Quando andiamo a sospendere in un elettrolita una particella (o una cellula) trasportante una carica elettrica, essa attrarrà attorno a sé ioni di carica elettrica opposta, formando un doppio strato elettrico. Nella figura di sinistra (a) seguente viene mostrato che la simmetria del doppio strato può essere alterata dalla presenza di un campo elettrico esterno applicato. Di solito le proprietà dielettriche della particella (cioè la conducibilità e la costante dielettrica ) differiscono da quelle della sospensione: come risultato di ciò l’azione del campo elettrico applicato sarà quella di indurre delle cariche elettriche alla superficie di separazione tra particella e sospensione (mezzo esterno). Quest’ultimo è quello che viene detto effetto Maxwell-Wagner ed è evidenziato nella seguente figura di destra (b).

La distorsione del doppio strato elettrico e la creazione di cariche interfacciali per effetto Maxwell-Wagner si prestano alla creazione di un momento di dipolo indotto della particella. Le ampiezze di questi dipoli indotti sono molto più grandi rispetto a quelle associate alle specie molecolari perché, sebbene la quantità di carica coinvolta non risulta essere molto grande, la distanza tra due cariche di segno opposto è considerevole. Come mostrato nella figura (b) di cui sopra il momento di dipolo indotto originato da due cariche indotte e localizzate a distanza rispettivamente r⁺ e r^- è dato da :

Il momento di dipolo indotto della particella ruota con la stessa frequenza del campo elettrico ma sfasato rispetto ad esso. Questo sfasamento è identico all’angolo di fase tra e .

Fig. c

Il momento di dipolo di una sfera dielettrica omogenea immersa in un mezzo dielettrico esterno può scriversi come

0000000(1)

e sono rispettivamente le costanti dielettriche complesse (dipendenti dalla frequenza ) della cellula e del mezzo esterno ( ).

Quando > allora >0 e il momento di dipolo è allineato al campo e viceversa se < .

Notare che f(e_p ,e_e) è limitata cioè

1 -1/2 (=1 per =0 , =-1/2 per =0),

L’interazione tra e , per ogni data frequenza , genera un momento meccanico che induce le cellule a ruotare (seppure come detto a frequenza più lenta di quella del campo). Nella determinazione delle proprietà dielettriche la dipendenza dalla frequenza della direzione e della velocità di rotazione può esprimersi mediante un modello lineare (vero per rotazioni lente) che consente di esprimere come

0000000(3)

Nell’elettrorotazione si può misurare la dipendenza dalla frequenza della parte immaginaria di . Poiché allora E² e risulta anche che

0000000(4)

0000000(5)

Risolvendo l’equazione di Laplace con le condizioni al contorno valide per tale modello a tre dielettrici, si possono esprimere due frequenze caratteristiche in funzione dei parametri dielettrici: la frequenza del primo picco (f_c1) , determinata dalle proprietà della membrana ( in particolare f_c1 permette, una volta stimata, la determinazione della permittività della membrana plasmatica che è una espressione strutturale cioè dipende dalla disposizione delle proteine intramembranose nel doppio strato lipidico) e la frequenza del secondo picco (f_c2) , legata alle proprietà del mezzo interno (vedi fig. d).

0000000(6)

00000 (7)

dove C e g indicano rispettivamente la capacità specifica e la conducibilità di membrana, mentre e sono le conducibilità rispettivamente del mezzo interno e del mezzo esterno.

In prima approssimazione nella (6) si può trascurare il prodotto rg ed il termine 1/ rispetto a 1/ in quanto >> per cui la (4) diventa

000000(8)

Dalla (8) misurando si ricava la capacità per unità di superficie C (una volta stimato il raggio cellulare)

000000(9)

e infine nota quest’ultima quantità, e noto lo spessore di membrana d =50*10 ^–10 m (come da letteratura) è possibile stimare la permittività di membrana

000000(10)

Abbiamo accennato che applicando un campo elettrico rotante su una sospensione cellulare, si induce all’interfaccia membrana-tampone un momento di dipolo per polarizzazione interfacciale (in quanto c’è una forte differenza di conducibilità e costante dielettrica tra tampone e membrana).

A frequenza molto bassa il momento di dipolo viene istantaneamente indotto, in fase con il campo elettrico, sulla cellula (il campo elettrico gira e man mano che ruota, sulla cellula si instaura il suddetto momento di dipolo sempre allineato con il campo). Ricordiamo infatti che un dipolo allineato con il campo non subisce alcun momento meccanico. A frequenza molto alta non si induce momento di dipolo (e dunque anche qui non succede niente). Tra questi due estremi c’è una situazione in cui il momento di dipolo viene indotto però sfasato rispetto al campo elettrico rotante: in ogni istante abbiamo che il campo elettrico e il momento di dipolo indotto non sono allineati per via del fenomeno del rilassamento.

Analizziamo più in dettaglio quanto detto.

I) La prima dispersione (in genere per frequenze < 1 MHZ)

Consideriamo un campo alternato a frequenza sufficientemente bassa, in modo tale che l’impedenza di membrana sia molto più grande della resistenza del mezzo interno e del mezzo esterno. In tali condizioni la corrente associata a tale campo elettrico è forzata a scorrere intorno alla cella, provocando un accumulo di cariche affacciate agli elettrodi (vedi fig. e)

Avendo il citoplasma una grossa conducibilità il campo elettrico all’interno della cellula è praticamente nullo: la differenza di potenziale è localizzata sullo strato della membrana. Il momento di dipolo indotto è come detto, dovuto alle cariche poste sull’interfaccia tra la membrana e il mezzo esterno e la sua orientazione è parallela al campo esterno. Dato che il processo di carica della membrana ha una sua costante di tempo, dipendente dalle proprietà dielettriche della cellula e del mezzo esterno, si può avere uno sfasamento tra il campo applicato e il momento di dipolo indotto (Fig. j1 j2). Tale sfasamento, in un campo rotante, coincide con l’angolo di fase spaziale ( ruoterà con la stessa frequenza di e con una certa differenza di fase che corrisponde all’angolo tra la direzione dei due vettori sopra menzionati).

In Fig. f (a) si vede che la parte immaginaria del momento di dipolo indotto è positiva per angoli compresi tra 0 e 180 gradi in modo che per la (4) le cellule ruotano in verso contrario al campo. Quindi ricordando che un momento di dipolo non allineato con il campo elettrico E genera un momento meccanico m nel nostro caso avremo che quest’ultimo, per l’orientazione del dipolo, spingerà la cellula a ruotare (lentamente) , come detto in direzione opposta al campo (questo fenomeno si verifica sperimentalmente per frequenze < 1MHz). La velocità di rotazione dipende dalla frequenza del campo ed è massima quando la frequenza del campo è uguale alla frequenza di rilassamento della polarizzazione interfacciale.

II) La seconda dispersione (> 1 MHz)

Schematizzando la membrana cellulare come un circuito RC parallelo

A frequenze sufficientemente elevate (ma non troppo in quanto le cariche devono riuscire a seguire le oscillazioni del campo anche se sfasate) l’isolamento della membrana è bypassato per via capacitiva (le linee di forza del campo riescono ad attraversare la membrana e vanno ad interessare il mezzo interno caratterizzato da una elevata conducibilità). Così le cariche positive sono accumulate dentro il citoplasma di fronte all’elettrodo negativo (nel caso precedente, invece esse si accumulavano sulla superficie esterna della membrana di fronte all’elettrodo positivo); viceversa si comportano gli ioni negativi. Tutto ciò porta ad un orientazione del momento di dipolo indotto antiparallela al campo esterno (vedi Fig. h)

In Fig. f (b) si vede che la parte immaginaria del momento di dipolo indotto è negativa per angoli compresi tra 0 e 180 gradi in modo che per la (4) le cellule ruotano in verso concorde al campo. Quindi ricordando che un momento di dipolo non allineato con il campo elettrico E genera un momento meccanico m : nel nostro caso avremo che quest’ultimo, per l’orientazione del dipolo, spingerà la cellula a ruotare (lentamente) , come detto nella stessa direzione del campo (passando dalla membrana al mezzo interno la polarizzazione è in verso contrario alla precedente dispersione) come in Fig. j3.

Qui sotto (Fig.1) si può notare l'apparato sperimentale usato per effettuare le misure di elettrorotazione. Si possono individuare:

- microscopio Zeiss

- cella porta campione

- generatore di campo rotante

- una telecamera

La cella di misura è costituita da quattro elettrodi elettricamente isolati l’uno dall’altro e montati su di

un vetrino da microscopio nel cui centro è presente una cavità di diametro pari a 2.5 mm.

Fig 2 (cella di misura )

In questa cavità viene posto il campione: una goccia della sospensione di cellule ( fibroblasti di topo 3T6) di volume pari a circa 10-20 ml; il tutto verrà successivamente ricoperto da un vetrino posto con lo scopo di favorire una migliore visualizzazione da parte dell’operatore.

 

 

Il circuito è alimentato con un generatore di campo rotante che invia ai quattro elettrodi in sequenza, dei segnali ad onda quadra sfasati di 90°. Grazie alla presenza di un divisore, la frequenza del segnale può essere variata tra 240 Hz e 500 KHz in 12 step.

 

Fig 3 (generatore di campo rotante )

 

 

Di seguito vengono riportate delle immagini a fluorescenza riguardanti la distribuzione del campo nella zona centrale della cella di misura.

 

 

Preliminari di misura

 

Le misure vengono effettuate dalla rotazione di cellule 3T6 sospese in una soluzione di saccarosio (300 mM). La soluzione presenta una conducibiltà misurata di

 

 

= ( 2.36 ± 0.01) 10^-3 S/m

 

Dal punto di vista sperimentale si è individuata la più appropriata tecnica di rilevamento del periodo di rotazione delle cellule: la più indicata era quella di ottenerlo come risultato di una media su due rotazioni complete, osservate tramite telecamera CCD posta sulla sommità del microscopio; le misure venivano condotte con obbiettivi da 16 e 33 ingrandimenti ( il 33 quando disponibile ).

Il secondo problema era relativo alle dimensioni particolarmente estese della celletta rispetto a quelle della coltura: in prossimità degli elettrodi, il movimento predominante era quello traslatorio mentre nella parte più interna del pozzetto si assisteva ad una effettiva rotazione: questo perché il campo non era uniforme su tutto il volume ma solamente in una piccola porzione di spazio nel centro.

In virtù di quanto detto sopra, le cellule, durante la misura, non rimangono sempre su di uno stesso piano focale, quindi oltre che regolare la messa a fuoco, bisogna anche inseguirle per tutto il pozzetto (escludendo dalla misura quelle più profonde a diretto contatto con il vetrino).

La misura è ulteriormente complicata dalla eventuale presenza nella soluzione di aggregati cellulari,

(cellule addensate tra di loro): campioni di questo genere non sono utilizzabili in quanto hanno una consistente inerzia al moto. È quindi necessario poter visualizzare una cellula isolata seguendone gli spostamenti ( rotazioni ), quando essa è sottoposta al campo esterno.

Dal punto di vista elettrico abbiamo verificato, come al variare della frequenza l’ampiezza del segnale in uscita ai quattro elettrodi non variasse: in virtù di ciò si è fissata una tensione di riferimento intorno ai 12 V ( questo anche allo scopo di salvaguardare la componentistica elettronica ).

Abbiamo verificato, grazie all’ausilio di un’oscilloscopio, i valori dei periodi rilevati alle varie (12) posizioni della manopola sul generatore di campo rotante ( ROTATOR ) tensione qui di seguito riportate:

 

(per calcolare il D n si è fatto uso della propagazione degli errori statistici ).

Per il fit dei dati si è usata la formula (vera in prima approssimazione per il modello a single shell ):

 

dove f è la frequenza del campo applicato, R(f) la frequenza di rotazione cellulare, R₁ il picco di R(f) e f_c1 la relativa frequenza del campo in corrispondenza di R₁

La nostra misura (prova1)

 

Si noti che:

• per le misure del periodo di rotazione delle cellule si è omesso di indicare che si è usato un cronografo digitale: l'errore commesso sulla singola misura è pari all'errore di lettura dipendente dalla prontezza di riflessi dell'operatore. Si è stimato tale errore in 0.05 s.
• Nelle formule usate per i fit dei dati che compaiono nei grafici si intende che: Y=R(f); m0=f; m1=R1; m2=fc1

 

La nostra misura (prova2) (verifica della riproducibilità della misura fisica)

 

Osservare che nelle tabelle relative alla prova 2 per la frequenza 500000 Hz si è ottenuta talvolta una rotazione delle cellule in verso orario cioè conforme al campo e la si è indicata con un segno positivo.

 

 

Gli errori sulle misure

 

Mediante propagazione degli errori si ha (viste le (8) , (9), (10) e il valore del raggio r stimato (vedi prossimo paragrafo):

 

0000000(11)

 

0000000(12)

 

0000000(13)

 

0000000(14)

 

Nel caso della prova1 si ha:

 

(11)=0.4 mF/m²

(12)=0.4% + 2.3% + 2.4% = 5.1%

(13)=0.2

(14)=5.1%

 

Nel caso della prova 2 si ha:

 

(11)=0.5 mF/m²

(12)=0.4% + 2.3% + 4.5% = 7.2%

(13)=0.3

(14)=7.2%

 

La stima del raggio

 

Mediante microscopio ottico (obiettivo 33X) si è stimato il diametro delle cellule 3T6. Si è usata come misura di taratura l’area di una "finestra" di un reticolo di diffrazione: Sapendo che tale area misurava 1/400 mm² e che il lato di una tale "finestra" era formato da 35 divisioni si ricava l’unità di misura delle divisioni che per il nostro obiettivo risultava essere di 1.43. Dai seguenti dati si ricavava una stima del diametro e quindi del raggio con un errore relativo molto contenuto.