especificidad de hospedero de Salmonella typhi"
Pontificia Universidad Cat�lica de Chile
Programa de Doctorado en Ciencias
Menci�n Gen�tica Molecular y Microbiolog�a
El g�nero Salmonella comprende m�s de 2.200 serovares distintos que causan una variedad de enfermedades, tales como gastroenteritis, bacteremia y fiebre ent�rica (tifoidea y paratifoidea). Algunos serovares pueden infectar un amplio rango de hospedero. Un ejemplo de esta aparente inespecificidad se observa en S. enteritidis, que es capaz de infectar un gran n�mero de aves y mam�feros, incluyendo al hombre. En cambio, otros serovares son altamente adaptados a un hospedero espec�fico, como es el caso de S. gallinarum que infecta s�lo a aves de corral, S. choleraesuis que infecta porcinos, S. dublin que infecta bovinos, S. typhimurium que produce fiebre ent�rica al rat�n y finalmente, S. typhi que infecta exclusivamente al ser humano (Collins, 1974; Barrow y Duchet-Suchaux, 1997). El resto de los serotipos de Salmonella no produce enfermedad sist�mica en el hombre ni en animales adultos inmunol�gicamente competentes.
S. typhi es una enterobacteria Gram negativa, reconocida como agente etiol�gico de la fiebre tifoidea en humanos (Selander y cols., 1990). La fiebre tifoidea es una enfermedad del sistema ret�culo-endotelial, caracterizada por una fiebre alta, que puede causar la muerte del hospedero cuando no es tratada oportunamente. Aunque la incidencia de esta enfermedad tiende a disminuir a nivel mundial, sigue constituyendo un problema de salud p�blica en Chile y en otros pa�ses en v�as de desarrollo. La OMS ha estimado que existen 16,6 millones de casos anuales de fiebre tifoidea en el mundo, con un total aproximado de 600.000 muertes (Pang y cols., 1995; Pang y cols., 1997), lo que hace imprescindible implementar nuevas estrategias de prevenci�n y control de la enfermedad. Estas estrategias deben estar dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias, el tratamiento de las aguas y, por otra parte, a incentivar el desarrollo de vacunas que presenten mayor eficacia que las usadas hasta ahora (Dougan y cols., 1987; Pang y cols., 1995; Pang y cols., 1997). Por esta raz�n, se hace necesario estudiar las bases moleculares de los mecanismos de patogenicidad de S. typhi, cuya comprensi�n permitir� abordar un importante problema de salud p�blica desde nuevas perspectivas.
A�n cuando el ciclo infectivo de Salmonella parece bien caracterizado a nivel fisiol�gico (Slauch y cols., 1997), los mecanismos moleculares de este proceso reci�n comienzan a ser entendidos. Se ha establecido que S. typhi inicia su ciclo infectivo en el hombre al ser ingerida en alimentos y aguas contaminadas. Luego de sobrevivir a los mecanismos de defensa presentes en el tracto digestivo, la bacteria atraviesa las c�lulas epiteliales del intestino delgado a nivel del �leo, para llegar al tejido linfoide subyacente. Desde aqu�, las bacterias son fagocitadas y transportadas por macr�fagos hacia los n�dulos linf�ticos mesent�ricos, donde se multiplican y se diseminan al torrente sangu�neo, desencadenando as� la fiebre tifoidea (Finlay y Falkow, 1989). Debido a la capacidad de sobrevivir intracelularmente en los macr�fagos humanos, S. typhi ha sido clasificada como un pat�geno intracelular facultativo (Groisman y Saier, 1990; Chatfield y cols., 1992). Una �ltima fase del ciclo infectivo se llevar�a a cabo s�lo en algunos individuos y consiste en el asentamiento de la bacteria en la ves�cula biliar, conduciendo finalmente al estado de portador cr�nico.
Debido a que S. typhi tiene al ser humano como �nico hospedero, ha sido dif�cil estudiar sus mecanismos de patogenicidad (Chatfield y cols., 1992). La mayor parte del conocimiento respecto a la interacci�n de este pat�geno con su hospedero se basa en los resultados obtenidos a partir de ensayos in vitro usando l�neas celulares y en los resultados obtenidos del modelo de laboratorio S. typhimurium-rat�n. Mediante el uso de estas t�cnicas se ha podido demostrar una relaci�n directa entre la virulencia in vivo de la bacteria, con la capacidad de invadir c�lulas epiteliales y sobrevivir en macr�fagos in vitro, validando de esta forma la importancia de estos eventos en la patogenicidad de la bacteria (Gal�n y Curtiss, 1989; B�umler y cols., 1994; Penheiter y cols., 1997). Por otro lado, el estudio de mutantes defectuosas en estos procesos, ha permitido descifrar poco a poco los mecanismos por los cuales la bacteria logra acceder al interior del hospedero y sobrevivir en �l.
En los �ltimos diez a�os se ha descubierto y caracterizado un gran n�mero de genes de Salmonella involucrados, directa o indirectamente, en los procesos de entrada de la bacteria a c�lulas epiteliales y de sobrevivencia en el interior de los macr�fagos del hospedero. La mayor�a de los genes identificados se encuentran agrupados en zonas espec�ficas del cromosoma bacteriano, denominadas "islas de patogenicidad". Gran cantidad de evidencia experimental sugiere que estas regiones han sido adquiridas mediante transferencia horizontal de material gen�tico (Hacker y cols., 1997). Actualmente, se conocen cinco islas de patogenicidad en representantes del g�nero Salmonella (SPI), algunas de las cuales se encuentran presentes en cepas virulentas y ausentes en cepas no virulentas. Es importante mencionar que la relativa facilidad que presenta el trabajo gen�tico con cepas de S. typhimurium ha permitido un r�pido avance en el estudio de las relaciones estructurales y funcionales que presentan estas islas de patogenicidad.
La mayor�a de los genes involucrados en el proceso de invasi�n a c�lulas epiteliales se encuentran agrupados en la isla de patogenicidad 1 (SPI 1), ubicada en el minuto 63 del cromosoma de S. typhimurium (Gal�n, 1996). Gran parte de los genes presentes en SPI 1 codifican prote�nas estructurales y regulatorias de un nuevo sistema de secreci�n de prote�nas, denominado "tipo III" (Gal�n, 1996; Hueck, 1998). Este aparato de secreci�n permite exportar algunas prote�nas, codificadas tambi�n en este locus, a la superficie bacteriana de S. typhimurium. Por otra parte, se ha observado que este sistema de secreci�n permite la translocaci�n de prote�nas "efectoras" directamente al citoplasma de c�lulas epiteliales (Collazo y cols., 1995; Wood y cols., 1996; Collazo y Gal�n, 1997). El an�lisis de secuencia de los genes estructurales del sistema de secreci�n indica que �stos se encuentran presentes en otros enteropat�genos (Shigella y Yersinia) y tambi�n en fitopat�genos (P. solanacearum y X. campestris). Adem�s, estos genes presentan homolog�a con los genes involucrados en el ensamblaje del flagelo en E. coli (Van Gijsegem y cols., 1993; Hueck, 1998).
Una segunda isla de patogenicidad (SPI 2), ubicada en el minuto 31 del cromosoma de S. typhimurium, fue descubierta mediante selecci�n de mutantes incapaces de sobrevivir en ratones (Hensel y cols., 1995; Shea y cols., 1996; Ochman y cols., 1996). El an�lisis de secuencia de los genes presentes en este locus indic� que codifican para un segundo aparato secretor tipo III, cuya expresi�n ser�a requerida para la sobrevivencia de la bacteria dentro de los macr�fagos del hospedero (Shea y cols., 1996; Ochman y cols., 1996). Otro locus asociado a la virulencia de Salmonella (SPI 3) ha sido descrito en el minuto 82 del cromosoma de S. typhimurium y contiene genes esenciales para la sobrevivencia bacteriana en macr�fagos (Blanc-Potard y Groisman, 1997; Blanc-Potard y cols., 1999). Cercano al minuto 92 del cromosoma de S. typhimurium se ha reportado la presencia de una cuarta isla de patogenicidad (SPI 4) (Wong y cols., 1998) y, m�s recientemente, se ha caracterizado una quinta isla (SPI 5), cuyos genes codificar�an prote�nas requeridas para la enteropatogenicidad de Salmonella, pero no para la capacidad de producir una infecci�n sist�mica (Wood y cols., 1998). Hasta el momento, tres de estas islas de patogenicidad (SPI 1, SPI 2 y SPI 4) han sido descritas en cepas de S. typhi (Ochman y Groisman, 1996; Wong y cols., 1998).
A pesar del r�pido progreso en la identificaci�n de algunos de los elementos clave en la virulencia de Salmonella mediante el uso del modelo de tifoidea murina, nuestro conocimiento acerca de los genes y mecanismos envueltos en la expresi�n de la especificidad de hospedero es muy limitado. Estudios acerca de la distribuci�n de islas de patogenicidad y operones requeridos para la bios�ntesis de fimbrias y c�psula en distintos serotipos de Salmonella sugieren que, durante la evoluci�n, nuevas combinaciones de determinantes de virulencia surgieron a trav�s de m�ltiples eventos de transferencia horizontal de genes. Este proceso evolutivo podr�a haber conducido al desarrollo de la adaptaci�n a un hospedero �nico (Ba�mler y cols., 1998). Sin embargo, la adaptaci�n a un hospedero espec�fico no puede ser explicada �nicamente por la adquisici�n de islas de patogenicidad como SPI 1 y SPI 2, ya que estos determinantes de virulencia se encuentran presentes en todas las subespecies de S. enterica estudiadas. As�, en el desarrollo de una especificidad de hospedero podr�a estar envuelta la coordinaci�n de ciertos factores que le permitan al pat�geno usar todo su arsenal de virulencia en el contexto de un hospedero determinado (B�umler, 1997).
Fuera del g�nero Salmonella, recientemente se ha relacionado la p�rdida de material gen�tico con la expresi�n de ciertos factores de virulencia. La mayor�a de las cepas de E. coli producen la actividad lisina descarboxilasa (LDC), codificada en el gen cadA. Esta actividad no est� presente en Shigella, ya que dicha bacteria carece de una regi�n importante de material gen�tico que incluye al gen cadA. Sorprendentemente, cuando se introdujo el gen cadA de E. coli en cepas de Shigella, disminuy� considerablemente la virulencia y la actividad de la enterotoxina producida por el pat�geno (Maurelli y cols., 1998). Los resultados de este trabajo sugieren fuertemente que la aparici�n de deleciones cromosomales espec�ficas ("black holes") representa un mecanismo que contribuye, junto con adquisici�n de genes, a la evoluci�n de la patogenicidad en algunas bacterias.
En forma similar, el proceso de adaptaci�n a un nuevo hospedero podr�a estar determinado por la adquisici�n de nuevos determinantes de virulencia y tambi�n por la p�rdida de ciertos genes o de sus funciones. Un ejemplo destacable de este proceso de adaptaci�n se observa en S. gallinarum y S. pullorum, ambos miembros del mismo serotipo de Salmonella, que presentan una marcada especificidad de hospedero por aves acu�ticas y de corral. Se ha especulado que su linaje evolucion� a partir de un ancestro muy similar a la actual S. enteritidis, que presentaba un amplio rango de hospedero. El proceso de divergencia a partir del ancestro com�n condujo a que S. gallinarum y S. pullorum perdieran la capacidad de expresar el flagelo (y por lo tanto su motilidad) y de mediar hemaglutinaci�n sensible a manosa (MSHA) como consecuencia de la adquisici�n de ciertas mutaciones puntuales. Notablemente, cepas de S. enteritidis y S. typhimurium capaces de enfermar aves frecuentemente son incapaces de mediar MSHA y han perdido su motilidad. Estas observaciones han llevado a postular que la selecci�n de mutaciones puntuales en los genes requeridos para la bios�ntesis del flagelo y fimbrias de tipo 1, que ocurrieron durante la adaptaci�n de Salmonella a hospederos av�colas, pueden dar cuenta en parte de la p�rdida de virulencia de S. gallinarum/pullorum en ratones (B�umler y cols., 1998).
Al igual que S. typhimurium, S. typhi es capaz de penetrar el epitelio intestinal del rat�n (Pascopella y cols., 1995). Por su parte, S. typhimurium y S. typhi son capaces de penetrar c�lulas epiteliales humanas in vitro (Mills y Finlay, 1994), sugiriendo que ambos serovares utilizan mecanismos similares de invasi�n y "tr�fico intracelular" en el epitelio intestinal y que este proceso no ser�a clave en la definici�n de la especificidad de hospedero que presentan ambas bacterias. Ya que los macr�fagos de distintas especies animales podr�an diferir en su capacidad de neutralizar un serotipo particular de Salmonella, la adaptaci�n a un nuevo hospedero requerir�a de una adaptaci�n a sus fagocitos mononucleares. Con esta hip�tesis en mente se ha podido establecer que S. typhi es capaz de sobrevivir en macr�fagos de origen humano, pero no en macr�fagos de origen murino. De manera rec�proca, S. typhimurium es capaz de sobrevivir en macr�fagos de origen murino, pero es incapaz de hacerlo en macr�fagos de origen humano (Vladoianu y cols., 1990). En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la habilidad de los distintos serotipos de Salmonella para causar una enfermedad sist�mica se relaciona de forma directa con su capacidad de resistir la acci�n bactericida de los macr�fagos de un hospedero determinado. De esta forma, los fagocitos mononucleares comprender�an una barrera importante, si no la principal, capaz de restringir el rango de hospedero de los distintos serotipos de Salmonella.
En a�os recientes ha sido reportado que la invasi�n de Salmonella a macr�fagos in vitro causa que una importante poblaci�n de estas c�lulas hospederas entren en apoptosis (Monack y cols., 1996; Chen y cols., 1996; Lindgren y cols., 1996). La citotoxicidad producida en los macr�fagos es estrictamente dependiente de la expresi�n de los genes presentes en la SPI 1 (Chen y cols., 1996; Lundberg y cols., 1999). Estas observaciones han permitido postular que la capacidad de inducir la muerte de los macr�fagos infectados es un mecanismo esencial de virulencia para S. typhimurium (Lindgren y cols., 1996). Como se ha discutido, las caracter�sticas del proceso infeccioso producido por Salmonella sugieren que la capacidad de sobrevivir en los macr�fagos, m�s que la capacidad de matarlos, es el mecanismo m�s coherente para explicar la etiolog�a de las fiebres ent�ricas. De hecho, si la citotoxicidad producida en los macr�fagos fuese esencial para la infecci�n sist�mica, uno esperar�a que cepas con mutaciones en genes de la SPI 1 fueran atenuadas al ser inoculadas en ratones por v�a intraperitoneal. Contrariamente, estas mutantes han demostrado ser totalmente virulentas al realizar este tipo de ensayos (Groisman y Ochman, 1997).
a ser infectado por Salmonella
No todas las cepas de rat�n son igualmente susceptibles a ser infectadas por S. typhimurium. Actualmente se conocen varios loci que afectan la capacidad del rat�n para resistir infecciones sist�micas causadas por S. typhimurium y otros pat�genos invasivos. Uno de estos loci corresponde a ity. Ha sido descrito que ratones con mutaciones en este locus (ItyS) poseen una baja poblaci�n de macr�fagos y c�lulas polimorfonucleares activadas, que los hace susceptibles a ser infectados por S. typhimurium, mientras que los animales ItyR presentan resistencia a la infecci�n (Salyers y Whitt, 1994). Los fenotipos de resistencia y susceptibilidad a la infecci�n asociados al locus ity son expresados a nivel de los macr�fagos peritoneales y espl�nicos del rat�n (Lissner y cols., 1983; Salyers y Whitt, 1994). Otro locus importante es lps, cuya mutaci�n afecta a una variedad de tipos celulares, como linfocitos B y T, macr�fagos y fibroblastos. Ratones con mutaciones en lps no producen citoquinas cuando son inyectados con LPS (Salyers y Whitt, 1994). Un tercer locus importante es xid, cuya mutaci�n genera animales con linfocitos B alterados, que producen anticuerpos (IgG e IgM) m�s lentamente que linfocitos de ratones normales (Salyers y Whitt, 1994). Es importante destacar que todos los loci involucrados con la susceptibilidad de un hospedero animal a sufrir infecciones causadas por pat�genos invasivos corresponden a factores que, de alguna forma u otra, modulan la actividad y agresividad del sistema inmune, preferentemente a nivel de sus macr�fagos.
Recientemente, se ha establecido una importante diferencia entre los mecanismos de invasi�n usados por S. typhi y S. typhimurium. S. typhi utiliza al CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) como receptor para entrar en c�lulas del epitelio intestinal humano, mientras que S. typhimurium no lo usa (Pier y cols., 1998). Esta marcada diferencia podr�a estar relacionada con los diferentes rangos de hospedero y los s�ntomas de la enfermedad causada por ambos pat�genos. Interesantemente, �ste es uno de los pocos trabajos en que se relaciona la invasi�n del epitelio intestinal con la especificidad de hospedero de distintos serovares de Salmonella.
Como es sabido, durante la evoluci�n los animales han desarrollado una variedad de mecanismos para la detecci�n y el control de las infecciones microbianas. Algunos de estos mecanismos no requieren de un encuentro previo con el pat�geno y son altamente inespec�ficos. Tambi�n existen otros mecanismos que requieren de un encuentro previo con el pat�geno y tienden a ser extremadamente espec�ficos. Sorprendentemente, la posible existencia de un mecanismo que permita el reconocimiento de ciertos pat�genos comunes en forma espec�fica por un hospedero mam�fero "naive" no ha sido estudiada en profundidad (Gal�n, 1998).
Este mecanismo ha sido ampliamente descrito en plantas, las cuales carecen de un sistema inmune adaptativo y han evolucionado estrategias para reconocer y eliminar en forma espec�fica ciertos pat�genos microbianos, montando una respuesta de defensa localizada conocida como la "respuesta hipersensible". Esta respuesta es caracterizada por una destrucci�n localizada del tejido en el sitio de la infecci�n (necrosis local), la que restringe severamente la diseminaci�n sist�mica del pat�geno en el organismo vegetal (Van den Ackerveken y Bonas, 1997; Bonas y Van den Ackerveken, 1997; Gal�n, 1998). La respuesta hipersensible es acompa�ada por otras respuestas de la planta, entre las que se incluyen un estallido oxidativo, la acumulaci�n de mol�culas mensajeras intracelulares, como el �cido salic�lico, y la activaci�n transcripcional de genes que codifican prote�nas relacionadas con la defensa ante una agresi�n mediada por pat�genos (PR) (Parker y Coleman, 1997). Este conjunto de respuestas anexas a la respuesta hipersensible es conocida como la "respuesta sist�mica adquirida" (SAR).
La especificidad de hospedero en enfermedades bacterianas ha sido extensamente estudiada en fitopat�genos de los g�neros Pseudomonas y Xanthomonas. El estrecho rango de hospedero que presentan estos pat�genos resulta de la habilidad, que posee la mayor�a de las plantas (las llamadas "no hospederas"), de reconocer a la bacteria en etapas tempranas del proceso infectivo y de montar una bater�a de respuestas de defensa. Hoy sabemos que las bases gen�ticas del proceso de resistencia est�n determinadas por la presencia de los llamados "genes de resistencia" (R), presentes en el hospedero, y de los correspondientes "genes de avirulencia" (avr), presentes en el pat�geno (Van den Ackerveken y Bonas, 1997). De esta forma, la respuesta de defensa existe como una consecuencia de la interacci�n espec�fica entre el producto de un gen R y el producto de un gen avr, tal como propuso Flor cuando enunci� su famosa hip�tesis del reconocimiento "gen por gen" (Flor, 1971; Leach y White 1996).
Estudios recientes han establecido que la mayor�a de los factores de "avirulencia" de fitopat�genos son "presentados" al hospedero mediante sistemas de secreci�n de prote�nas de tipo III, cuyos componentes se encuentran muy conservados en pat�genos animales (Van Gijsegem y cols., 1993; Hueck 1998). Estas observaciones permiten inferir que alg�n pat�geno animal que posea dicho sistema de secreci�n podr�a utilizarlo para introducir "equivalentes funcionales" de determinantes de avirulencia en su hospedero.
Esta novedosa hip�tesis se ha visto respaldada por la aparici�n de un trabajo que describe la identificaci�n y caracterizaci�n de una prote�na de S. typhimurium llamada AvrA, que es secretada y translocada al interior de c�lulas eucariontes por medio del sistema de secreci�n tipo III codificado en la isla de patogenicidad SPI1 (Hardt y Gal�n, 1997). De hecho, el gen que codifica para esta prote�na (avrA) tambi�n se localiza en esta isla de patogenicidad. AvrA comparte una gran similitud a nivel de secuencia aminoac�dica con YopJ, prote�na secretada por Yersinia spp., y AvrRxv, prote�na de avirulencia secretada por Xanthomonas campestris. Notablemente, AvrA y YopJ comparten otras caracter�sticas comunes a los genes de avirulencia. Aparte de ser secretadas por un sistema de tipo III, su inactivaci�n no conduce a la p�rdida de virulencia y, al menos en el caso de AvrA, el gen que la codifica est� presente en un grupo discreto de representantes dentro de su especie (Hardt y Gal�n, 1997; Gal�n, 1998). El asunto se vuelve m�s atractivo si notamos que S. typhi carece del gen avrA. En conjunto, estos interesantes resultados sugieren la posible existencia de mecanismos comunes entre enterobacterias y fitopat�genos en relaci�n a la definici�n de hospederos espec�ficos dentro del g�nero Salmonella y, m�s espec�ficamente, en relaci�n a la definici�n del ser humano como hospedero de S. typhi.
A las puertas del siglo XXI, enfermedades infecciosas como la fiebre tifoidea contin�an representando un problema de salud p�blica en los pa�ses en v�as de desarrollo. Esto hace imprescindible implementar estrategias de prevenci�n y control de la enfermedad, as� como estrategias que apunten al mejoramiento de las condiciones sanitarias de la poblaci�n.
A pesar de la activa investigaci�n realizada en los �ltimos a�os, a�n no se dispone de una vacuna segura y eficaz para el control de la fiebre tifoidea. Esto se debe, en gran medida, a una falta de conocimiento b�sico sobre los mecanismos de virulencia de S. typhi. El lento progreso en la adquisici�n de este conocimiento se debe parcialmente al hecho que S. typhi es un pat�geno exclusivo del ser humano.
A la luz de los hechos, se hace imperativo estudiar los mecanismos moleculares que rigen la patogenicidad de S. typhi. Los conocimientos obtenidos a partir de dichos estudios no solo conducir�n al desarrollo de estrategias racionales dirigidas al control eficaz del pat�geno, sino que tambi�n permitir�n comprender aspectos relevantes de la relaci�n pat�geno-hospedero que, eventualmente, ser�n utilizados en el dise�o de nuevas vacunas e incluso en el desarrollo de nuevos f�rmacos antibi�ticos. Por otra parte, el conocimiento generado tambi�n permitir� adentrarnos en los mecanismos que gobiernan la interacci�n entre bacterias y c�lulas eucariontes, as� como en procesos b�sicos de la fisiolog�a celular tales como el ensamblaje y organizaci�n del citoesqueleto y la din�mica de transducci�n de se�ales provenientes del medio intra y extracelular.
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