วิธีมาตรฐานสำหรับการวิเคราะห� (Standard Operating Procedure)

Biochemical Oxygen Demand (BOD)

โดยวิธ� 5 Days Incubation แล� Azide Modification

ปริมาณของออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ในการย่อยสลายสารอินทรีย์ในน้ำภายใต้สภาวะที่มีอากาศ(Biochemical Oxygen Demand (BOD) คื� ค่าบีโอดีบ่งบอกถึงปริมาณความสกปรกของน้ำในรูปของปริมาณออกซิเจนที่ต้องกา� เมื่อน้ำนั้นถูกปล่อยลงสู่แหล่งน้ำธรรมชาต� การหาค่า BOD₅ จะเป็นการหาออกซิเจนที่แบคทีเรียใช้ไปภายใต้การควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วั�

1. ขอบข่ายการทดสอ�

วิธีนี้ใช้ได้กับการทดสอบตัวอย่างน้ำเสียจากชุมชนและน้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรม โดยถ้าจำเป็นจักต้องมีการทำ (seeding) แล� (pretreatment)ที่เหมาะสม

2. ค่าที่รายงานผล(detection limits)

Minimum detection limit เท่ากั� 2 mg/l

3. รายละเอียดการประกันคุณภา�(quality assurance criteria)

3.1 QA limit ขอ� �%ผลต่าง(relative percent difference)� สำหรับ การวิเคราะห์ซ้�(duplicate analysis) เท่ากั� 15%

3.2 ค่� BOD ของตัวอย่า� QC (Glucose-Glutamic acid) ควรมีค่า 198 ± 30.5 mg/l

3.3 ผลต่างของปริมา� DO₀ แล� DO₅ ต้องมีค่าอย่างน้อย 2 mg/l

3.4 ปริมาณ DO₅ ต้องมีค่าอย่างน้อย 1 mg/l

3.5 ผลต่างของปริมา� DO₀ แล� DO₅ สำหรับ Blank ของน้ำเจือจางต้องมีค่าไม่มากกว่า 0.2 mg/l สำหรับกรณีที่เติมน้ำเชื้� ความแตกต่างของ DO สำหรับ Blank ควรจะอยู่ระหว่าง 0.6 แล� 1.0 mg/l

4. หลักการวิธีทดสอบ

5. การเก็บรักษาตัวอย่าง

6. ข้อควรระวั�

7. เครื่องมือและอุปกรณ์

7.1 ขว� BOD ขนาด 250-300 ml พร้อมจุกปิดสนิทแบบ ground joint ส่วนใหญ่ใช้ขวดที่ทำพิเศษเพื่อการหาออกซิเจนละลายน้ำโดยเฉพาะ

7.2 ตู้ควบคุมอุณหภูม� หรือ Water bath ซึ่งควบคุมอุณหภูมิได้ที่ 20 ± 1 ^oC และต้องมืดเพื่อป้องกันการสังเคราะห์แสงของสาหร่ายในตัวอย่าง

7.3 อุปกรณ์สำหรับเติมอากาศในน้�

7.4 ปิเป็ต(pipets)

7.5 กระบอกตว�(cylinder)

7.6 อุปกรณ์สำหรับการไตรเตร� (titrate)

7.7 ขวดวัดปริมาต�(volumetric flasks)

8. สารเคม�

8.1 สารละลาย Phosphate Buffer

นำสา� KH₂PO₄ มา 8.5 g สา� K₂HPO₄ มา 21.75 g สา� Na₂HPO₄.7H₂O มา 33.4 g และสาร NH₄Cl มา 1.7 g ละลายสารทั้งหมดในน้ำกลั่นประมา� 500 ml แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l ค่� pH ของสารละลายนี้ควรจะประมา� 7.2 โดยไม่ต้องปรับ

8.2 สารละลาย Magnesium Sulfate

8.3 สารละลาย Calcium Chloride

นำสา� CaCl₂ มา 27.5 g ละลายในน้ำกลั่� แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l

8.4 สารละลาย Ferric Chloride

นำสา� FeCl₃ . 6H₂O มา 0.25 g ละลายในน้ำกลั่� แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l

8.5 สารละลายกรดและด่าง 1 N เพื่อใช้ในการปรับค่า pH ของตัวอย่างให้เป็นกลาง

นำสา� Na₂SO₃ มา 1.575 g ละลายในน้ำกลั่� 1000 ml สารละลายนี้ไม่อยู่ตั� ต้อง เตรียมในวันที่จะใช�

8.7 สารป้องกันการเกิ� Nitrification : 2chloro-6-(trichoromethyl) pyridine

8.8 สารละลาย Glucose-Glutamic acid

อบ Glucose (reagent grade) แล� Glutamic acid (reagent grade) ที่อุณหภูม� 103 ^oC เป็นเวลา 1 ชั่วโม� แล้วนำ Glucose มา 150 mg แล� Glutamic acid มา 150 mg ละลายในน้ำกลั่� แล้วเติมน้ำกลั่น จนได้ปริมาตร 1 l สารละลายนี้เก็บไว้ในตู้เย็นได้ 3 สัปดาห�

8.9 สารละลาย Manganous sulfate (DO#1)

นำสา� MnSO₄.4H₂O มา 480 g หรือสา� MnSO₄.2H₂O มา 400 g หรือสารMnSO₄.H₂O มา 364 g ละลายในน้ำกลั่� กรอง แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l สารละลายที่เตรียมได้ไม่ควรให้สีกับน้ำแป้� เมื่อนำไปเติมลงไปในสารละลา� Potassium iodide (KI) ที่มีสภาพเป็นกรด

8.10 สารละลาย Alkali-Iodide-Azide (DO#2)

นำสา� NaOH มา 500 g (หรือสา� KOH 700 g) และสาร NaI มา 135 g (หรือสา� KI 150 g) ละลายในน้ำกลั่� แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l หลังจากนั้นนำสาร NaN₃ มา 10 g ละลายในน้ำกลั่� 40 ml แล้วนำไปเติมในสารละลายที่เตรียมขึ้�

8.11 กร� H₂SO₄ เข้มข้� (DO#3)

8.12 น้ำแป้�

ละลา� Soluble Starch 2 g แล� Salicylic acid 0.2 g ลงในน้ำกลั่นปริมาต� 100 ml ที่ทำให้ร้อน

ละลา� KH(IO₃)₂ 812.4 mg ในน้ำกลั่น แล้วทำให้เจือจางเป็น 1 l

8.14 สารละลายมาตรฐา� Sodium thiosulfate (0.025 N)

นำสา� Na₂S₂O₃.5H₂O มา 6.205 g ละลายในน้ำกลั่� แล้วเติม NaOH 6N จำนว� 1.5 ml หรือสา� NaOH จำนว� 0.4 g แล้วเติมน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 1 l ให้ทำการ Standardize สารละลายนี้ด้วยสารละลา� bi-iodate ที่ทราบความเข้มข้นแน่นอน

9. ขั้นตอนการวิเคราะห�

9.1 วิธีการหาโดยตร�

ในกรณีที่ตัวอย่างมีค่า BOD ไม่เกิ� 7 mg/� ไม่จำเป็นต้องเจือจางตัวอย่าง ส่วนใหญ่จะได้แก่น้ำจากแม่น้ำลำคลอง ให้วิเคราะห์ตัวอย่างตามขั้นตอนต่อไปนี้

9.1.5 นำขวดที่ 2 เข้าเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วั�

9.1.6 หลังจา� 5 วั� วิเคราะห์หาปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำที่เหลืออยู่ในขวดที่ 2

9.2 วิธีการที่ต้องเจือจางตัวอย่า�

วิธีนี้ใช้กับตัวอย่างที่มีความสกปรกสูง โดยมีค่าBOD มากกว่� 7 mg/l ซึ่งถ้าไม่เจือจางตัวอย่า� แบคทีเรียจะใช้ออกซิเจนจนหมดก่อนเวล� 5 วั� ทำให้ปริมาณออกซิเจนที่ละลายน้ำมีค่าเท่ากับศูนย� จึงไม่สามารถหาค่าBODได�

2) เติมสารละลาย Phosphate Buffer, Magnesium Sulfate, Calcium Chloride แล� Ferric Chloride อย่างล� 1 ml ต่� น้ำกลั่น 1l

5) เติมน้ำเชื้อ (seed) ถ้าจำเป็� โดยปกติแล้วถ้าเป็นน้ำเชื้อจากน้ำเสียชุมชนจะใช้น้ำเชื้อ 2 ml ต่อน้ำเจือจา� 1 L

9.2.2. การเติมน้ำเชื้� (seeding)

ตัวอย่างจำเป็นต้องมีจุลินทรีย์ ที่สามารถย่อยสลายสารอินทรีย์ได้ในปริมาณที่เพียงพ� น้ำเสียชุมชน น้ำที่ผ่านการบำบัดแบบชีวภาพและยังไม่มีการฆ่าเชื้อหรือเติมคลอรี� และน้ำผิวดินจะมีปริมาณของจุลินทรีย์ที่เพียงพ� แต่ตัวอย่างบางประเภทมีปริมาณจุลินทรีย์ไม่เพียงพอ เช่น น้ำเสียจากโรงงานบางประเภ� น้ำเสียที่ผ่านการฆ่าเชื้� น้ำเสียที่มีอุณหภูมิสูงหรือน้ำเสียที่มีความเป็นกรดหรือด่างสู� เป็นต้� สำหรับน้ำเสียประเภทเหล่านี้จำเป็นต้องเติมน้ำเชื้อลงในน้ำเจือจางด้ว� น้ำเชื้อที่ใช้สามารถใช้น้ำเสียชุมช� โดยนำมาตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องอย่างน้อย 1 ชั่วโม� แต่อย่าให้นานเกิ� 36 ชั่วโม� แล้วนำส่วนที่ใสมาใช้เป็นน้ำเชื้อ

การควบคุมน้ำเชื้�(seed control) คือการวิเคราะห์ค่าBODของน้ำเชื้อที่ใช้เติมลงในน้ำเจือจา� ค่าที่ได้จะนำไปใช้คำนวณภายหลัง

9.2.3. การจัดการขั้นต้นกับตัวอย่า�

1) ตัวอย่างที่มีความเป็นกรดหรือด่างให้ปรับให้เป็นกลางโดยมีค่า pH อยู่ระหว่า� 6.5 ถึ� 7.5 ด้วย H₂SO₄ หรือ NaOH โดยปริมาณของกรดหรือด่างที่เติมไม่ควรมากกว่� 5% ของปริมาตรตัวอย่าง

2) ตัวอย่างที่มีสารประกอบคลอรีนตกค้าง : ถ้าเป็นไปได้ควรหลีกเลี่ยงตัวอย่างที่มีสารคลอรีนตกค้า� โดยเก็บตัวอย่างก่อนที่จะผ่านเข้าขบวนการฆ่าเชื้อด้วยคลอรี� ถ้าตัวอย่างผ่านการฆ่าเชื้อด้วยคลอรีนแล้วตรวจไม่พบสารคลอรีนตกค้างให้เติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจางด้ว� ถ้าพบปริมาณคลอรีนตกค้างให้กำจัดคลอรีนก่อนและเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจางด้วย

3) ตัวอย่างที่มีสารพิ� : น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรมบางประเภ� เช่น โรงงานชุบโลห� จะมีโลหะที่เป็นสารพิษอยู� ตัวอย่างประเภทนี้จำเป็นต้องได้รับการศึกษาและบำบัดเป็นกรณีพิเศษ

4) ตัวอย่างที่มีปริมาณออกซิเจนละลายน้ำเกินจุดอิ่มตั� : ตัวอย่างที่มีค่าออกซิเจนละลายน้ำมากกว่� 9 mg/L ที่อุณหภูม� 20 ^oC ให้ลดปริมาณออกซิเจนลงมาจนถึงจุดอิ่มตัว โดยการเติมตัวอย่างไม่ต้องเต็มขวดแล้วเขย่� หรือ โดยการเติมอากา�

5) การป้องกันการเกิ� nitrification : ถ้าต้องการป้องกันความผิดพลาดของค่าBODจากการเกิด nitrification ให้เติ� 2-chloro-6- (trichloro methyl) pyridine (TCMP) จำนว� 3 mg ในขวดBOD ขนาด 300 ml ก่อนปิดจุกหรือเติมในน้ำเจือจาง ให้มีความเข้มข้นสุดท้า� เท่ากั� 10 mg/l

9.2.4. การท� Blank

นำน้ำเจือจางมาเทใส่ขวดBOD 6 ขว� นำ 3 ขวดไปวิเคราะห์หา DO ทันท� แล� 3 ขวดที่เหลือไปเก็บไว้ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่ 20 ^oC เป็นเวลา 5 วั� แล้วนำไปหา DO

9.2.5. การทำตัวอย่า� QC

1) เลือกตัวอย่างน้ำเสียชุมชนม� 1 ตัวอย่างใช้เป็นน้ำเชื้�(seed) โดยนำม� 10 ml ใส่ลงไปในกระบอกตวง 1000 ml

2) เติม สารละลาย Glucose-Glutamic acid จำนว� 20 ml

3) เติมน้ำเจือจางจนได้ปริมาตร 1000 ml

4) กวนสารละลายในกระบอกตวงให้เข้ากันด้วยแท่งกว�

5) ค่อย� เทสารละลายในกระบอกตวงใส่ขวดBOD 3 ขว� พยายามอย่าให้มีฟองอากา�

6) ขว� 1 นำไปหา DO ทันท�

7) ขว� 2 แล� 3 นำไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที่20^oCเป็นเวลา5วันแล้วจึงนำไปหา DO

9.2.6. การท� Duplicate

ให้ท� Duplicate สำหรับตัวอย่างน้ำที่ใช้ท� QC โดยเจือจางตัวอย่างให้ได้ 1000 ml แล้วเทใส่ขวดBOD 3 ขวดนำไปห� DO ทันท� 1 ขว� แล้วนำ 2 ขวดที่เหลือไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูมิที� 20 ^oC เป็นเวลา 5 วั� แล้วจึงนำไปหาค่า DO

การเจือจางตัวอย่างสามารถทำได� 2 วิธี คื� การเจือจางในกระบอกตว� และการเจือจางโดยตรงในขวดBOD สำหรับการเจือจางโดยตรงในขวดBOD ถ้าใช้ตัวอย่างน้อยกว่า 0.5 ml ให้เจือจางตัวอย่างเบื้องต้นก่อ�

2) กำหนดปริมาณการเจือจางตัวอย่า� โดยส่วนใหญ่กำหนด 3 ช่วง ให้ครอบคลุมค่าBODที่ประเมินไว� การเจือจางที่ดีควรให้ผลของ DO ที่เวล� 5 วั� มีค่าอย่างน้อย 1 mg/l และปริมาณของ DO ที่ลดลงหลังจากเวลา 5 วั� ควรมีค่าอย่างน้อ� 2 mg/l การหาค่า CODของตัวอย่า� ซึ่งสามารถรู้ผลภายในเวลา ประมาณ 2 ชั่วโม� สามารถช่วยในการเลือกช่วงที่จะเจือจางตัวอย่างได� โดยส่วนใหญ่ค่า BOD จะมีประมาณ 60% ของค่าCOD หรืออาจจะประเมินจากประเภทของตัวอย่าง ดังนี้

น้ำเสียจากโรงงานอุตสาหกรรม ให้เจือจาง น้อยกว่า 1.0%

น้ำเสียชุมชน ให้เจือจาง 1 ถึ� 5%

น้ำที่ผ่านการบำบัดทางชีวภา� ให้เจือจาง 5 ถึ� 25%

น้ำแม่น้ำที่เน่าเสีย ให้เจือจาง 25 ถึ� 100%

*ข้อมูลจา� : Chemistry for Environmental Engineering, Sawyer and McCarty, 3^rded., p.424

สำหรับการเลือกช่วงเจือจางนั้� ให้ประมาณค่าBODของตัวอย่างก่อ� เช่น ประมาณว่าตัวอย่างมีค่าBODเท่ากั� 500 mg/l จากตารางแนะนำให้เจือจางตัวอย่า� 1% สำหรับBODที่มีค่าอยู่ระหว่า� 200 ถึ� 700 mg/l จากนั้นให้เลือกเจือจางตัวอย่างอี� 2 ช่วง ที่มากกว่าและน้อยกว่� 1% อยู่ 1 ขั้น คื� 0.5% แล� 2.0% ช่วงของBODที่ทำการเจือจางจะเป็� 100 ถึ� 1400 mg/l ซึ่งน่าจะครอบคลุมค่าBODของตัวอย่างและสามารถป้องกันการผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นจากการประมาณขั้นต้น

7) ค่อย� เทตัวอย่างลงในขวดBOD จำนว� 2 ขว� พยายามอย่างให้เกิดฟองอากาศ เพราะจะถือว่� DO ของตัวอย่างทั้� 2 ขว� มีค่าเท่ากัน ปิดจุกหล่อน้� ใส่ฝาครอ�

8) นำตัวอย่างไปเก็บไว้ในตู้ควบคุมอุณหภูมิที� 20 ^oC 1 ขว� ขวดที่เหลือนำไปวิเคราะห์หาค่� DO ทันท� ด้วยวิธี Azide Modification

ในกรณีที่หาค่า DO โดยใช้วิธี Membrane Electrode ให้เตรียมตัวอย่างขวดเดีย� และหาค่า DO เริ่มต้นก่อน แล้วจึงปิดฝาอย่าให้มีฟองอากาศในขวด หล่อน้� แล้วนำไปเก็บในตู้ควบคุมอุณหภูม�

การหาค่า DO สามารถทำได� 2 วิธี คือวิธ� Winkler (azide modification) แล� วิธี Membrane Electrode

ขั้นตอนการหา DO โดยวิธ� Winkler (azide modification)
1) เทน้ำที่หล่อจุกขวดตัวอย่างออ�
2) เปิดจุ� เติมสารละลาย Manganese sulfate (DO#1) 1 ml โดยขณะเติมให้ปลายปิเป็�(pipet) อยู่ใต้ผิวน้�
3) เติมสารละลาย Alkali-Iodide-Azide (DO#2) 1 ml โดยให้ปลาย ปิเป็ต(pipet) อยู่ใต้ผิวน้ำขณะเติม
4) ปิดจุกโดยอย่าให้มีฟองอากาศภายในขวด คว่ำขวดไปมาหลา� � ครั้งเพื่อให้สารผสมกัน
5) ตั้งทิ้งไว้ให้ตกตะกอนจนได้ปริมาณน้ำใ� เกินครั้งหนึ่งของขวด
6) เติมกร� H2SO4 เข้มข้�(DO#3) 1 ml โดยให้กรดค่อ� � ไหลลงไปข้า� � คอขว� ปิดจุกคว่ำขวดขึ้นลงหลายครั้งจนกระทั่งตะกอนละลายหมด
7) ตวงปริมาตร 201 ml นำไป ไตรเตร�(titrate) กับสารละลายมาตรฐาน sodium thiosulfate (0.025 N) จนได้สีเหลืองอ่อ�
8) เติมน้ำแป้� 2-3 หยดจะได้สีน้ำเงินเข้มทำการไตรเตรตต่อไปจนกระทั้งสีน้ำเงนหายไปปริมาตรของสารละลายมาตรฐา� Sodium thiosulfate ที่ใช้จะเทียบเท่ากับปริมาณของออกชิเจ�(DO)ของน้ำตัวอย่างโดยมีหน่วยเป็น mg/l

10. การคำนวณ

10.1 กรณีไม่มีการเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจาง

BOD = DO₀ � DO₅

โดยที่ BOD₅ = ค่� BOD ที่ระยะเวลากักเก็บตัวอย่าง 5 วันมีหน่วยเป็น mg/l

10.2 กรณีเติมน้ำเชื้อในน้ำเจือจาง

B₁ = DO ขอ� seed control ก่อนนำเข้าตู้ควบคุมอุณหภูม�, mg/l

B₂ = DO ขอ� seed control หลังจากเก็บไว้ 5 วั�

f = อัตราส่วนน้ำเชื้อในตัวอย่างที่เจือจางกับใน seed control

11. การรายงานผ�

รายงานผลค่� BOD เป็นเลขจำนวนเต็มมีหน่วยเป็� mg/l

12. เอกสารอ้างอิ�

วิธีการทดสอบนี้ยึดหลัก (followed) วิธีที� 5210 B ขอ� Standard Method for the Examination of Water and Wastewater, 18^th edition, 1992. APHA, AWWA, WEF.