Brasil,
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A reação química que transforma o N2 atmosférico em amônia (processo de Harber-Bosch) exige temperatura e pressão muito elevadas para romper a ligação tripla covalente entre os dois átomos de nitrogênio. Industrialmente, a redução do nitrogênio à amônia consome energia de fontes não renováveis, como o petróleo. A nitrogenase, enzima responsável pela FBN, é capaz de promover a mesma reação à temperatura ambiente e pressão normal, utilizando energia proveniente de processos foto e quimiossintéticos ou obtidos a partir de carboidratos (provenientes da fermentação ou respiração) e armazenada sob a forma de ATP.
A FBN, em todos os sistemas conhecidos, ocorre com a participação do complexo enzimático nitrogenase, de Fe, Mg, Mo e de energia biológica (ATP).
A nitrogenase é constituída por dois componentes protéicos. O componente 1 é uma proteína tetramérica formada por 2 subunidades alfa e beta, com peso molecular entre 200.000 e 250.000 Da, contendo 2 átomos de Mo e aproximadamente 33 átomos de Fe, sendo conhecido como Mo-Fe proteína. O componente 2 é um dímero protéico constituído de duas subunidades gama, com peso molecular entre 57.000 e 72.000 Da, contendo 4 átomos de Fe, sendo conhecido como Fe proteína. Este componente transfere elétrons para a Mo-Fe proteína e por isto é chamado de nitrato redutase. Os dois componentes da nitrogenase podem ser separados, mas isoladamente não são capazes de reduzir o nitrogênio.
A energia fornecida
ao sistema enzimático sob a forma de ATP é produzida a partir
da oxidação de substratos que podem ser provenientes da fotossíntese
ou então de substratos disponíveis no ambiente.
A flavodoxina e a ferredoxina são doadores de elétrons para
a nitrogenase in vivo. Estas substâncias recebem elétrons do
NADH, o qual é reduzido a partir da oxidação de compostos
de carbono, via cadeia respiratória ou via metabolismo anaeróbico.
Além do nitrogênio, o complexo da nitrogenase é capaz de doar elétrons a uma série de outros substratos como óxido nitroso, acetileno, cianeto, metil isocianeto e também prótons. O próton e o óxido nitroso atuam como inibidores competitivos do nitrogênio. Tem sido postulado que estes três substratos são capazes de interagir com a nitrogenase utilizando o mesmo centro ativo. Por outro lado, cianeto e metil isocianeto são inibidores competitivos entre si, porém não competem com o nitrogênio, o que indica que os mesmos atuam em local diferente do centro que apresenta afinidade pelo nitrogênio.
O monóxido de carbono é um inibidor não competitivo da maioria dos substratos da nitrogenase. No entanto, ele não apresenta nenhum efeito sobre a transferência de elétrons para os prótons, sendo que a evolução do hidrogênio permanece inalterada na presença do monóxido de carbono. Esse fato indica que a evolução do nitrogênio não deve ocorrer no mesmo sítio da nitrogenase, que apresenta afinidade pelo mesmo.
A sensibilidade da nitrogenase ao oxigênio, que pode destruir irreversivelmente a enzima, representa um grande problema de ordem fisiológica para a maioria dos microorganismos diazotróficos, com exceção daqueles capazes de efetuar metabolismo anaeróbico. Entretanto, como o metabolismo aeróbico é energeticamente mais eficiente que o anaeróbico, os microorganismos desenvolveram várias estratégias para proteger a nitrogenase do oxigênio, através da proteção respiratória, produção de exapolissacarídeos, proteção conformacional da nitrogenase, heterocistos e associações com outros organismos.
Em microorganismos simbiontes aeróbicos que são altamente especializados, ocorrem dois mecanismos para proteger a nitrogenase da ação do oxigênio. No primeiro, as células do córtex, perto da superfície externa dos nódulos, forma uma barreira à difusão do O2. O segundo componente contra o O2 nos nódulos é a leg-hemoglobina, proteína cuja função é transportar o O2, liberando pequenas quantidades deste para a respiração, em concentrações nunca prejudiciais à nitrogenase, devido a sua alta afinidade com o oxigênio.
a. Funcionamento da nitrogenase
A dinitrogenase redutase recebe o elétron fornecido pelo NADH. O elétron adquirido deverá então ser transportado para a dinitrogenase. Esta transferência de elétrons necessita de energia (2 ATP para cada elétron transferido). A Fe-proteína ligada ao ATP, especificamente Mg-ATP torna-se mais negativa e então é capaz de reduzir a Mo-Fe proteína. O elétron que alcança a dinitrogenase se localiza junto ao molibdênio, permitindo a ligação entre o nitrogênio molecular e aquele átomo. As evidências indicam que o molibdênio é o centro ativo da nitrogenase. Um novo elétron percorre o mesmo caminho do primeiro, até ser capaz de propiciar um novo grau de redução ao nitrogênio. A redução ocorre em etapas gradativas, até haver a formação da amônia, a qual é liberada e seguirá a rota metabólica característica de cada microorganismo. Resumidamente, ao observamos todo esse processo, veremos que existem duas reações envolvidas: óxido-redução e transferência de elétrons.
b. Custo energético da FBN
A FBN é um processo que consome muita energia, utilizada para romper as triplas ligações que conferem grande estabilidade à molécula de nitrogênio. Os elétrons disponíveis não são destinados somente ao nitrogênio, sendo parte deles utilizados na produção de hidrogênio. Esta produção de H2 pela dinitrogenase indica uma ineficiência do sistema, uma vez que se consome elétrons e ATP's para formar hidrogênio. Parte dessa energia perdida com a evolução do H2 pode ser recuperada pela ação da hidrogenase, gerando ATP. AS estirpes que possuem essa enzima (denominadas Hup +) são mais eficientes, pois ocorre incremento na atividade da dinitrogenase. Além desta função de economia energética, há evidências de mais duas funções exercidas pela hidrogenase: proteção respiratória pela remoção do O2 do ambiente e prevenção da inibição da atividade da dinitrogenase pelo H2 evoluído.
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