patogenicidad y virulencia bacteriana"
Pontificia Universidad Cat�lica de Chile
Licenciatura en Biolog�a
La envoltura externa en bacterias Gram negativas est� compuesta por 3 capas: membrana interna, cercana al citoplasma; el peptidoglic�n y la membrana externa (1,2). Esta �ltima, ampliamente estudiada, est� compuesta por 2 tipos de l�pidos (lipopolisac�ridos o LPS y fosfol�pidos), as� como prote�nas muy caracter�sticas; y en Enterobacteriaceae un polisac�rido �nico: el ant�geno enterobacterial com�n (ECA, por sus siglas en ingl�s) (3).
La membrana externa es la interfase entre la bacteria y el medio que la rodea; constituyendo una importante barrera contra agentes que le pueden ser perjudiciales, tales como compuestos qu�micos t�xicos, antibi�ticos y detergentes (4). Se ha visto que es poco permeable al flujo de compuestos altamente lipof�licos, en un factor entre 50 a 100 en comparaci�n con la membrana citoplasm�tica (3). Sin embargo, se ha constatado que mol�culas hidrof�licas de masa molecular no mayor a 700 daltons la atraviesan en forma pasiva e inespec�fica. La explicaci�n a este fen�meno se debe a prote�nas presentes, denominadas porinas, por su capacidad de formar poros de difusi�n transmembranosos (4).
Las membranas externas de Escherichia coli y Salmonella typhimurium, a las cuales se les han realizado variados estudios, poseen entre 10 y 20 prote�nas de cualidades distintas (4), tales como la prote�na OmpA (outer membrane protein A) de aproximadamente 35 kD en E. coli K-12, y las porinas cl�sicas OmpF (~ 37 kD), OmpD (~ 38 kD) y PhoE (~ 36 kD), todas presentes en E. coli K-12 y S. typhimurium LT2 a excepci�n de OmpD, la cual solo se encontrar�a en S. typhimurium (3,4).
En condiciones usuales en medio de cultivo solo las porinas OmpF y OmpC (adem�s de OmpD en S. typhimurium) son producidas, pero su abundancia relativa est� regulada eficientemente por se�ales medioambientales, tales como osmolaridad (3). Se ha establecido claramente que E. coli altera rec�procamente los niveles de expresi�n de sus porinas: OmpF es expresada preferentemente cuando la osmolaridad del medio externo es baja, mientras que OmpC lo es en condiciones opuestas (4). Todos estos datos hacen suponer de inmediato el rol que jugar�an las prote�nas de membrana externa en la patogenicidad y virulencia de las bacterias.
A principios de los a�os 80 se hab�a identificado el operon ompB, que est� constituido por 2 genes: ompR y envZ, proponi�ndose que EnvZ act�a como un sensor medioambiental y transmite se�ales a OmpR, el cual modular�a la transcripci�n de varios genes. Los genes dependientes de OmpR incluyen los que codifican las porinas OmpC y OmpF, siendo la expresi�n de OmpD independiente (5).
Dorman y colegas se propusieron crear mutantes ompR en cepas virulentas de S. typhimurium, con el fin de verificar el efecto que tendr�a esta mutaci�n, as� como en los genes estructurales de ompC, ompD y ompF. Los resultados de ellos mostraron que una mutaci�n en el gen ompR tiene un efecto dram�tico en la virulencia de S. typhimurium en ratones BALB/c. increment�ndose la dosis letal 50% (LD50) por m�s de 3 unidades logar�tmicas comparados con la cepa silvestre. Adem�s, ellos reportaron que las cepas que contienen mutaciones en ompC o ompF fueron tan virulentas como las cepas silvestres, mientras que la que contiene una mutaci�n en ompD mostr� una dr�stica reducci�n de su virulencia (LD50 se incremento 23 veces entre la mutante ompD y la cepa silvestre) (5). Este estudio asigna as� un importante papel a la porina OmpD en la virulencia de S. typhimurium.
Sin embargo, Meyer et al en 1998 se propusieron corroborar los resultados anteriores, y las conclusiones obtenidas fueron inquietantes: ellos encontraron que no existir�an diferencias estad�sticamente significativas en las capacidades de adherencia e invasi�n entre la cepa silvestre de S. typhimurium y su correspondiente mutante en ompD. Mas a�n, la LD50 y estudios de colonizaci�n revelaron que tampoco habr�a diferencias estad�sticas en la virulencia de S. typhimurium silvestre y su correspondiente mutante ompD (6). Estos resultados contradicen enormemente al equipo de Dorman et al. Cabe eso si mencionar algunas salvedades: ambos estudios trabajaron con cepas distintas de S. typhimurium, y mas importante a�n, hay una diferencia en la recolecci�n de datos en cuanto a los d�as postinfecci�n de los ratones, ya que Meyer et al llegan hasta el dia 6 luego de la inoculaci�n, mientras que Dorman et al realizan el estudio hasta 2 semanas despu�s de la administraci�n oral de las cepas silvestres y mutantes de S. typhimurium. Surge entonces un pero que debe ser investigado, debido no solo a las implicancias "extra" cient�ficas que surgen por la diferencia en los resultados, sino porque adem�s se abre una interrogante sobre el verdadero papel de OmpD en la virulencia; mas aun si pensamos que S. typhi no posee esta porina, y si efectivamente OmpD tiene un efecto en la virulencia no se explicar�a que S. typhi no la posea.
Escherichia colies la bacteria Gram negativa que m�s com�nmente causa meningitis en el periodo neonatal. Es bien sabido que la existencia de la barrera hematocef�lica es efectiva en el paso de diversas sustancias, como medicamentos, y por cierto de bacterias. Sin embargo E. coli la atraviesa, estando poco claro que factores median este paso. Por ello Prasadarao et al en 1996 estudiaron el rol en E. coli K1 que jugar�a OmpA. Los resultados arrojaron que hab�a una diferencia entre 25 a 50 en la capacidad de invasi�n de c�lulas endoteliales microvasculares de cerebro entre las cepas silvestres y la mutante OmpA- , siendo mayor para la silvestre. Al complementarse la mutaci�n en el gen ompA la cepa recuperaba los niveles de invasividad de la cepa OmpA+ (7). As� pues OmpA es la primera estructura identificada en realzar la invasi�n de E. coli en c�lulas endoteliales microvasculares de cerebro, un importante evento en la patog�nesis de meningitis causada por esta bacteria.
Bernardini y colegas en 1993 investigaron el rol de OmpC en la virulencia de Shigella flexneri. OmpC es altamente expresada independientemente de si la bacteria crece en un medio de alta o baja osmolaridad. Esta continua expresi�n contrasta con la regulaci�n que se observa en E. coli, donde OmpC es reprimida por una baja osmolaridad e inducida por alta osmolaridad. Mediante estudios con mutantes delta de los genes que regulan esta porina (ompR y envZ), y mutantes delta del gen ompC, ellos observaron que los 2 tipos de mutantes tuvieron una reducida virulencia, comparados con la cepa silvestre. Asimismo, mutantes en el gen ompF no mostraron efecto alguno en la capacidad de invasi�n de la bacteria tanto in vivo como in vitro al compararla con la cepa silvestre (8). He aqu� una diferencia con lo que ocurre con Salmonella typhimurium, donde OmpC aparentemente no ejerce un rol en la capacidad de invadir c�lulas, por lo menos in vitro, aunque, como se ver� a continuaci�n, si tiene importancia en otros aspectos relativos al proceso de infecci�n y respuesta inmunol�gica.
La introducci�n de un plasmidio multicopia que contiene el gen ompC clonado de E. coli bast� para que se recobrara la virulencia, lo que indica que esta prote�na es suficiente y necesaria para producir virulencia en una mutante de S. flexneri (8).
Los estudios sobre la regulaci�n de la s�ntesis de porinas en bacterias ent�ricas muestran que pr�cticamente ninguna porina OmpF se sintetiza a 37�C en presencia de 0.15 M de NaCl, que precisamente son las condiciones presentes en el interior del cuerpo de los mam�feros. Esto sugiere que OmpF es probablemente beneficiosa para la bacteria cuando se encuentra fuera del cuerpo animal, dado que su canal es mas amplio que OmpC (3). As� pues OmpC podr�a tener un rol mayor en alg�n aspecto relacionado con la respuesta inmunol�gica del cuerpo sobre la bacteria, dado que se descarta un efecto de esta porina en la virulencia (v�ase mas arriba).
El efecto inmunog�nico de OmpC durante la fiebre tifoidea en humanos fue evaluado in vitro por Luz Blanco et al en el a�o 1997. Ellos encontraron que la inmunizaci�n in vitro con ant�geno OmpC activ� en mas de la mitad de los pacientes la capacidad bactericida de monocitos U937, actividad que es reducida si la inmunizaci�n se realiza con preparaciones de membrana externa de S. typhi que carecen de OmpC (9).
Por otro lado en 1999 Pistole y Negm, usando mutag�nesis por transposici�n para crear mutantes deficientes en OmpC en cepas virulentas de S. typhimurium mostraron diferencias 5 veces mayores para la cepa silvestre en la adherencia y asociaci�n con macr�fagos. Es mas, la internalizaci�n de la bacteria por parte de los macr�fagos fue 40 veces mayor para la cepa silvestre que para la mutante OmpC-. Un an�lisis del gen ompC en las cepas probadas conten�a discretas diferencias comparadas con el mismo gen en Salmonella typhi y Escherichia coli , siendo mas id�ntica para la primera (98%, comparado con E. coli = 77%) (10).
Estos resultados me llevaron a pensar de inmediato que ocurrir�a si por alg�n motivo OmpC se perdiera, salvando eso si el problema de la no s�ntesis de OmpF. �Podr�a OmpD suplir en rol de una mutante OmpC, y por ende aumentarse la virulencia, dado que OmpC es la reconocida por los macr�fagos? Esta interrogante no pudo ser satisfecha al revisar los trabajos publicados, pero ciertamente merece una consideraci�n, mas a�n si volvemos a retomar el papel de OmpD en S. typhimurium.
La prote�na de membrana externa integral X (OmpX) de E. coli proviene de una familia altamente conservada de prote�nas que promueven la adhesi�n y entrada de la bacteria a las c�lulas de mam�feros. Estas prote�nas tiene un rol en la resistencia en contra del ataque del sistema de complemento humano. Estudios de su estructura cristalina realizados por Vogt et al en 1999 muestran que tiene una misma topolog�a beta-plegada de OmpA, aunque hay diferencias en el numero de puentes de hidr�geno internos y su disposici�n (11).
El gen que codifica la prote�na de membrana externa mayor (MOMP, por sus siglas en ingl�s) de 25 kD de Legionella pneumophila fue transformado en E. coli JM 83, y el clon resultante mostr� en ensayos de invasividad y uni�n a monocitos U-937 un incremento de 5 veces en la uni�n independiente de la opsonizaci�n. Adem�s, la incorporaci�n del gen por electroporaci�n a una cepa de Legionella pneumophila de virulencia baja y cuya expresi�n de MOMP estaba reducida pero realzada la expresi�n de una OMP de 31 kD; mostr� que la expresi�n de OMP de 31 kD se suprime al mismo tiempo que se reestablece la virulencia en embriones de pollo, sugiri�ndose un rol de MOMP de 25 kD de Legionella pneumophila en la adhesi�n molecular y su rol en la virulencia en embriones de pollo (12).
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Prasadarao, N. et al; Outer membrane protein A of Escherichia coli contributes to invasion of brain microvascular endotelial cells. Jan, 1996, Infect. Inmun. 64 (1): 146-153.
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