Leon Kennedy O ex-policial da RPD que enfrentou o perigo em meio aos zumbis de Raccoon City agora é um agente dos Estados Unidos, encarregado de proteger a família presidencial. Exatamente no dia que começaria a proteger a filha do presidente, Ashley Graham, Leon tem a missão de resgata-la da misteriosa seita religiosa que a seqüestrou enquanto voltava da faculdade. Mas uma mulher cruza seu caminho na saga em Pueblo, Espanha. Quem seria e o que estaria fazendo ali? Não se sabe, apenas que a saudade que Leon sentia de Ada Wong, desaparecida há muito tempo, era grande e novamente foi despertada...

Ashley Graham Ashley Graham foi raptada pela seita Los Iluminados para que o líder, Osmund Saddler, pudesse dominar o mundo, começando pelos Estados Unidos. E esta é a razão do seqüestro. O parasita desenvolvido pelos antepassados do oitavo senhor do reinado de Pueblo, Ramón Salazar, foi injetado na filha do presidente, e agora ela pode ser controlada por Saddler e Salazar como marionete... Ela precisa correr contra o tempo e eliminar o parasita de seu corpo antes que seja tarde demais.

Ada Wong Ela não morreu como ficou subentendido em Resident Evil 2! Ada está de volta, desta vez tentando executar uma missão misteriosa a mando de Wesker... Será mesmo? Ada trabalha para uma agência secreta, e se envolver em um trabalho com Wesker foi apenas um rótulo para completar seus reais objetivos - investigar as atividades de Lord Saddler quanto à sua seita religiosa. A ordem que Leon tem que ser morto é dada... Será que Ada seguirá as ordens de Wesker dessa vez?

Luis Sera Luis Sera é um ex-policial da CIA. O misterioso espanhol conhece o parasita que infectara todos que faziam parte de Los Iluminados e até faz pesquisas sobre ele, mas seus reais objetivos são desconhecidos. Acaba se envolvendo em um plano com Ada Wong - mulher que finge trabalhar para Albert Wesker - para conseguir amostras de las Plagas quando descobre que as intenções de Saddler em contrata-lo como pesquisador não eram das melhores. Também toma conhecimento que o parasita foi injetado em Leon e Ashley e parece tentar ajuda-los.

Jack Krauser Krauser é um soldado americano que fez treinamento com Leon para que ele se tornasse agente presidencial. Mas seus objetos com relação à Saddler são desconhecidos. A única coisa que se tem conhecimento é que Krauser primeiramente foi enviado por Wesker para acabar com Leon e que, ao se infiltrar na gente de Saddler, acaba sendo seduzido pelo poder de las Plagas e injeta o parasita em seu próprio corpo. Agora, mais poderoso, ele quer matar o agente e seguir as ordens de sua agência.

Bitorez Mendez Manda-chuva da vila, Mendez controla os habitantes do lugar. O alcaide parece incomodado com a presença de Leon na vila. Em determinado momento, menciona algo para Leon... "Em suas veias corre o mesmo sangue que o nosso" O que será que ele quis dizer com tal frase? Não se sabe até certo momento... Mas Mendez pode se tornar uma pedra no sapato de Leon para que este consiga sair de Pueblo com Ashley em paz.

Osmund Saddler Líder da seita religiosa da região, Saddler, junto com Ramón Salazar, ressurgiu las Plagas que estavam enterradas no subsolo do castelo do lugar. Seu plano, depois de seqüestrar Ashley Graham e injetar na mesma o parasita, é envia-la de volta para os Estados Unidos e fazer uma "festa de mil demônios" - como Saddler mesmo disse-, para que começasse dominando o mundo pelo país. Mas não será assim tão fácil, ele precisa se desfazer de Leon para que tudo corra nos conformes, injetando nele o parasita e até mandando, posteriormente, alguém para mata-lo. Quem seria? Jack Krauser. Mas o agente não se deixará perder, fazendo com que o plano de Saddler não seja concluído como ele imaginava.

Ramon Salazar "Oitavo senhor da magnifíca arquitetura" do lugar, o Castelão Salazar, que ingenuamente acreditou que Saddler usaria o parasita para o bem, ressurgiu las Plagas, mortas pelos seus antepassados. Também era de seu interesse dar fim ou "Sr. Kennedy", já que ele estava atrapalhando os planos de Saddler, a quem Salazar se unira para transformar o mundo em algo melhor - ele pensava. Depois, injetou o parasita nele mesmo, tornando o resgate de Ashley algo um pouco mais difícil para Leon...

Merchant Este enigmático personagem parece ser um Ganado, mas não segue ordens de Mendez, Salazar ou Saddler como os outros. Ele vende armas para Leon. É desconhecido de onde consegue esses itens, mas mesmo assim é um dos personagens mais importantes do jogo. Não basta um filme sobre ele, ou uma informação mais aprofundada para saber disso. Quando precisar acabar com um inimigo, basta encontrar Merchant em vários pontos do jogo. Apesar de tudo, Merchant é vulnerável, podendo ser morto por apenas um tiro ou facada, porém ele reaparecerá em seu outro ponto de venda ou então saindo e entrando novamente na sala onde você o matou.

Albert Wesker Wesker quer ressurgir a Umbrella Corporation, e por isso contrata Ada Wong para conseguir amostras de las Plagas para ajuda-lo nesta árdua tarefa. Leon, uma antiga paixão de Ada... Parecia atrapalhar em alguma coisa em sua missão. Por isso também contratou Jack Krauser para dar fim em Leon... Mas os objetivos de Wesker não serão assim tão fáceis de serem concluídos.