FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
SUBDIRECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO
Maestría en Ciencias
Orientación en Química Analítica Ambiental
Catedrático:
Dr. Víctor Manuel Rosas García
Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N.L., Abril de 2005
La Química Bioinorgánica es una ciencia interdisciplinaria que se auxilia tanto de la Bioquímica como de la Química de Coordinación para alcanzar su objetivo final: estudiar el efecto que tiene la presencia de elementos metálicos en la función que una biomolécula desempeña en un organismo.
Los metales pueden formar compuestos de coordinación con las moléculas biológicas o, como en el caso de los metales alcalinos y alcalinotérreos, pueden estar presentes en su forma iónica libre (coordinados solamente con solvente). La función que desempeñan estos centros metálicos depende no sólo de la geometría y tipo de ligandos de la esfera de coordinación, además hay que tomar en cuenta otros factores cuando el entorno químico de este complejo es complicado.
No obstante el prominente papel que las interacciones no covalentes tienen en las estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias de biomoléculas así como en su actividad biológica, la determinación cuantitativa de sus fortalezas es limitada debido al gran número de interacciones involucradas en los sistemas biológicos. Sin duda, no conviene subestimar el papel que juega la coordinación de ligandos con iones metálicos. Algunos de los esfuerzos encaminados a la evaluación de datos termodinámicos de este tipo de interacciones es el reportado por Rodgers y Armentrout en 2004 cuyo trabajo sienta las bases necesarias para la evaluación de la magnitud de estos tipos de enlaces.
Un ejemplo del sutil juego entre interacciones no covalentes es puesto de relieve por Smith y cols. con respecto al grupo tiolato. El grupo tiolato es una parte integral de la esfera de coordinación de muchas metaloproteínas de zinc. Esta esfera de coordinación se repite en diversas familias de metaloproteínas, pero el papel que desempeña es muy variado. Por ejemplo, en el caso de los dedos de zinc de la familia GATA participa como nucleófilo reactivo mientras que en la proteína reparadora de ADN, Ada, tiene un papel estructural. De lo anterior se desprenden preguntas acerca de cómo dos sistemas con una esfera de coordinación tan similar pueden tener diversos roles, además de cómo uno solo de los grupos tiolato es específicamente reactivo. De acuerdo con Smith y cols. el factor preponderante en la regulación de la reactividad y especificidad de los enlaces de zinc con tiolato son los puentes de hidrógeno N-H---S que se forman de la interacción de los grupos tiolato y el esqueleto amídico de las proteínas que contienen el motivo tipo dedos de zinc.
Los metales desempeñan una gran variedad de funciones en los sistemas biológicos. Pueden participar como elemento estructural que ayuda al pliegue de las proteínas o pueden actuar como centros reactivos o catalíticos en metaloproteínas con función enzimática (metaloenzimas).
La estructura tridimensional de una proteína no queda determinada al azar. Es decir, las proteínas tienen siempre la misma forma en igualdad de condiciones del entorno. La estructura tridimensional se mantiene generalmente gracias a interacciones de tipo débil (efecto hidrofóbico, enlaces de hidrógeno, puentes salinos, puentes disulfuro, entre otros). Una vez sintetizada la proteína en la célula, su estructura química puede variar en muchos sentidos debido a las llamadas modificaciones postraduccionales.
Para describir la estructura de una proteína, utilizamos niveles estructurales establecidos por convención; así, hablamos de estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y, en algunos casos, estructura cuaternaria.
En muchas proteínas no toda la estructura es polipeptídica, sino que aparecen grupos moleculares distintos, llamados grupos prostéticos, los cuales cumplen con funciones muy bien definidas. Las proteínas con grupos prostéticos reciben el nombre de proteínas conjugadas.
La estructura primaria de una proteína es el número y orden en el cual los aminoácidos se unen e incluye la ubicación de los puentes disulfuro.
La estructura secundaria es el ordenamiento local de secuencias de aminoácidos por efecto de interacciones débiles, tales como los puentes de hidrógeno. Las estructuras secundarias incluyen las unidades de hélice alfa regulares, las hojas beta y los giros beta y asas.
Cuando se gira el esqueleto de un polipéptido por una magnitud igual alrededor de cada carbón alfa, se forma una hélice. Los diferentes tipos de hélices formados cuando los giros tienen dirección y extensión diferentes se describen según el número de residuos aminoácidos por vuelta y el paso o distancia por vuelta que la hélice se eleva alrededor de su eje. Los tipos de hélices polipeptídicas presentes en las proteínas, además están limitadas por factores estéricos adicionales y por el número de posibles puentes de hidrógeno e interacciones de Van der Waals que pueden formar y estabilizar un tipo determinado de hélice.
Las hélices alfa tienen ángulos favorables φ y ψ y un patrón de uniones de hidrógeno que les confiere la máxima estabilidad. Las hélices alfa de proteínas contienen de 4 a 50 residuos. Los parámetros relevantes de una hélice alfa son n=3.6 residuos por vuelta y p=0.54 nm. La distancia a lo largo del eje de la hélice que separa átomos equivalentes en las cadenas principales, de los residuos adyacentes es de 0.15 nm. Los grupos R aminoacil se dirigen hacia fuera del eje de la hélice, lo cual reduce al mínimo la interferencia estérica.
La segunda conformación regular presente en la mayor parte de las proteínas es la hoja beta plegada. El término hoja plegada describe su aspecto cuando se le observa con el borde hacia arriba. Los carbones alfa y sus grupos R relacionales alternan entre un plano ligeramente arriba y otro ligeramente debajo de la cadena principal del polipéptido. Las hojas beta tienen ángulos φ y ψ repetitivos, estabilizados con el máximo número posible de uniones de hidrógeno. Los polipéptidos se alinean a lo largo y están estabilizados por puentes de hidrógeno que se forman entre los hidrógenos de los péptidos nitrogenados y los de los carboxilos oxigenados de tiras adyacentes. El esqueleto peptídico de una hoja beta esta casi por completo extendido. Las cadenas adyacentes de polipéptidos de una lámina antiparalela proceden en direcciones opuestas; aquellas de láminas paralelas, en la misma dirección. Para estabilizar las hojas antiparalelas se encuentran ubicados pares alternos de puentes de hidrógeno. Los puentes de hidrógeno que estabilizan cordones paralelos están regularmente espaciados pero angulados transversalmente a través de las tiras.
Las conformaciones asa son estructuras con un ordenamiento irregular con gran importancia biológica. Regiones en asa de tamaño y forma variables constituyen una de las principales características de superficie de las proteínas. Cuando se exponen a solventes ricos en residuos cargados y polares pero que carecen de estructura secundaria regular, las asas en gancho u horquilla se conectan a las hojas beta adyacentes antiparalelas. Con frecuencia, el sitio para interacciones ligando, regiones de asa de estructura primaria y longitud variables forman los sitios de unión de antígenos en los anticuerpos.
Las tiras de hojas beta están conectadas por regiones de polipéptidos que con frecuencia contienen hélices alfa. Estas vueltas invertidas o incuraciones beta afectan cuatro residuos unidos por puentes de hidrógeno en varias formas y se presentan de manera primaria en la superficie de las proteínas.
Se emplean representaciones convencionales simplificadas para exhibir las características estructurales de las proteínas. Los símbolos que se emplean son cilindros para hélices alfa, flechas anchas para tiras beta y listones para las demás estructuras como asas y giros beta.
En muchas proteínas, las formas estructurales secundarias forman grupos reconocibles. Algunos de estos grupos son:
Para una revisión más completa de las estructuras supersecundarias vea las notas de Jon Cooper
La estructura terciaria se refiere a la arquitectura tridimensional de una proteína, las relaciones espaciales de todos los átomos entre sí para dar una conformación específica. Varias interacciones no covalentes estabilizan la conformación de una proteína. Estas fuerzas incluyen puentes de hidrógeno, interacciones hidrófobas, interacciones electrostáticas y fuerzas de Van der Waals.
Un polipéptido puede adoptar un gran número de conformaciones, sin embargo, en solución predominan sólo unas pocas de esas conformaciones. Estas conformaciones resultan favorecidas debido a factores como bloqueo espacial, interacciones coulómbicas, puentes de hidrógeno e interacciones hidrófobas entre otros, aunque el problema de cómo determinar la conformación preferida de una proteína y la ruta energética para llegar a ella no está resuelto, y es una área muy activa de investigación.
Cuando se considera como los metales afectan la estructura y función de una proteína no debemos dejar a un lado la posibilidad de la participación de estos en el plegado de las proteínas. Esto da origen a motivos estructurales tan bien conocidos como los "dedos de zinc".
Un ejemplo donde el metal participa en más de una función es el citocromo c (una proteína conjugada) donde el grupo prostético (grupo hemo que contiene Fe) es esencial tanto en la formación de la estructura tridimensional como en la función catalítica de la proteína.
La catálisis enzimática sigue todas las ecuaciones comunes de la cinética química. Sin embargo, las aceleraciones obtenidas son impresionantes: es común hallar velocidades de reacción 1012 veces mayores que la de la reacción sin enzima catalizadora. Aunque las enzimas aumentan dramáticamente las velocidades de las reacciones, no afectan la constante de equilibrio ni los cambios globales en la energía libre de esas reacciones.
La fijación y catálisis del sustrato se produce en el sitio activo o catalítico de la enzima. Estos sitios catalíticos con frecuencia radican en hendiduras en las enzimas o en la interfase de las subunidades que forman enzimas multiméricas.
Muchas enzimas necesitan, además de su sustrato, una segunda molécula orgánica—conocida como coenzima—sin la cual son inactivas. Las coenzimas se definen como compuestos orgánicos termoestables, de peso molecular bajo, necesarios para la actividad de las enzimas. La mayoría de las coenzimas se unen a las enzimas por fuerzas no covalentes. La mayoría de las enzimas tienen especificidad elevada por sus sustratos, coenzimas y tipo de reacción catalizada. Algunos factores que alteran las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas son la temperatura, el pH, la concentración enzimática y de sustrato y la presencia de inhibidores.
La ecuación de Michaelis-Menten describe los efectos de la concentración de sustrato sobre la actividad de numerosas enzimas. Esta ecuacion surge de un mecanismo sencillo que se ajusta a la mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas. En este modelo la enzima se combina reversiblemente con su sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES) que luego se rompe para formar el producto, hecho que regenera la enzima. El modelo para una molécula de sustrato se muestra a continuación:
k1 k2
E + S ⇄ ES → E + P
k-1
Al aumentar la concentración del sustrato [S], conservando constantes las demás condiciones, la velocidad inicial medida, vi, crece hasta un valor máximo Vmax. La velocidad crece al aumentar la concentración de sustrato hasta que se estabiliza en el punto donde decimos que la enzima está saturada con el sustrato.
La concentración del sustrato que produce la mitad de la velocidad máxima, llamada valor Km o constante de Michaelis se puede determinar experimentalmente graficando vi como función de la concentración de sustrato [S]. Cuando [S] es aproximadamente igual a Km, vi es muy sensible a los cambios en [S] y la enzima está trabajando precisamente a la mitad de su velocidad máxima. De hecho, muchas enzimas poseen valores de Km que se aproximan a la concentración fisiológica de sus sustratos.
La expresión de Michaelis-Menten:
| Vmax[S] | |
| vi = | ---------- |
| Km+[S] |
| Vmax[S] | Vmax[S] | ||
| vi = | ------------- ≈ | ------------- ≈ | K [S] |
| KM + [S] | KM |
| Vmax[S] | Vmax[S] | ||
| vi = | ------------- ≈ | ------------- ≈ | Vmax |
| KM + [S] | [S] |
| Vmax[S] | Vmax[S] | Vmax | |
| vi = | ------------- ≈ | ------------- ≈ | -------- |
| KM + [S] | 2[S] | 2 |
Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturación que no
permiten fácilmente la valoración de Vmax (y
por tanto de Km), cuando la vi es graficada
contra [S], es conveniente reordenar la expresión de
Michaelis-Menten para simplificar la valoración de
Km y Vmax. La ecuación de
Michaelis-Menten puede ser linearizada como sigue:
| 1 | 1 | Km | |
| --- = | --- + | ------------- | |
| V | Vmax | Vmax [S] |
Así, graficando el inverso de la velocidad inicial versus el inverso de la concentración de sustrato, se obtiene la gráfica de Lineweaver-Burk o del doble recíproco, la cual simplifica la evaluación de Km y Vmax.
La química de coordinación trata de compuestos en los que un pequeño número de moléculas o iones denominados ligandos rodean a un ion o átomo metálico central. El enlace ligando-metal a menudo se representa como M:L y es un ejemplo de enlace covalente coordinado en el que ambos electrones provienen de un mismo átomo.
El número de coordinación es el número de ligandos que rodean a un ion o átomo metálico dado. Los valores más comunes son cuatro y seis. El conjunto de ligandos constituye la esfera de coordinación.
La mayoría de los metales en los compuestos de coordinación son metales de transición. Los metales de transición tienen como característica propia la presencia de subcapas d incompletas, ya sea en su estado base o en forma de ion.
Dependiendo del número de átomos donadores presentes en la molécula o ion complejo, los ligandos se pueden clasificar como monodentados, bidentados o polidentados.
Los compuestos de coordinación pueden presentar isomerismo. De esta manera se pueden distinguir los estereoisómeros (incluyen isómeros ópticos o enantiómeros y los isómeros geométricos) y los isómeros estructurales (incluyen los isómeros de coordinación, de ionización y de enlace).
La geometría de la esfera de coordinación depende del número y tipo de ligandos. En la siguiente tabla se presentan las geometrías más comunes de acuerdo al número de coordinación:
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No. coordinación |
Estructura |
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2 |
Lineal |
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3 |
Trigonal |
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4 |
Tetraédrica Plano cuadrada |
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5 |
Bipirámide trigonal Pirámide cuadrada |
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6 |
Octaédrica Prisma trigonal |
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7 |
Bipirámide pentagonal Octaedro monoapicado trigonalmente Prisma trigonal monoapicado tetragonalmnte |
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8 |
Antiprisma cuadrado Dodecaedro de caras triangulares |
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9 |
Prisma trigonal triapicado |
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A lo largo de la historia se han desarrollado varias teorías de enlace que se han aplicado a los compuestos de coordinación con el objeto de describir el enlace covalente coordinado y racionalizar y predecir las propiedades de tales compuestos.
Neville Sidgwick aplicó ideas de ácido y base de Lewis a los compuestos de coordinación. Así, un átomo metálico de transición (ya sea neutro o cargado) actúa como ácido de Lewis, aceptando o compartiendo pares de electrones de las bases de Lewis.
A principios de la década de los sesenta, Ralph Pearson introdujo la idea de ácidos y bases duros y blandos. Los ácidos duros se definen como aceptores de pares de electrones, pequeños, compactos y de elevada carga, mientras que las bases duras son donadores de pares de electrones, pequeños y muy electronegativos. Los ácidos blandos y bases blandas son especies de mayor volumen, difusas y polarizables. Lo fundamental de la idea de los ácidos-base-duros-blandos es que los ácidos blandos se unen, preferentemente, a las bases blandas y los ácidos duros a las bases duras. Esta regla está basada en numerosas observaciones y es útil para predecir la estabilidad relativa de los complejos de metales de transición y otros compuestos. La base teórica hasta ahora propuesta para esta generalización se centra en la idea de que las interacciones duro-duro tienden a ser estabilizadas por fuerzas iónicas de gran intensidad, mientras que las interacciones blando-blando son estabilizadas por enlaces covalentes y/o fuerzas de London o dispersión.
La teoría del campo cristalino, desarrollada en gran medida por los físicos Hans Bethe y John Van Vleck, considera la unión ligando-metal como una interacción puramente electrostática y consiste en examinar el efecto de un campo eléctrico octaédrico, tetraédrico o cuadrado plano de ligandos en la energía de los orbitales atómicos del metal. Esta es una teoría de enlace muy atractiva debido a su simplicidad conceptual.
La magnitud de la energía de desdoblamiento del campo cristalino determina el número de electrones desapareados de un determinado compuesto. La teoría de campo cristalino permite la explicación de las propiedades magnéticas de los compuestos de coordinación. El diamagnetismo es una propiedad inducida de todos los compuestos que resulta de la repulsión de una sustancia por un campo magnético. El paramagnetismo es una propiedad de los compuestos con uno o más electrones desapareados que resulta de la atracción de una sustancia por un campo magnético aplicado.
La teoría de enlace valencia, trabajo de Linus Pauling, considera que el enlace se caracteriza por el traslapamiento de orbitales atómicos o híbridos de los átomos individuales. El modelo utiliza la hibridación de los orbitales de valencia metálicos s, p y d para explicar las estructuras que se observan. A su vez estos orbitales híbridos participan en enlaces covalentes σ con los ligandos. Esta teoría cayó en desuso debido a su incapacidad para explicar diversas propiedades magnéticas, electrónicas y espectroscópicas de estos compuestos de coordinación.
La teoría de orbitales moleculares representa a los orbitales que constituyen una molécula mediante una combinación lineal de los orbitales atómicos de sus átomos constituyentes. Estos orbitales moleculares se extienden sobre todos los átomos de la molécula (están deslocalizados) y están organizados en niveles de energía que explican la estabilidad de las distintas moléculas. Una de las propiedades más llamativas de los compuestos de coordinación es la gran variedad de brillantes e intensos colores que suelen presentar. La teoría de orbitales moleculares permite calcular las energías de las transiciónes electrónicas responsables de la absorción de luz visible. Esta teoría es conceptualmente fácil de entender, pero su aplicación cuantitativa a moléculas poliatómicas es muy abstracta y matemática.
Los citocromos fueron descubiertos por C. MacMunn en 1866 y sus funciones biológicas fueron descritas por D. Keilin en el siglo XX, además, los agrupó en tres clases diferentes: a, b y c, según las bandas características de cada uno.
Cada tipo de citocromo en estado reducido exhibe tres bandas de absorción características en el espectro de luz visible, α, β, y γ o Soret. Estas propiedades espectroscópicas del grupo hemo han hecho a la familia de los citocromos un objetivo bastante recurrente en estudios de metaloproteínas.[4-8]
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El citocromo c es una proteína monomérica pequeña de aproximadamente 100 aminoácidos. La mayoría de los citocromos c contienen 4 hélices con la expuesta al solvente y la formando parte del seno de la proteína. Las hélices también son representadas por El resto de la proteína consiste de caireles y giros. El citocromo c tiene unido un grupo prostético constituido por un grupo El hemo de este citocromo está unido a la proteína por entre el anillo de porfirina y dos residuos de Cys. En estas proteínas, el hierro forma un : está coordinado a cuatro átomos de nitrógeno en el grupo porfirina y los residuos histidina y metionina se encuentran en posición trans uno respecto al otro. El contiene un residuo His axial y dos residuos Cys que forman los enlaces covalentes tioéter con el grupo hemo. El es largo y con forma de J, forma una capa sobre la cara del grupo hemo y dona la metionina axial al grupo hemo. |
En virtud de que los 6 átomos ligandos están fuertemente enlazados al ion metálico, estos ligandos no pueden ser desplazados por otros ligandos, así, los citocromos, a diferencia de otras proteínas, actúan como acarreadores de electrones jugando una parte esencial en los procesos metabólicos. En los citocromos, el hierro está sujeto a rápidas reacciones redox reversibles: Fe3+ + e- ⇄ Fe2+ ecuación (1) que se asocian a la oxidación de moléculas orgánicas.
La azurina es una proteína pequeña de 128 aminoácidos, también llamada cupredoxina. Esta enzima participa en algunos procesos que involucran transferencia electrónica en plantas y bacterias (reducción del grupo nitrilo de la nitriloreductasa en el proceso de desnitrificación disimilatoria). Es una de las proteínas denominadas de cobre azul debido al color azul resultante de la longitud de máxima absorción, aproximadamente a 630 nm, resultado del enlace fuertemente covalente entre el cobre y la cisteína. Adicionalmente tiene un alto potencial de reducción, lo que le provee de un gran poder reductor. La azurina puede asociarse en forma tetramérica
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La azurina tiene una
y ocho
; que se pliegan en una estructura
de
en una estructura de topología de doble llave griega.
En esta proteína, la esfera de coordinación del cobre es mononuclear, de tipo 1. El cobre forma un : está coordinado a dos átomos de nitrógeno ( e ), dos de azufre ( y ) y uno de oxígeno ( ). El enlace entre el átomo de cobre y el azufre de la cisteína es inusitadamente corto (210 pm) y este puede variar cuando el cobre transita entre sus dos estados de oxidación. |
Una característica adicional de esta proteína es que las estructuras cristalinas de las formas apo y holo son idénticas, lo que indica que no necesita a un ion metálico para adquirir su conformación plegada nativa. Además, está demostrado en estudios in vitro que el metal de esta metaloproteína mantiene su esfera de coordinación aún en el estado no plegado del polipéptido.
La ferroquelatasa es codificada en el núcleo, sintetizada en el citoplasma y transportada a las mitocondrias, donde su forma activa tiene peso aproximado de 42 kDa. Datos de la especificidad a los sustratos y parámetros cinéticos indican que el mecanismo de catálisis es conservado aunque la especificidad al sustrato varía ligeramente entre las especies.
Las ferroquelatasas de mamíferos utilizan Fe2+ como sustrato metálico y utilizan un mecanismo ordenado de reacción de dos pasos: enlace de los sustratos - el fierro se enlaza antes que la porfirina, la cual sufre una distorsión alcanzando una conformación no planar que facilita la metalación - y metalación del macrocilo con remoción de dos protones de los nitrógenos pirrólicos. Los detalles del mecanismo enzimático de la ferroquelatasa humana, junto con la naturaleza de los aminoácidos específicos involucrados en la catálisis, era desconocida hasta que Sellers y cols. estudiaron el papel que tienen diversos residuos presentes en el sitio activo. Hicieron uso de la mutagénesis dirigida, de análisis cinéticos y de información estructural para proponer un modelo de metalación y desprotonación de la porfirina. Basados en los resultados, propusieron que el fierro inicialmente se une a D383 y H231 y que este ion es transportado por una serie de residuos conservados (W227 y Y191) hacia el interior de la enzima para llegar al centro catalítico (R164 y Y165). Este sitio de enlace inicial está separado del sitio catalítico. Los resultados muestran que el ion Fe2+ se inserta a la protoporfirina y desplaza dos protones, siendo éste un paso concertado. La metalación del macrociclo profirínico distorsionado puede ocurrir con desprotonación mediada por H263 y el transporte de estos protones hacia fuera del sitio catalítico por los residuos carboxilatos conservados (E343, H341 y D340). Lo anterior es evidente partiendo de las observaciones de que la alteración de la región rica en carboxilos afecta al poder catalítico de la enzima pero no altera la afinidad de la enzima por los sustratos. El modelo implica que, en ferroquelatasa humana, el acceso al sitio activo ocurre por dos vías distintas para los dos sustratos: la porfirina entra al sitio activo desde la superficie de la membrana, mientras que el fierro entra por la superficie de la molécula que está expuesta a la matriz mitocondrial. Además, se encontró que el sitio de coordinación inicial identificado como D383 está localizado en lugar específico para que interactúen los transportadores de fierro con la enzima ferroquelatasa.
El paso terminal de la biosíntesis del grupo hemo es la inserción del ion Fe2+ en la protoporfirina IX para formar protohemo. Este paso es catalizado por la enzima ferroquelatasa.
El cobre es un oligoelemento esencial ya que es el cofactor metálico de diversas enzimas. Su importancia radica en su propiedad redox, la cual es utilizada por diversas enzimas para su función catalítica: acepta y dona electrones y participa en reacciones que implican dismutación, hidroxilación y oxidación. Sin embargo, el cobre es un elemento potencialmente tóxico, dado que en su forma reducida puede directamente actuar con oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ambos presentes en las células, y producir radicales superóxido o catalizar la formación de radicales hidroxilo.
Se ha descrito la actividad de diversos mecanismos fisiológicos destinados a mantener un suministro adecuado del metal y al mismo tiempo controlar su exceso. Estos mecanismos de homeostasis celular de cobre están destinados a controlar la entrada, el almacenamiento (cantidad y localización) y la salida del metal en la célula.
La destinación intracelular de cobre en los sitios catalíticos de las metaloproteínas es un proceso fundamental para el metabolismo celular normal. Se han identificado proteínas, denominadas chaperonas, involucradas en la regulación del cobre intracelular. Estas proteínas presentan una alta afinidad por cobre y tienen una función dual que involucra la transferencia del metal y previenen la existencia de cobre libre intracelular; esto ha sido demostrado en estudios in vivo a través de la transferencia de cobre desde la chaperona Ccs1 hacia SOD1 por Rae y cols. Por medio de la cuantificación de la abundancia de la chaperona, del cobre intracelular y de la cantidad y actividad de la enzima en condiciones fisiológicas, se encontró que la ausencia de Ccs disminuye la relación entre las formas activa y no activa de la SOD1; asimismo, se observó que la cantidad total de cobre celular no es función de la concentración de Ccs, no así la cantidad de cobre libre. Se demostró que la SOD1 permanece inactiva cuando la Ccs está ausente aún a concentraciones celulares de cobre normales. Así, se determinó que las funciones de Ccs son como secuestrador del cobre y como director del cofactor hacia la enzima para activarla. Lo anterior indica que la actividad de las metaloenzimas requiere de la destinación directa del metal mediante la interacción proteína-proteína y no del casual encuentro de átomos en su forma libre.
Numerosas reacciones biológicas comprenden procesos de oxidación. El término oxidación se refiere a la pérdida de electrones en una sustancia con la subsecuente reducción de otra que actúa como aceptor de dichos electrones. En la mayoría de las oxidaciones biológicas, en condiciones aerobias, el aceptor de electrones es el oxígeno molecular; asimismo, muchas oxidaciones biológicas pueden tener lugar acompañadas de una deshidrogenación.
Las oxidasas catalizan la eliminación de hidrógeno de un sustrato usando al oxígeno como aceptor de hidrógeno y formando agua o peróxido de hidrógeno. Los procesos de oxidación y reducción de estas enzimas son complejos y poco se sabe acerca del mecanismo mediante el cual el oxígeno es activado por las enzimas redox; de esta manera, algunos investigadores se han abocado al estudio de los mismos. Estos esfuerzos comprenden la caracterización de los intermediarios de reacción de los procesos biológicos.
En 1999, Wilmot y cols. determinaron mediante cristalografía de rayos X de monocristal las estructuras de tres intermediarios relacionados con la media reacción de oxidación de la amino oxidasa que contiene cobre denominada ECAO (Escherichia coli Amine Oxidase). Esto proporcionó información mecanística detallada acerca de la interacción del oxígeno con la metaloenzima. Los cristales de los intermediarios fueron aislados en condiciones aerobias y anaerobias y sus estructuras fueron resueltas a 2.1 y 2.4 Å. Las estructuras revelaron que el sitio de enlace del dioxígeno es la posición axial de una molécula de agua de la esfera de coordinación del metal. Encontraron además, que el cofactor quinónico TPQ, 2,4,5-trihidroxifenilalaninquinona se regenera en la media reacción de oxidación, a partir de un intermediario con estructura iminoquinónica, mediante la hidrólisis de residuo Asp383 con la transferencia de 2 electrones al dioxígeno y demostraron que este residuo de aminoácido tiene un papel catalítico. Los espectros visibles de la forma reducida de la enzima evidenciaron que ésta puede existir como dos confórmeros: aminoquinol-Cu2+ y radical semiquinónico-Cu+. A pesar de que la forma de aminoquinol es la conformación dominante de la enzima en su estado oxidado nativo, el radical semiquinona-Cu+ es requerido para que el oxígeno molecular se enlace directamente al cobre y que la transferencia electrónica de los dos electrones sea rápida; así, se determinó que la velocidad global de este proceso se ve limitada debido a que la forma dominante de la enzima es como aminoquinol. Se concluyó que, mientras que en la media reacción reductiva el cobre no participa, la reacción de oxidación sí involucra al ion cobre y al oxígeno molecular, produciendo amoniaco, agua oxigenada y la forma reducida de la enzima.
La activación de la molécula de oxígeno por complejos que contienen ion ferroso es de importancia fundamental en biología puesto que las especies de hierro con ligandos oxo terminales están implicadas como intermediarios en varios ciclos catalíticos bioquímicos. Desafortunadamente, existe poca información estructural acerca de este tipo de complejos debido a su inestabilidad, que dificulta su aislamiento. Los esfuerzos por modelar especies oxoférricas mononucleares derivadas de oxígeno molecular son poco comunes debido a que los complejos de Fe3+ tienden a formar especies dinucleares con un ligando μ-oxo. De esta manera, la síntesis y el aislamiento de sistemas biomiméticos podría permitir la investigación de la relación estructura función y el papel de las interacciones no covalentes en la reactividad de los iones metálicos en las enzimas.
MacBeth y cols. reportan la síntesis, el aislamiento y la caracterización de complejos de Fe3+ con ligandos terminales tipo oxo, derivados de dioxígeno. Para lo anterior, se desarrollaron sistemas sintéticos que regulan la estructura y función alrededor de un centro metálico (hierro) usando el ligando tripodal tris[(N'-tert-butilurealato)-N-etil)]aminato. La difracción de rayos X muestra que el metal tiene una esfera de coordinación con geometría bipiramidal trigonal donde el plano trigonal está formado por tres nitrógenos uréicos y el oxígeno oxo está posicionado en trans con respecto al nitrógeno apical. Se encontró que los complejos aislados eran estables debido a que la unidad oxoférrica se encontraba en una cavidad formada por puentes de hidrógeno, lo que permite la regulación de la activación de oxígeno. Estas cavidades comparten propiedades con los sitios activos de las metaloproteínas donde la función está fuertemente correlacionada con la estructura. La similitud entre estos complejos resalta la importancia de los microambientes creados por las interacciones de puentes de hidrógeno en la regulación de las funciones.
El hierro es uno de los metales más abundantes de los sistemas biológicos. Este es necesario para la activación de algunas enzimas o como centro activo de ellas. Así también tiene un papel importante en el transporte de oxígeno. El ion Fe3+ es poco soluble y, en su estado libre, puede ser tóxico debido a la posible catálisis de la producción de radicales hidroxilo y peróxido; así, la difusión del ion libre a través del periplasma no es deseable, para esto es necesaria la presencia de un transportador eficiente.
Las células están dotadas de sistemas de proteínas que pueden transportar los iones metálicos desde el espacio periplásmico hasta el citoplasma, para que estos metales lleguen a las proteínas objetivo. Para todos los transportadores periplasma-citosol, la participación de proteínas periplásmicas, permeasas citoplásmicas y proteínas nucleótidas son críticas en el transporte efectivo de los iones. Se puede inferir que el proceso de transporte involucra interacciones proteína-proteína entre estos componentes. Estas interacciones pueden depender de los cambios conformacionales de las proteínas involucradas.
Una proteína encargada del transporte de fierro en el periplasma es la FbpA. FbpA es una proteína enlazante periplásmica y es crítica en el transporte de fierro entre las membranas externa e interna (espacio perisplásmico). Esta es una proteína característica de las proteínas enlazantes periplásmicas pero es única debido a su función de transportar fierro; es estructuralmente parecida a la familia de las transferrinas (moléculas bilobales que enlazan un catión Fe3+ por cada lóbulo y que sufren cambios conformacionales durante el proceso de la liberación de fierro; estos cambios conformacionales son críticos para el reconocimiento del receptor y la transferencia del fierro). FbpA es casi del tamaño de un lóbulo de transferrina y coordina una molécula de Fe3+ usando el mismo número de residuos aminoácidos y de ligandos aniónicos.
La habilidad para existir en dos formas distintas es característica de la familia de las transferrinas. Los homólogos de FbpA sugieren que estas proteínas tienen cambios conformacionales durante el transporte de fierro. Nowalk y cols. proporcionan evidencia de la existencia de FbpA en dos conformaciones distintas dependiendo de la presencia de hierro. Los estados conformacionales de FbpA pueden tener implicaciones en el reconocimiento de proteínas durante el transporte de fierro entre las membranas y puede explicar cómo estas proteínas funcionan en el contexto del transporte de fierro entre el periplasma y el citosol. Esto es demostrado mediante la síntesis de proteínas mutantes que enlazan metal o no lo enlazan y la evaluación de la sensibilidad a la tripsinisación de las formas apo y holo de la FbpA: el enlace de Fe3+-FbpA disminuye considerablemente la habilidad de la tripsina para romper la proteína. La construcción de mutantes donde se disminuye o se elimine la capacidad para enlazar hierro asegura que la proteína se encuentra en su forma conformacional apo y que sea susceptible a tripsinisación. Los resultados sugieren que el residuo Tir195 está involucrado directamente en el enlace de fierro y que el residuo Tir 264 está involucrado en otras interacciones estructurales que estabilizan la conformación holo de la proteína - como puentes de hidrógeno entre dominios o interacciones que estabilizan la estructura terciaria. Los resultaron soportan la hipótesis de que FbpA asume dos conformaciones estructurales distintas dependiendo de la presencia del metal.
La concentración intracelular de calcio es aproximadamente de 1 × 10-4 mM, 4 órdenes de magnitud inferior al magnesio y 6 menor que el potasio. El ion calcio es un componente estructural esencial en el proceso de biomineralización y actúa como mensajero secundario que controla numerosos procesos celulares como la división y el crecimiento celular, la secreción, transporte iónico, contracción muscular, entre otros.
Las células gliales han sido consideradas como elementos pasivos en el sistema nervioso central pero se sabe que pueden generar respuestas activas incluyendo señales de calcio intracelulares. Estas ondas de calcio pueden constituir un mecanismo de señal extraneuronal en el sistema nervioso central y pueden modular la actividad neuronal; por lo anterior, se ha probado si las ondas de calcio suceden in situ en células gliales.
La retina de rata contiene dos tipos de células gliales: los astrocitos y las células de Müller. Para probar si las ondas de calcio aparecen en este tipo de células gliales, Newman y Zahs determinaron la concentración de calcio en estas células por fluorescencia del indicador Calcium-Green1 cuando eran sometidas a estímulos químicos, eléctricos y mecánicos. Se encontró que la estimulación de los astrocitos incrementa la concentración intracelular de calcio y que este efecto se puede propagar, radial y sincronizadamente, como ondas entre las células vecinas, ya sean astrocitos o células de Müller. La velocidad de propagación de las ondas de calcio prácticamente no varió con el tipo de estímulo sugiriendo que, una vez iniciadas, las ondas se propagan por el mismo mecanismo. Además, se encontró que la velocidad de propagación disminuye a medida que la onda se aleja del punto de estimulación. El incremento de la concentración de calcio en los astrocitos y las células de Müller aparentemente se debe al calcio de los almacenes intracelulares que está mediado por el receptor 1,4,5-trisfosfato inositol (IP3) más que por un influjo extracelular de calcio debido a que las ondas de calcio se observaron aun cuando no hubo calcio extracelular presente y, en contraste, la aplicación de thapsigargin y heparina redujo la respuesta de calcio. La ausencia de cambios de potencial de membrana sugiere que las ondas de calcio no se deben a la activación de los canales iónicos en las células gliales que, aparentemente, tienen influencia en la regulación de potasio y de neurotransmisores.
El diseño de proteínas es una herramienta para la elucidación de las relaciones estructura-plegado-función de proteínas. El diseño de sitios que enlazan calcio en una proteína, que naturalmente no lo hace, contribuye al entendimiento del papel del calcio en los procesos biológicos.
La fortaleza de la selectividad del metal parece estar relacionada con los procesos fisiológicos. El entendimiento de los factores que afectan la afinidad y selectividad de las proteínas por el calcio en los cambios conformacionales dependientes es un paso esencial en el esclarecimiento del proceso de las señales de calcio.
El diseño de sitios para coordinación de calcio está limitado debido a que, por lo general, tiene una esfera de coordinación tipo bipirámide pentagonal u octaedro distorsionados y puede tener números de coordinación variables de 6 a 9 con 1 a 3 moléculas de solvente como ligandos. El número de coordinación más común es 7 y el tipo de átomos ligandos preferentes son oxígenos de carboxilatos, carbonilo o hidroxilos.
Yang y cols. presentan el diseño de un sitio enlazante de calcio en una proteína desprovista de este sitio. La estrategia de diseño toma en cuenta las propiedades de la esfera de coordinación de calcio como el tipo de ligandos, la carga y la geometría de la esfera de coordinación primaria del centro metálico. Se escogió como sitio anfitrión el dominio N-terminal (99 aminoácidos) del receptor de adhesión superficial de células de rata CD2, el cual tiene una estructura de láminas beta con el plegado característico de la familia de las inmunoglobulinas. Para realizar el diseño del sitio de coordinación se realizó un análisis estructural detallado de los sitios probables de coordinación en la proteína. Se escogió la geometría bipiramidal pentagonal para la esfera de coordinación siendo uno de los ligandos una molécula de solvente lo que reduce el impedimento estérico. Se propuso que dos átomos de oxígeno fueran de un ligando bidentado Glu y que las posiciones remanentes fueran ocupadas por oxígenos de residuos como Asp, Asn y Glu. Los criterios de selección además incluyen que el calcio estuviera expuesto al solvente, que la proteína mutante no tuviera una conformación parecida a la proteína normal y que tres o cuatro residuos estuvieran cargados. Se identificó un sitio que involucra 5 mutaciones. Los residuos ligandos son de tres secuencias diferentes con un total de cuatro ligandos cargados. El ligando bidentado Glu80 se localiza en el hilo F mientras que los otros cuatro oxígenos restantes provienen de los hilos F (V78), G (I89 y K91) y del giro flexible BC (F21). Este sitio está próximo a varios residuos aromáticos (Tir81 y Trp32) que permiten el uso de la técnica de transferencia de energía resonante por fluorescencia para monitorizar el enlace de calcio. Se encontró que la constante de disociación de Ca-CD2 es de aproximadamente 40 M y que la proteína exhibe selectividad por calcio frente a magnesio y potasio (constantes de disociación 670 y >10,000 respectivamente) con una afinidad comparable a la de las proteínas extracelulares naturales que enlazan calcio. Esta selectividad también fue estudiada por 1H NMR. Además se utilizaron las técnicas de dicroísmo circular y ICP-MS para determinar la constante de formación de los complejos Ca-CD2, Mg-CD2 y K-CD2, siendo consistentes los resultados. La magnitud de esta selectividad es una de las propiedades más importantes de las proteínas intracelulares para el control de los niveles de calcio y la respuesta a los cambios de las señales debidas a calcio en la presencia de exceso de magnesio y potasio. Los resultados demuestran la factibilidad del diseño de un sitio de enlace de calcio en una proteína anfitrión tomando en cuenta solo propiedades locales de la esfera de coordinación de calcio lo que hace posible entender y manipular los procesos de señales por diseño de proteínas moduladoras de calcio con funciones específicas y afectar su estabilidad.
El selenio es un microelemento esencial para los mamíferos y algunas plantas superiores; su función principal es como componente de la glutatión peroxidasa, la cual protege contra los radicales libres oxidantes que dañan a las células.
El selenio es esencial para la fertilidad de roedores y está implicado en la capacidad de fertilización de ganado y humanos. La deficiencia de selenio está asociada con pérdida de la movilidad, alteraciones estructurales y pérdida de flagelo en espermatozoides; sin embrago, a pesar del conocimiento de su importancia, los detalles de la relación de este elemento y la fertilidad son desconocidos.
Una proteína que contiene selenio es la denominada PHGPx que se encuentra en concentraciones apreciables en espermátidos y tiene actividad enzimática en los testículos postpubertales. En los espermatozoides maduros, el selenio se puede encontrar como constituyente de una estructura – tipo queratina - que envuelve a la hélice de la mitocondria en la parte media del espermatozoide; se ha pensado que forma parte de una proteína rica en cisteína asociada a la mitocondria del espermatozoide (SMCP).
A partir de del conocimiento acerca de la ausencia del codón que sintetiza la SMCP en roedores machos, L Flohé y cols. ("Dual Function of The Selenoprotein PHGPx During Sperm Maturation") se cuestionaron acerca del papel de PHGPx, como proteína estructural, y la explicación de la inestabilidad mecánica de las cápsulas mitocondriales de espermatozoides cuando existe deficiencia de selenio. La metodología experimental seguida consistió de la separación de los componentes de la cápsula mitocondrial de espermatozoides maduros mediante electroforesis con gel de poliacrilamida uni- y bidimensional. Se determinó que uno de los componentes correspondía a PHGPx, la cual constituía alrededor del 50% del contenido total de los componentes de la cápsula, mientras que SMCP no fue detectada. Así también, se realizaron experimentos para regenerar la actividad enzimática de PHGPx, partiendo de la proteína inactiva presente en la cápsula mitocondrial. De esta manera, se determinó que la PHGPx es una proteína con actividad enzimática en espermátidos y es un elemento estructural en espermatozoides maduros, lo que permite la conclusión de que la selenoproteína hidroperoxiglutation peroxidasa fosfolípido (PHGPx) cambia sus características físicas y funciones biológicas durante la maduración de los espermatozoides. Se piensa que la PHGPx inhibe la actividad de los radicales peróxido por medio de dos mecanismos: mediante la actividad enzimática, propia de la proteína, o por la formación de aglomerados de proteína cuando los radicales peróxido atacan a las células en ausencia de glutatión.
El descubrimiento de fierro, cobre y zinc como elementos esenciales para reacciones fisiológicas fue el primer paso fundamental en el campo de la ciencia conocido como Química Bioinorgánica.
La Química Bioinorgánica, o Química Inorgánica Biológica, es la disciplina que se encarga de estudiar las interacciones entre las sustancias inorgánicas y las biomoléculas, el papel de los elementos esenciales en la vida, la respuesta de los organismos a las sustancias inorgánicas tóxicas y el desarrollo de modelos teóricos para la explicación de los temas anteriores, entre otros.
Los iones metálicos pueden desempeñar varias funciones en los organismos, entre las que destacan: centro activo en las enzimas, activación de proteínas, transmisión de señales eléctricas y el plegado de proteínas, por mencionar algunos.
De acuerdo a Bertini y Rosato ("Bioinorganic Chemistry in the Postgenomic Era"), el reto principal de los químicos bioinorgánicos es la explicación de los mecanismos mediante de los cuales suceden los procesos fisiológicos que involucran iones metálicos. Para lograr el entendimiento de estos procesos se requiere de esfuerzos sinergéticos de un número de diferentes disciplinas que incluyen la genética, la biología, la química, la biofísica, la enzimología y más.
Para entender la homeostasis de metales es importante destacar los mecanismos de regulación y transporte de metales (que involucran interacciones proteína-proteína) dedicados a mantener el delicado balance del metal en varios organelos y en el entorno celular; asimismo, se debe considerar el aspecto de toxicidad de los metales y los mecanismos de resistencia celular a la toxicidad de esos metales.
Algunas de las herramientas que sirven a los químicos bioinorgánicos para el estudio de metaloproteínas son: la secuenciación genética, con la cual es posible deducir las secuencias primarias de prácticamente todas las proteínas que un organismo puede producir, y la información estructural tridimensional de estas proteínas, obtenida a partir de análisis espectroscópicos.
Existen varios servidores web que disponen de bases de datos de proteínas; sin embargo, hay muy pocas que ponen atención a la interacción entre los iones metálicos y los residuos de las proteínas que actúan como ligantes. Una base de datos disponible es la Metalloprotein Database que provee información cuantitativa de parámetros geométricos de los sitios de enlace de metal de metaloproteínas y cuyo objetivo principal es ser una fuente de información para el diseño de metaloproteínas y el modelado molecular.
Una de las múltiples funciones de los aminoácidos en las células vivientes es la de servir como unidades monómeras a partir de las cuales se sinteticen cadenas polipeptídicas de proteínas. La mayoría de las proteínas contienen, en proporciones diferentes los mismos 20 aminoácidos. El tipo de aminoácido, el orden en el que se unen y su relación espacial mutua establecen las estructuras tridimensionales y las propiedades biológicas de proteínas simples y son determinantes importantes de la estructura y función de proteínas complejas.
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Nombre |
Símbolo |
Fórmula estructural |
Nombre |
Símbolo |
Fórmula estructural |
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Glicina |
Gli (G) |
Asparagina |
Asn (N) |
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Alanina |
Ala (A) |
Glutamato |
Glu (E) |
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Valina |
Val (V) |
Glutamina |
Gln (Q) |
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Leucina |
Leu (L) |
Arginina |
Arg (R) |
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Isoleucina |
Ile (I) |
Lisina |
Lis (K) |
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Serina |
Ser (S) |
Histidina |
His (H) |
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Treonina |
Tre (T) |
Fenilalanina |
Fen (F) |
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Cisteína |
Cis (C) |
Tirosina |
Tir (Y) |
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Metionina |
Met (M) |
Triptófano |
Tri (W) |
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Aspartato |
Asp (D) |
Prolina |
Pro (P) |
