NMP para el test.

4. Determinación de Eschetichia coli.

4.1 Al mismo tiempo que se utiliza como procedimiento presuntivo el caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST), se transfiere una asada de cada suspensión a tubos de caldo E.C. con campana, (conjuntamente con la siembra de los tubos de confirmación). Incubar en baño maría termorregulado a 44.5±0.2ºC durante 24±2 hr. El agua debe tener un nivel más alto que el nivel del caldo del cultivo en los tubos.
La producción de gas, se interpreta como una reacción positiva que indica coliformes de origen fecal.

4.2 Sembrar cada tubo positivo de E.C. sobre una placa con agar de Levine. se extiende el contenido en estrías, de forma de obtener colonias separadas y se incuba con las placas invertidas, a 35±0.5ºC por 24±2 hr. Las colonias típicas de coliformes se presentan separadas y nucleadas con o sin brillo metálico. Aquellas colonias coloreadas, que se presentan juntas y mucosas, con un brillo débil, podrían ser coliformes. Colonias descoloridas remotamente lactosa fermentadoras, se descartan del grupo de coliformes.
4.3 Para la diferenciación de las bacterias coliformes, se realizarán las pruebas con Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato (IMViC). De cada una de las placas con medio de Levine, se toman dos o tres colonias sospechosas, y se pasan a un agar nutritivo inclinado y se incuban durante 18-24 hr. a 35ºC. Al mismo tiempo, se tiñe cada cultivo por el método del Gram.
	4.3.1 Test IMViC
Se realizan los ensayos con Indol, Rojo de metilo, medio de Voges-Proskauer y Citrato.
	4.3.2 Test de Indol
Se inoculan las colonias en un tubo con caldo triptona y se incuban por 24±2 hr a 35ºC. Se añaden 0,2 ml. de reactivo de Kovacs. La Formación de un anillo rojo indica una reacción positiva.
	4.3.3 Voges-Prokauer (V.P.)
Se inocula un tubo de rojo de metilo Voges-Proskauer y se incuba por 482 hr. a 35ºC.  
Efectuar el test de Voges-Proskauer a temperatura ambiental transfiriendo 1 ml. de cultivo de 48 hr. a un tubo de ensayo, al que se agregan 0,6 ml. de alfa naftol y 0,2 ml. de KOH al 40% se debe agitar en cada adición. Los resultados se leen a las 4 horas de haber agregado los reactivos V.P.  color rosado. 	

	4.3.4 Rojo de Metilo 
Se inocula el tubo que contiene el Voges-Proskauer, se incuba durante 48 hr. a la temperatura de 35ºC y se añaden a cada tubo cinco gotas de indicador de rojo de metilo R.M. + = color rojo.
	4.3.5 Citrato de Simmons
Inocule con una aguja en caldo Citrato de Simmons, se incuba durante 96 horas a 35ºC y se examina para comprobar por turbidez el desarrollo de microorganismos. El viraje a coloración azulada puede ser considerado como reacción positiva.
Paralelamente inocule un tubo con caldo lactosa con tubo de fermentación y con indicador pH. Use un mínimo de inóculo para prevenir resultados falsos positivos. Lea los tubos con lactosa a las 24 y 48 horas. El desarrollo de ácido y de gas indica una reacción positiva.

Clasificación de los Coliformes mediante los ensayos IMViC
INDOL	RM	VP	CITRATO	TIPO	
+	+	-	-	Escherichia coli típico	
-	+	-	-	Escherichia coli atípico	
+	+	-	+	Típico Intermedio	
-	+	-	+	Atípico Intermedio	
-	-	+	+	Escherichia aerogenes típico	
+	-	+	+	Escherichia aerogenes atípico	

Se computa el NMP de Escherichia coli por gramos o milímetro, considerándose como Escherichia coli los bastoncillos gram negativos no esporeiformes que producen gas en la lactosa. y que reaccionan ++-- ó -+-- con los ensayos IMViC.

Medios de Cultivo.

Todas las preparaciones de medios indicadas en esta sección están disponibles en el mercado, ya sea deshidratadas o para uso inmediato. Para su preparación y empleo deben seguirse las instrucciones del fabricante. 
Por la manipulación que supone la preparación de medios de cultivo por los laboratorios, todo medio disponible en el mercado preparado, debe ser usado en la implementación de la técnica.
En aquellos casos excepcionales, en que se prepare algún medio en el laboratorio, se seguirán las instrucciones que se dan en esta sección. Para ajustar el pH de los medios, se utilizará NaOH, Hcl, ácido láctico o ácido tartárico.

1.1 Caldo de Lactosa, verde brillante y bilis al 2% (LBVB)
	Composición del medio basal.
Peptona 		10,0 g.	
Lactosa	10,0 g.	
Bilis de buey	20,0 g.	
Verde brillante	0,013 g.	
Agua destilada	1000,0 g.	

Disolver la peptona y lactosa en 500 ml. de agua destilada ......... se añade la bilis de buey disuelta en 200 ml. de agua, se mezcla hasta llegar a 950 ml., ajustando el pH a 7,4. Se añaden 13,3 ml. de solución acuosa de verde brillante al 0,1%, y agua destilada, ...... campanas de Durham, en volúmenes de 10 ml. y se esteriliza a 120ºC... durante 15 minutos.

1.2 Caldo de Lauril Sulfato Triptosa (LST)
	Composición del medio basal.

	Triptosa, triptona o tripticasa	20,0 g.	
Lactosa	5,0 g.	
Fosfato dipotásico monohidrogenado	2,75  g.	
Fosfato potásico dihidrogenado	2,75 g.	
Cloruro de sodio	5,0 g.	
Sulfato de sodio y lauril 	0,1 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

Disolver los componentes en 1000 ml. de agua destilada ........ distribuir en tubos de ensayo con campanas Durham invertidas .... esteriliza durante 10 minutos a 121ºC.

1.3 Caldo EC
	Composición del medio basal
Tripticasa o triptona	20,0 g.	
Sal biliar Nº3	1,5 g.	
Lactosa	5,0 g.	
Fosfato dipotásico hidrogenado	4,0 g.	
Fosfato de potasio dihidrogenado	1,5 g.	
Cloruro de sodio	5,0 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

Disolver los componentes en 100 ml. de agua destilada estéril, distribuir en tubos de ensayo en volúmenes de 15 ml. , y se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC.

1.4 Agar de Levine (lactosa, eosina y azul de metileno) (L-EMB)
	Composición del medio basal
a)
Peptona	10,0 g.	
Lactosa	10,0 g.	
Fosfato dipotásico hidrogenado	2,0 g.	
Agar	15,0 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

b)
Eosina Y	0,4 g.	
Azul de metileno	0,065 ml.	

Disolver los componentes descritos en (a), en 1000 ml. de agar destilada estéril, ajustando el pH a 7.1-7.2. Se distribuye en volúmenes de 100 ml., que se esterilizan durante 15 minutos a 121ºC. Antes de su uso se añade a cada volumen de 100 ml., 2.0 ml. de una solución acuosa al 2% de eosina Y y 4.3 ml. de una solución acuosa al 0.15% de azul de metileno.

1.5 Caldo de Triptona
	Composición del medio basal
Triptona o tripticasa 	10,0 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

Disolver la triptona en 1 litro de agua destilada estéril, poner en tubos de ensayo en cantidades de 5 ml., ajustar el pH a 6.90.2. Esterilizar durante 15 minutos a 121ºC.

1.6 Medio de Voges-Proskauer (V-P)
	Composición del medio basal
Peptona	7,0 g.	
Glucosa	5,0 g.	
Fosfato dipotásico hidrogenado	5,0 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

Disolver la peptona, glucosa y fosfato dipotásico en 800 ml. de agua destilada estéril a fuego suave, enfriar y completar un volumen de 1 litro. Poner en tubos de ensayo un volumen de 10 ml. y esterilizar por 15 minutos a 121ºC. El pH debe ajustarse a 6.90.2.

1.7 Caldo Citrato de Koser
	Composición del medio basal
Fosfato hidrgenado de sodio y amonio	1,5 g.	
Fosfato dipotásico hidrogenado	1,0 g.	
Sulfato magnésico	0,2 g.	
Citrato sódico	3,0 g.	
Agua destilada estéril	1000,0 ml.	

Disolver los componentes, en agua destilada estéril completando un volumen de 1000 ml., ajustar el pH 6.8. Vertir en tubos de ensayo en volúmenes de 10 ml. y esterilizar por 15 minutos a 121ºC.

1.8 Agar de recuento en placa (ARP)
	Composición del medio basal
Triptona	5,0 g.	
Extracto de levadura	2,5 g.	
Glucosa	1,0 g.	
Agar	15,0 g.	
Agua destilada	1000,0 ml.	

Disolver los componentes en agua destilada estéril completando un volumen de 1000 ml. Esterilizar por 15 minutos a 121ºC. Ajustar el pH final a 7.00.1.

1.9 Reactivos Test Voges-Proskauer (V-P)
	Composición del medio basal
Solución 1		
Alfa naftol	5,0 g.	
Alcohol (absoluto)	100,0 ml.	
		
Solución 2		
Hidróxido Potásico	40,0 g.	
Agua destilada	100,0 ml.	

Efectuar el test de Voges-Proskauer (V-P) a temperatura ambiental para transferir 1 ml. de cultivo de 48 hr. a un tubo de ensayo y agregar 0.6 ml. de alfa naftol y 0.2 ml. de KOH al 40%, agitar al agregar cada solución. Para intensificar y acelerar la reacción, agregar unos pocos cristales de creatina para mezclar. Leer los resultados 4 horas después de agregados los reactivos. El desarrollo de una coloración rosada indica positividad a la prueba.

DETERMINACIÓN DE COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA COLI

PRESUNTIVO

25 g de muestra
225 ml de solución peptona

Técnica SERNAPESCA – Actualización Directiva 20-83-05 Enero 1992

E. coli

 Agar Levine EMB
24 hrs. a 35ºC

IMVIC

Coliformes Fecales

Coliformes Totales

+

+

Caldo EC
24 hrs. a 44.5  0.2ºC

Caldo Lactosa BVB
48 hrs a 35  0.5ºC

CONFIRMATIVO

NMP (333)
Caldo Lauril Sulfato Triptosa
48  2 hrs. a 35  0.5ºC