INSTRUCTIVO DE ANÁLISIS
DETERMINACIÓN DE BACILLUS CEREUS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

DETERMINACIÓN DE BACILLUS CEREUS

	La determinación de B. cereus contempla las siguientes etapas:
1.	Recuento en placas, en agar MYP.
2.	Confirmación mediante pruebas bioquímicas.
	En caso de aquellos alimentos en que se espera encontrar menos de 10 organismos/g se recomienda utilizar la técnica del Número Más Probable (NMP). Lo mismo sucede en el caso de los alimentos deshidratados que presentan un alto contenido de almidón, en los cuales la técnica de recuento en placa no es adecuada.

I.- Procedimiento:

1.- Preparación de la Muestra

	Homogeneizar 50 g de muestra en 450 ml de solución buffer fosfato diluido (Anexo II, Nº2) (dilución 1:10). Mezcla de alta velocidad (18.000 a 21.000 r.p.m.) por minuto.
	Preparar una serie de diluciones desde 10-2 a 10-8 por transferencia de 10 ml de la muestra homogenizada en 90 ml de buffer fosfato diluido (Anexo II, Nº2), mezclando bien previo a cada traspaso.

2.- Recuento en Placa

	Inocular cada dilución por duplicado en agar MYP (Anexo II , Nº1) esparciendo 0,1 ml de la dilución de la muestra con varilla de vidrio esterilizada. Incubar a 30ºC por 24 horas. Las colonias de B. cereus se observan usualmente de color rosado con un precipitado alrededor, indicativo de actividad lecitinasa.
	Tomar 5 colonias sospechosas del agar MYP y transferirlas a agar nutritivo (Anexo II, Nº4) para las pruebas de confirmación.

3.- Número Más Probable

	Inocular series de 3 tubos para NMP con caldo Soya tripticasa-polimixina (Anexo II, Nº3), usando 1 ml del inóculo de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3.. (se debe testear diluciones adicionales si se espera que la población de B. cereus excede 103/g).
	Inocular los tubos 48  2 horas a 30ºC y observar si se desarrolla un crecimiento denso típico de B. cereus. Sembrar por estrías los tubos positivos en placas separadas de agar MYP (Anexo II, Nº1) e incubar 24 - 48 horas a 30ºC.
	Seleccionar una o más colonias rosa-eosina lecitinasa positivas del agar MYP, y transferir a agar nutritivo (Anexo II, Nº4) para realizar los test confirmativos de B. cereus.
	Confirmar los aislados mediante las pruebas descritas a continuación, y calcular el NMP de células de B. cereus/g de muestra, basado en el número de tubos de cada dilución confirmados como positivos.

4.- Confirmación

	Tomar 5 o más colonias sospechosas del agar MYP y transferir a un agar nutritivo inclinado (Anexo II, Nº4) para su confirmación. Incubar 24 horas a 30ºC.
	Preparar tinción Gram a partir del cultivo obtenido y examinar al microscopio. B. cereus se observa como un bacilo Gram (+), en cadenas de largo variable, con esporas helipsoidales centrales o subterminales.
	Transferir una asada de 3 mm de cultivo de cada tendido, a un tubo estéril de 13100 mm, conteniendo 0,5 ml de buffer fosfato estéril y suspender el cultivo utilizando mezclador Vortex. Con la suspención obtenida inocular los siguientes medios confirmatorios:

a) Caldo glucosa-rojo fenol (Anexo II, Nº5)

	Inocular 3 ml del caldo con una asada de 3 mm de cultivo. Incubar los tubos en anaerobiosis 24 horas a 35ºC en jarra anaeróbica GasPak.
	Agitar los tubos y observar si se detecta crecimiento indicado por turbidez y cambio de color del medio de rojo a amarillo, indicador de la producción de ácido a partir de glucosa en condiciones de anaerobiosis.

b) Caldo nitrato (Anexo II, Nº6)

	Incubar 5 ml de caldo con una asada de 3 mm de cultivo. Incubar los tubos 24 horas a 35ºC. Testear la presencia de nitritos, adicionando 0,25 ml de cada reactivo ara nitritos A y C (Anexo II, Nº7) a cada cultivo. El desarrollo de un color anaranjado en el lapso de 10 minutos indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito.
c) Medio VP mo********************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************nexo I, Nº9), y 0,2 ml de hidróxido de potasio 40% (Anexo II, Nº10). Agitar y agregar unos cristales de creatina.
	Observar los resultados luego de mantener el tubo 1 hora a temperatura ambiente. El test se considera positivo si se produce color rosa o violeta.
d) Agar tirosina (AnexoII, Nº11)
	Inocular la superficie de un agar de tirosina inclinado, con una asada de 3 mm de cultivo. Incubar 48 horas a 35ºC. Observar si se produce clarificación del medio alreded********************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************************nto en el caldo lisozima y en el caldo nutritivo control. Incubar los tubos negativos 24 horas adicionales previo a su descarte.
f) Agar MYP (Anexo II, Nº1)

	Esta prueba puede ser omitida si los test iniciales en el agar MYP fueron totalmente claros, sin inferencia de otros microorganismos.
	Marcar el fondo de una placa con agar MYP dividiéndola en 6 a 8 secciones iguales y etiquetar cada porción. Inocular un área premarcada de 4 cm2 del agar, tocando suavemente la superficie con una asada de 2 mm del cultivo (de esta forma se pueden testear 6 o más cultivos en una sola placa de agar). Dejar que el inóculo se observa completamente y luego incubar 24 horas a 35ºC.
Examinar las placas para detectar producción de lecitinasa indicada por una zona de precipitación alrededor del crecimiento. El manitol no es fermentado por el aislado si las colonias y el medio a su alrededor se torna rosa eosina (el color amarillo indica que se ha producido ácido a partir de manitol). Las colonias de B. cereus son comúnmente lecitinasa positivas y manitol negativas en el agar MYP.

Registro de los resultados obtenidos en los test confirmativos:

	Se deben considerar tentativamente como B: cereus los aislados que:
1)	Producen grandes varillas Gram(+), con esporas en las que no sobresale el esporangio.
2)	Producen lecitinasa y no fermentan el manitol en el agar MYP.
3)	Crecen y producen ácido a partir de glucosa en condiciones de anaerobiosis.
4)	Reducen el nitrato a nitrito (algunas cepas pueden ser negativas).
5)	Producen acetil-metil-carbinol (VP positivas).
6)	Descomponen la L-tirosina.
Crecen en presencia de 0.001% de lisozima.

ANEXOS

I.- Materiales y Equipos:
1.	Equipos y materiales para preparación de homogenizado.
2.	Pipetas de 1, 5 y 10 ml, graduadas en 0,1 ml.
3.	Varillas de vidrio para siembra de 3-4 mm de diámetro y extremo de 45-50 mm de área.
4.	Incubadoras a 30  2ºC y 35  2ºC.
5.	Contador de colonias
6.	Lápiz marcador.
7.	Quemadores Bunsen, grandes y pequeños.
8.	Asas Nº 24 de platino o niquel-cromo de 2 mm y 3 mm.
9.	Mezclador Vortex.
10.	Microscopio, portaobjetos y cubreobjetos.
11.	Tubos de cultivos de 13  100 mm estériles.
12.	Tubos de ensayo de 16  125 mm.
13.	Botellas de 3 oz estériles.
14.	Jarras de anaerobiosis, BBL GasPak; con sobres generadores de H2 + CO2 y catalizador.
15.	Baño de agua a 48-50ºC.
16.	Placas Petri estériles de 15  100 mm.

 II.- Medios y Reactivos:
1.- Agar manitol yema de huevo polimixina MYP
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Extracto de carne	1 g	
Peptona	10 g	
Manitol	10 g	
NaCl	10 g	
Rojo fenol	0,025 g	
Agar	15 g	
Agua destilada	900 ml	

	Preparación:
	Calentar agitando para disolver el agar. Ajustar el pH de modo que luego de la esterilización sea de 7,2  0,2. Distribuir en porciones de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 50 ml. Autoclavar 15 min. a 121ºC. Enfriar a 50ºC.
	Solución Polimixina B, 0,1%: Disolver 500.000 unidades de sulfato de polimixina B en polvo, en 50 ml de agua destilada estéril. Almacenar en botellas de 85 ml a 4ºC.
	Emulsión de yema de huevo, 50%: Limpiar los huevos frescos con una escobilla dura. Remojar los huevos en HgCl2 al 0,1% durante 1 hora. Drenar la solución y reemplazar con etanol al 70% y remojar 30 min. Drenar el etanol. Remojar los huevos asépticamente y descartar las claras. Remover las yemas en un recipiente estéril y mezclar asépticamente con un volumen equivalente de solución salina estéril al 0,85%. Almacenar a 4ºC hasta su uso.
	Medio final: A 225 ml de medio base adicionar 2,5 ml de solución de polimixina B y 12,5 ml de emulsión de yema de huevo. Mezclar y distribuir en porciones de 18 ml en placas Petri estériles de 15  100 mm. Secar las placas a temperatura ambiente durante 24 horas previo a su uso.

2.- Solución buffer fosfato (Butterfield)
	Solución stock.
Composición:
Compuesto	Cantidad	
KH2PO4	34 g	
Agua destilada	500 ml	

	Preparación:
	Ajustar el pH a 7,2 con NaOH 1N. Llevar el volumen a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15 min. a 121ºC. Almacenar en refrigeración.
	Blancos de dilución: Tomar 1,25 de la solución stock y llevar el volumen a 1 litro con agua destilada. Distribuir en botellas de 90 ó 99  1 ml. Esterilizar 15 min. a 121ºC.
	Para esta determinación se requiere que la solución sea esterilizada en botellas alcanzando un volumen final de 450 5 ml y 90  2 ml.

3.- Caldo soya tripticasa polimixina
	Caldo soya tripticasa.
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Peptona tripticasa	17 g	
Peptona fitona	3 g	
NaCl	5 g	
K2HPO4	2,5 g	
Glucosa	2,5 g	
Agua destilada	1 litro	

	Preparación:
	Calentar con agitación suave para disolver. Distribuir porciones de 15 ml en tubos de 20  150 mm. Autoclavar 15 min. a 121ºC.
	
Solución Polimixina B, 0,15%: Disolver 500.000 unidades de sulfato de polimixina B en polvo estéril, en 33,3 ml de agua destilada estéril. Almacenar la solución en botellas de 85 ml a 4ºC.
	Medio completo: Previo a su uso adicionar 0,1 ml de la solución de sulfato de polimixina B al 0,15% estéril a 15 ml de medio y mezclar.

4.- Agar nutritivo
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Extracto de carne	3 g	
Peptona	5 g	
Agar	15 g	
Agua destilada	1 litro	

	Preparación:
	Calentar a ebullición para disolver los componentes. Distribuir en tubos o frascos. Autoclavar 15 min. a 121ºC. pH final 6,8  0,2.
	Agar nutritivo para B. cereus: Para agar inclinado, preparar el agar nutritivo y disponerlo en porciones de 6,5 ml en tubos de 16  125 mm con tapa rosca. Autoclavar 15 min. a 121ºC. Inclinar los tubos antes de que el medio se solidifique. Para placas, distribuir en porciones de 100 a 5000 ml en botellas o frascos y autoclavar. Enfriar a 50ºC y distribuir 18 a 20 ml en placas Petri estériles de 15  100 mm. Secar las placas 24 a 48 horas a temperatura ambiente antes de usarlas.

5.- Caldo glucosa rojo fenol
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Peptona proteosa Nº3	10 g	
NaCl	5 g	
Extracto de carne (opcional)	1 g	
Dextrosa	5 g	
Rojo fenol (7,2 ml solución 0,25%)	0,018 g	
Agua destilada	1 litro	

	Preparación:
	Distribuir porciones de 2,5 ml en tubos de 13  100 mm. Autoclavar 10 min. a 118ºC. pH final 7,4  0,2.

6.- Caldo nitrato
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Extracto de carne	3 g	
Peptona	5 g	
KNO3 (libre de nitritos)	1 g	
Agua destilada	1 litro	

	Preparación:
	Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos de 16  125 mm. Autoclavar 15 min. a 121ºC. pH final 7,0  0,2.

7.- Reactivos para la detección de nitritos

A) Reactivo ácido sulfanílico:
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Ácido sulfanílico	1 g	
Ácido acético 5N	125 ml	

C) Reactivo  - naftol:
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
 - naftol	1 g	
Ácido acético 5N	200 ml	

	Para preparar el ácido acético %N, adicionar 28,75 ml de ácido acético glacial a 71,25 ml de agua destilada.
	Almacenar los reactivos en botellas de vidrios color ámbar con tapa. Para realizar el test, adicionar 0,1 a 0,5 ml de los reactivos A y C al cultivo desarrollado en medio líquido o semisólido.
	El desarrollo de un color naranja con los reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. La reacción debe ser registrada en forma inmediata ya que el color tiende a desaparecer luego de algunos minutos. Si no se produce coloración, testear la presencia de nitrato adicionado una pequeña cantidad de polvo de Zinc. Si se desarrolla color significa que el nitrato no ha sido reducido.

8.- Medio VP modificado

	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Peptona proteosa	7 g	
NaCl	5 g	
Dextrosa	5 g	
Agua destilada	1 litro	

	Preparación:
	Disolver los ingredientes en agua y ajustar el pH si fuese necesario. Distribuir porciones de 5 ml en tubos de 20  150 mm. Autoclavar por 10 min. a 121ºC. pH final 6,5  0,2.

9.- Solución  - naftol

	Composición:
Compuesto	Cantidad	
 - naftol	5 g	
alcohol (absoluto)	100 ml	

10.- Hidróxido de potasio 40%
	Composición:
Compuesto	Cantidad	
Hidróxido de potasio	40 g	
agua destilada hasta completar 100 ml		

11.- Agar tirosina

	Base: Preparar agar nutritivo. Distribuir en porciones de 100 ml en botellas de 170 ml. Autoclavar 15 min. a 121ºC. Enfriar a 48ºC.
	Suspención de tirosina: Suspender 0.5 g de L-tirosina en 20 ml de agua destilada, en un tubo de cultivo de 20  150 mm. Mezclar cuidadosamente con un mezclador Vortex. Autoclavar 15 min. a 121ºC.
	Medio final: Combinar 100 ml de medio base con la suspención de tirosina estéril. Mezclar cuidadosamente invirtiendo la botellas 2 a 3 veces. Asépticamente distribuir 3,5 ml en tubos de 13  100 mm mezclando frecuentemente. Inclinar los tubos y enfriar rápidamente para prevenir la separación de la tirosina.

12.- Caldo lisozima
	Base: Preparar caldo nutritivo. Distribuir porciones de 99 ml en botellas de 170 ml. Autoclavar 15 min. a 121ºC. Enfriar a temperatura ambiente previo a su uso.
	Solución de lisozima: Disolver 0.1 g de lisozima en 65 ml de HCl 0,01N. Calentar a ebullición por 20 min. Diluir a 100 ml con HCl 0.01N estéril.
	Alternativamente, disolver 0,1 g de lisozima en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración a través de una membrana de 0,45 m. Testear par determinar esterilidad previo a su uso. Adicionar 1 ml de solución de lisozima a 99 ml de caldo nutritivo. Mezclar y distribuir en porciones de 2,5 ml en tubos estériles de 13  100 mm.