INSTRUCTIVO DE ANÁLISIS
DETERMINACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

ALCANCE Y CAMPO DE APLICACIÓN

REFERENCIAS

FDA. Bacteriological Analytical Manual. 7ª Edición. 1992.

DETERMINACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
	La determinación de C. perfringens contempla las siguientes etapas:
1.- Siembra en un medio selectivo.
2.- Confirmación por traspaso a medios específicos.

I.- PROCEDIMIENTO:
1.- Preparación de la muestra:
	Homogenizar 25 g de muestra en 225 ml de agua peptonada diluida (dilución 1:10) (anexo II, Nº3) en jarra esterilizada durante 1 a 2 min. a baja velocidad. Obtener un homogenizado uniforme con la menor cantidad de aire posible.

	Utilizando la dilución 1:10, hace diluciones seriadas desde 10-1 a 10-6 transfiriendo 10 ml a 90 ml de blanco de dilución peptona. Mezclar cada dilución cuidadosamente por agitación suave antes de cada transferencia.

2.- Siembra en medio selectivo:
	Distribuir 6 a 7 ml de agar TSC sin yema de huevo (anexo II, Nº1) en placas Petri de 100 ´ 5 mm, hasta completar un total de 10 placas. Cuando el agar esté solidificado, etiquetar las placas y transferir asépticamente 1 ml de cada dilución en el centro de una placa del agar. Sembrar por duplicado. Poner 15 ml adicionales de agar TSC sin yema de huevo en la placa y mezclar con el inóculo rotando la placa suavemente.

	Existe una forma alternativa de siembra, de elección para alimentos que contienen otro tipo de organismos sulfitoreductores, que consiste en esparcir 0,1 ml de cada dilución con varilla de vidrio, en placas con agar TSC con emulsión de yema de huevo (anexo II, Nº1).

	Luego que el inóculo es absorbido por el agar (alrededor de 5 min.) adicionar 10 ml de agar TSC sin yema de huevo. Cuando el agar se solidifica, colocar las placas en jarras de anaerobiosis. Establecer condiciones de anaerobiosis e inocular a 35ºC por 20 a 24 horas. (El agar TSC con emulsión yema de huevo se incuba 24 horas). Luego de la incubación, sacar las placas de la jarra y seleccionar para el recuento, aquellas que contengan entre 20 y 200 colonias. Las colonias de C. perfringens en el medio con yema de huevo son negras con un halo opaco de 2 a 4 mm producto de una actividad lecitinasa. Usando un contador de colonias Quebec, con un papel tisú blanco sobre el área de conteo, contar las colonias negras y calcular el número de células clastridiales/g de alimento. Reservar las placas para los test de identificación.

	Preparar caldo de hígado triturado (anexo II, Nº2) para inoculación por calentamiento durante 10 min. en agua hirviendo o flujo de vapor y enfriar rápidamente sin agitación. Inocular 3 ó 4 tubos de caldo con 2 ml de homogenizado 1:10. Incubar los tubos 24 a 48 horas a 35ºC en incubadora estándar. Ignorar si los recuentos en placa de C. perfringens viables son positivos.

3.- Confirmación (test presuntivos):
	Seleccionar 10 colonias típicas de C. perfringens del agar TSC con yema de huevo e inocular cada una en un tubo con caldo tioglicolato (anexo II, Nº4) desairado y enfriado. Incubar en incubadora estándar por 18 a 24 horas a 35ºC. Examinar cada cultivo mediante tinción Gram y chequear su pureza.

	C. perfringens corresponde a un bacilo Gram (+) corto y delgado. Si hay evidencia de contaminación, sembrar el cultivo contaminado en agar TSC con yema de huevo e incubar en jarra anaeróbica por 24 horas a 35ºC. La superficie de las colonias de C. perfringens es de color amarillo grisáceo con halo opaco de 2 a 4 mm producido por actividad lecitinasa. Este procedimiento se utiliza además para el aislamiento de C. perfringens del caldo hígado triturado cuando los organismos no son detectados por siembra directa en el agar TSC.

	Test presuntivo fierro-leche: Incubar medio fierro-leche modificado (anexo II, Nº5) con 1 ml de cultivo del medio tioglicolato e incubar a 46ºC en baño de agua. Después de 2 horas, chequear cada hora para detectar la producción de “fermentación tormentosa”. Esta reacción se caracteriza por una coagulación rápida de la leche seguida por el desmembramiento del coagulo formando una masa esponjosa la que normalmente sobresale de la superficie del medio. Remover los tubos positivos para prevenir el vaciamiento de su contenido en el baño de agua. Por este motivo no se recomienda utilizar tubos cortos para este test. Los cultivos que no producen la reacción en un período de 5 horas no corresponderían a C. perfringens. Algunas cepas ocasionalmente pueden requerir 6 horas o más, pero el resultado puede ser cuestionado y debe ser confirmado por test posteriores. Algunas cepas de C. baratii reaccionan de esta forma, pero esas especies pueden ser diferenciadas por su capacidad de licuar la gelatina en el medio lactosa-gelatina. La rapidez con que se produce la “fermentación tormentosa” depende de la cepa y la población inicial. Por ello solamente los crecimientos activos son apropiados para esta prueba.

4.- Confirmación definitiva:
	Inocular en profundidad los medios motilidad-nitrato (anexo II, Nº6) y lactosa-gelatina (anexo II, Nº7) con 2 asadas del cultivo puro del medio tiglicolato fluido o una porción de las colonias aisladas en el medio TSC. Incubar repetidamente el medio lactosa-gelatina para asegurar una adecuada inoculación, y luego lavar en recipiente con agua caliente previo el flameo para evitar salpicaduras.
	Incubar los medios inoculados 24 horas a 35ºC. Examinar el medio lactosa gelatina para detectar la presencia de gas y cambio de coloración de rojo a amarillo, lo que indica la producción de ácido. Enfriar los tubos 1 hora a 5ºC y detectar la licuefacción de la gelatina. Si el medio se gelatiniza, incubar 24 horas adicionales a 35ºC y examinar la licuefacción de la gelatina.

	Inocular caldo de esporulación (anexo II, Nº8) con 1 ml de cultivo en el medio tioglicolato e incubar 24 horas a 35ºC. Preparar tinción Gram a partir de los cultivos esporulados y observar al microscopio para detectar la presencia de esporas. Almacenar los cultivos esporulados a 4ºC, para pruebas posteriores.

	C. perfringens no es móvil. Examinar los tubos de medio motilidad-nitrato para determinar el tipo de crecimiento a lo largo de la línea de inoculación. Los organismos no móviles crecen a lo largo de la línea de inoculación. Los organismos móviles generalmente producen un crecimiento difuso en el medio, lejos de la línea de inoculación.

	C. perfringens reduce el nitrato a nitrito. Para testear la reducción de nitratos, adicionar X ml de reactivo A y 0,2 ml de reactivo B (anexo II, Nº9) al cultivo en el medio motilidad-nitrato tamponado. El desarrollo de un color violeta en el período de 5 min. indica la presencia de nitritos. Si el color no se desarrolla adicionar algunos granos de polvo de Zinc y dejar reposar unos minutos. Un test negativo (ausencia de color violeta) luego de la adición del polvo de Zinc, indica que los organismos presentes son incapaces de reducir los nitratos.

	Tabular los resultados de C. perfringens corresponde a bacterias móviles, bacilos Gram (+) que producen colonias negras en el agar TSC, reduce los nitratos a nitritos, produce ácido y gas a partir de la lactosa, y licúa la gelatina en un período de 48 horas. Algunas cepas de C. perfringens producen baja esporulación en el medio específico y pobre acción lecitinasa en el agar TSC con yema de huevo. Los organismos sospechosos de ser C. perfringens que no cumplen con todas las características generales requieren pruebas adicionales para su confirmación.

ANEXOS
I.- Equipos y Materiales:
1.-	Pipetas de 1,0 ml graduadas en 0,1 ml, y pipetas de 10 ml graduadas en 0,1 ml.
2.-	Contador de colonias.
3.-	Homogenizador de alta velocidad, Warning o equivalente, jarras de metal o vidrio de 1 litro con tapa; se requiere una jarra para cada muestra.
4.-	Jarras de anaerobiosis, BBL GasPak, u Oxoid equipadas con sobres generadores de H2+CO2 GasPak y catalizador.
5.-	Incubadora a 35ºC.
6.-	Placas Petri estériles de 15´100 mm.
7.-	Asas de platino de 3 mm id.
8.-	Baño de agua a 46 0,5ºC.

II.- Medios de Cultivos y Reactivos:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Triptosa	15 g	
Extracto de levadura	5 g	
Soytona	5 g	
Citrato amonio férrico (perlas café NF)	1 g	
Metabisulfito sódico	1 g	
Agar	20 g	
Agua destilada	900 ml	

Preparación:
	Calentar con agitación para disolver. Ajustar el pH a 7,6  0,2. Distribuir en porciones de 250 ml en frascos de 500 ml. Autoclavar 15 min. a 121ºC. Mantener el medio a 50ºC previo a su uso. El agar base SPF (Difco) se considera satisfactorio como base.

	Solución D-cicloserina: Disolver 1 g de D-cicloserina (polvo blanco cristalino) en 200 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración y almacenar a 4ºC hasta su uso.

	Medio final: Para preparar pequeñas cantidades de placas, adicionar 20 ml de la solución D-cicloserina a 250 ml de base. Para preparar placas con yema de huevo, adicionar además 20 ml de emulsión de yema de huevo al 50% (preparada del modo que se indica a continuación). Mezclar bien y distribuir en cantidades de 18 ml en placas Petri de 15´100 mm. Cubrir las placas con una toalla y dejarlas secar durante la noche a temperatura ambiente previo a su uso.

	Emulsión yema de huevo al 50%: Limpiar los huevos frescos con una escobilla dura. Remojar los huevos con HgCl2 al 0,1% durante 1 hora. Drenar la solución y reemplazar con etanol 70% y remojar 30 min. Drenar el etanol. Romper los huevos asépticamente y descartar las claras. Remover las yemas con una jeringa estéril o una pipeta de boca ancha. Poner las yemas en un recipiente estéril y mezclar asépticamente con un volumen equivalente de solución salina estéril al 0,85%. Almacenar a 4ºC hasta su uso.

2.- Caldo de hígado triturado:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Hígado fresco de vacuno	500 g	
Peptona	10 g	
K2HPO4	1 g	
Almidón soluble	1 g	
Agua destilada	1litro	

Preparación:
	Moler el hígado en el agua. Calentar hasta ebullición y hervir a fuego lento durante una hora. Enfriar, ajustar el pH a 7,0 y hervir 10 min. más. Filtrar a través de paño para queso eliminando por presión el exceso de líquido. Agregar el resto de los ingredientes y ajustar el pH a 7,0. Agregar agua hasta completar 1 litro. Filtrar a través de un papel filtro tosco. Almacenar el caldo y la carne en forma separada, en congelación. Para preparar tubos de ensayo de 18´150 ó 20´150 mm, poner el hígado triturado en el tubo a una profundidad de 1,2 a 2,5 cm y agregar 10 a 12 ml de caldo. Autoclavar 15 min. a 121ºC.

3.- Agua peptonada:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Peptona	1 g	
Agua destilada	1 litro	

Preparación:
	Autoclavar 15 min. a 121ºC, pH final 7,0 0,2.

4.- Caldo tioglicolato:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
L-cistina	0,5 g	
Agar (granulado)	0,75 g	
NaCl	2,5 g	
Dextrosa	5 g	
Extracto de levadura	5 g	
Triptona	15 g	
Tioglicolato sódico o ácido tioglicólico	0,5 g	
Resazurina, solución sódica (1:1000), fresca	1 ml	
Agua destilada	1 litro	
Preparación:
	Mezclar L-cistina, NaCl, dextrosa, extracto de levadura y triptona con 1 litro de agua. Calentar en calentador a vapor Arnold o en baño de agua hasta que los ingredientes se disuelvan. Disolver el tioglicolato sódico o el ácido tioglicólico en la solución y ajustar el pH de modo que luego de la esterilización sea de 7,1 0,2. Agregar la solución resazurina sódica, mezclar y autoclavar 20 min. a 121ºC. Si se utiliza medio comercial distribuir en porciones de 10 ml en tubos de 16´150 mm y autoclavar 15 min. a 121ºC.

5.- Medio fierro-leche modificado:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
lLeche entera fresca	1 litro	
Sulfato ferroso 7H2O	1 g	
Agua destilada	50 ml	

Preparación:
	Disolver el sulfato ferroso en los 50 ml de agua destilada. Adicionar lentamente 1 litro de leche y mezclar con agitador magnético. Distribuir 11 ml de medio en tubos de cultivo de 16´150 mm. Autoclavar 12 min. a 118ºC. Preparar medio fresco previo a su uso.

6.- Medio motilidad-nitrato tamponado:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Extracto de carne	3 g	
Peptona (Difco)	5 g	
KNO3	1 g	
Na2HPO4	2,5 g	
Agar	3 g	
Galactosa	5 g	
Glicerina (calidad analítica)	5 ml	
Agua destilada	1 litro	

Preparación:
	Disolver todos los ingredientes excepto el agar. Ajustar el pH a 7,30,1. Adicionar el agar y calentar para disolver. Distribuir en tubos de 16´150 ml, en porciones de 11 ml. Autoclavar durante 15 min. a 121ºC. Si el medio no es utilizado en el lapso de 4 horas, calentar 10 min. en agua hirviendo o en flujo de vapor. Enfriar en agua fría.
7.- Medio lactosa gelatina:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Triptosa	15 g	
Extracto de levadura	10 g	
Lactosa	10 g	
Rojo fenol (como solución)	0,05 g	
Gelatina	120 g	
Agua destilada	1 litro	

Preparación:
	Calentar para disolver la triptosa, el extracto de levadura y la lactosa en 400 ml de agua. Suspender la gelatina en 600 ml de agua y calentar a 50 ´º 60ºC, para disolver mediante agitación. Distribuir en porciones de 10 ml en tubos de 16´150 mm con tapa rosca. Autoclavar 10 min. a 121ºC. Si no se utiliza en un lapso de 8 horas, previo a su desairear por calentamiento a 50 ó 70ºC por 2 a 3 horas.

8.- Caldo de esporulación:
Composición:
Compuesto	Cantidad	
Polipeptona	15 g	
Extracto de carne	3 g	
Almidón soluble	3 g	
MgSO4 (anhidro)	0,1 g	
Tioglicolato sódico	1 g	
Na2HPO4	11 g	
Agua Destilada	1 litro	

DETERMINACIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

25 g de muestra
225 ml de agua peptonada diluída

Técnica SERNAPESCA – FDA Bacteriological Analytical Manual 1992

Confirmación
(test presuntivo)

10 colonias típicas
Caldo tioglicolato
18 a 24 hrs. a 35ºC
Tinción Gram

Test Presuntivo fierro leche
46ºC en baño de agua por 2 hrs.
Chequear cada hora

3 ó 4 tubos Caldo Hígado triturado
2 ml del homogeneizado (1:10)
24 – 48 hrs. a 35ºC

0.1	Ml de inóculo
6 ó 7 ml TSC con yema de huevo
(siembra en superficie) (doble capa)
10 ml TSC con yema de huevo
Anaerobiosis
24 hrs. a 35ºC

6 ó 7 ml TSC sin yema de huevo
1 ml de inóculo
15 ml TSC sin yema de huevo 
(doble capa)
Anaerobiosis
24 hrs. a 35ºC

Confirmación
Definitiva

Motilidad nitrato
Lactosa – gelatina
Caldo de esporulación