Patogenicidad de Salmonella typhi"
Programa de Microbiolog�a
Instituto de Ciencias Biom�dicas
Universidad de Chile
El g�nero Salmonella comprende m�s de 2.200 serovares distintos, algunos de los cuales pueden infectar un amplio rango de hospedero. S. enteritidis, por ejemplo, es capaz de infectar un gran n�mero de aves y mam�feros, incluyendo el hombre, causando una variedad de s�ntomas dependiendo del hospedero. Otros, en cambio, son altamente adaptados a un hospedero espec�fico, como es el caso de S. gallinarum que infecta s�lo a aves, o S. typhi, que es el �nico serovar conocido que infecta exclusivamente al hombre, produciendo la fiebre tifoidea (Collins, 1974).
A�n cuando la incidencia de la fiebre tifoidea tiende a disminuir, se ha estimado que anualmente se presentan 16,6 millones de casos de fiebre tifoidea, y aproximadamente 600.000 muertes en el mundo (Pang y col., 1995). Conociendo la real dimensi�n del problema de salud p�blica que representa esta enfermedad, en general, en los pa�ses en v�as de desarrollo, se hace imprescindible implementar nuevas estrategias de prevenci�n y control. Estas estrategias deben estar dirigidas a mejorar las condiciones sanitarias y tratamientos de agua y por otra parte a desarrollar vacunas con mayor eficacia que las dise�adas hasta ahora (Dougan y col., 1987; Pang y col., 1995). Por esta raz�n, es necesario estudiar las bases moleculares de los mecanismos de patogenicidad de S. typhi, cuya comprensi�n permitir� abordar el problema desde nuevas perspectivas.
S. typhi inicia su ciclo infectivo en el hombre al ser ingerida en alimentos y aguas contaminadas. Luego de sobrevivir a los mecanismos de defensa presentes en el tracto digestivo, la bacteria atraviesa la barrera intestinal a nivel del �leo, para llegar al tejido linfoide subyacente. Desde all� las bacterias son fagocitadas y transportadas dentro de los macr�fagos hacia los n�dulos linf�ticos mesent�ricos, donde se multiplican y se diseminan al torrente sangu�neo, desencadenando as� la fiebre tifoidea. Una �ltima fase del ciclo se llevar�a cabo s�lo en algunos individuos y consiste en el asentamiento de la bacteria en �rganos como la ves�cula biliar, lo cual conduce al estado de portador cr�nico (Takeuchi, 1967; Finlay y Falkow, 1989)
A�n cuando el ciclo infectivo de Salmonella parece bien caracterizado a nivel fisiol�gico (Takeuchi, 1967; Francis y col., 1992), no se conocen en detalle los mecanismos moleculares de este proceso. Entre las etapas claves del ciclo infectivo de S. typhi y de otras Salmonellas, destacan la invasi�n de c�lulas epiteliales y la sobrevivencia dentro de macr�fagos, que le permite a la bacteria diseminarse en el sistema ret�culoendotelial y permanecer en �l.
La mayor parte de la informaci�n en relaci�n a los mecanismos de invasi�n a c�lulas epiteliales y sobrevivencia en macr�fagos murinos, ha sido derivada de ensayos en cultivos celulares. En el modelo de S. typhimurium-rat�n se ha podido demostrar una relaci�n directa entre la virulencia de la bacteria in vivo, con la capacidad de invadir c�lulas epiteliales y sobrevivir en macr�fagos in vitro, validando de esta forma la importancia de estos eventos en la patogenicidad de la bacteria (Gal�n y Curtiss, 1989; B�umler y col., 1994; Penheiter y col., 1997). El estudio de mutantes defectuosas en estos procesos, ha permitido descifrar poco a poco los mecanismos por los cuales la bacteria logra acceder al interior del hospedero y sobrevivir en �l.
S. typhimurium atraviesa la barrera epitelial del intestino de rat�n, desde la superficie apical hacia el tejido subyacente, induciendo importantes cambios morfol�gicos en el epitelio. Entre ellos se destaca la desaparici�n de las microvellosidades en los puntos de contacto entre la bacteria y la c�lula eucari�tica (Clark y col., 1994; Jones y col., 1994; Penheitter y col., 1997). Cambios similares se han registrado in vitro. El contacto de la bacteria con la c�lula eucari�tica es capaz de inducir reordenamientos del citoesqueleto de la c�lula debido a polimerizaci�n de micro-filamentos de actina, que conducen a movimientos ondulatorios denominados "ruffling" y permiten finalmente englobar a la bacteria en vacuolas (Francis y col., 1992; 1993). Estos eventos son acompa�ados adem�s por aumento de la concentraci�n intracelular de Ca2+ y una captaci�n masiva de flu�do extracelular o macropinocitosis. (Pace y col., 1993; Garc�a del Portillo y Finlay, 1994). Cada una de estas etapas es esencial para que la bacteria sea internalizada; de hecho, mutantes de S. typhimurium defectuosas en invasi�n fueron incapaces de inducir estos cambios en c�lulas epiteliales (Ginocchio y col., 1992; Ginocchio y col., 1994; Garc�a del Portillo y Finlay, 1994). La c�lula epitelial cumple un rol activo en este proceso, ya que la interacci�n de la bacteria con la c�lula a 4�C no culmina con la invasi�n de la bacteria, solo es posible detectar adherencia a la c�lula. Adem�s, al inhibir la polimerizaci�n de actina, usando citocalasinas, es posible bloquear la internalizaci�n de la bacteria (Finlay y Falkow, 1988).
Estudios del fenotipo invasor de S. typhi a c�lulas epiteliales han mostrado que, en l�neas generales, este proceso es similar al caracterizado en S. typhimurium y otras enterobacterias. Se destaca la capacidad de inducir "ruffling" en la c�lula epitelial, la inhibici�n de la entrada de la bacteria a la c�lula por acci�n de citocalasinas, la cin�tica de entrada, a�n cuando la eficiencia de la invasi�n es menor para S. typhi (Yabuuchi y col., 1986; Mroczenski-Wildey y col., 1989; Mills y Finlay, 1994; Leclerc y col., 1998).
S. typhi tambi�n es capaz de invadir c�lulas M in vitro (Kohbata y col., 1986). Las c�lulas M son c�lulas epiteliales especializadas (membranosas), que participan en la transferencia de ant�genos desde el lumen intestinal a los fol�culos linfoides a los cuales est�n asociadas. Representan alrededor del 10% del total de c�lulas presentes en las placas de Peyer (Owen y Jones, 1974). En el modelo de segmentos de �leo de rat�n ligado, se ha visto que S. typhi y S. typhimurium son capaces de asociarse preferen-cialmente a las c�lulas M, pero s�lo S. typhimurium ser�a capaz de destruir estas c�lulas y producir un da�o importante en el epitelio; S. typhi producir�a un da�o menor en las c�lulas M sin alterar los enterocitos de la capa epitelial (Kohbata y col., 1986; Clark y col., 1994; Jones y col., 1994; Pascopella y col., 1995; Penheitter y col., 1997).
No obstante la similitud de proceso global, persisten diferencias entre S. typhi y S. typhimurium en los mecanismos de infecci�n. Se ha demostrado in vitro que la presencia del lipopolisac�rido (LPS) intacto es necesaria para que S. typhi pueda ser internalizada por c�lulas HeLa (Mroczenski-Wildey y col., 1989). Sin embargo, se ha probado que mutantes rugosas (con LPS defectivo) son tan virulentas como la cepa silvestre y son capaces de producir la enfermedad en humanos (Hone y col., 1988). En cambio, en S. typhimurium se ha observado que mutantes rugosas por defectos en el gen galE, que codifica para una enzima involucrada en la s�ntesis del LPS, son atenuadas cuando son inoculadas en rat�n o en ternero (Clarke y Gyles, 1986; Hone y col., 1987).
Usando mutantes por inserci�n de Tn5 se ha demostrado que la motilidad de la bacteria afecta el fenotipo invasor en S.typhi, pero no en S. typhimurium (Liu y col., 1988). Por otro lado, S. typhimurium requiere la presencia de un plasmidio para expresar su potencial virulento, elemento que no est� presente en S. typhi (Roudier y col., 1990). El perfil de regulaci�n de algunos factores de virulencia dependientes de PhoP/PhoQ aparece diferente entre ambas Salmonellas, (Baker y col., 1997), lo cual sugiere respuestas adaptativas distintas frente a los mismos est�mulos. Uno de los hallazgos m�s recientes indican que S. typhi carece de uno de los genes codificados dentro de la isla de patogenicidad de Salmonella, SPI 1, denominado avrA por la homolog�a que presenta con genes de avirulencia de fitopat�genos (Hardt y Gal�n, 1997). Este interesante resultado sugiere la posibilidad que existan mecanismos comunes entre enterobacterias y fitopat�genos en relaci�n a la especificidad de hospedero, mecanismo que a�n se desconoce para S. typhi.
La tendencia general de los primeros estudios de la gen�tica de los procesos de invasi�n y proliferaci�n intracelular de pat�genos ent�ricos y especialmente de Salmonella, se basaron en el clonamiento de genes capaces de conferir la capacidad invasora a una cepa de E. coli no invasora. Esta estrategia fue muy efectiva para Yersinia pseudotuberculosis, ya que se clon� el locus inv, cuyo producto g�nico fue, por s� s�lo, capaz de conferir el fenotipo invasor a una cepa de E. coli no invasora (Isberg y Falkow, 1985). En Yersinia enterocolitica se descubri� un segundo locus denominado ail, que codifica para una prote�na de la membrana externa. Esta prote�na, en conjunto con la prote�na Inv, ser�an responsables de conferir el fenotipo invasor a Yersinia enterocolitica (Miller y Falkow, 1988).
Para S. typhi en cambio, esta estrategia no result� exitosa, ya que s�lo se logr� transferir parcialmente el fenotipo invasor a E. coli. Elsinghort y colaboradores aislaron clones de E. coli que invadieron c�lulas epiteliales entre un 4 a un 7% respecto a lo observado para S. typhi (Elsinghort y col., 1989). Esto sugiere que la expresi�n de este fenotipo en Salmonella es multifactorial. En este trabajo, se caracterizaron los plasmidios que confer�an el fenotipo invasor y se logr� identificar un locus denominado inv. �ste tambi�n estaba presente en S. typhimurium, pero al ser transferido a E. coli no logr� modificar el fenotipo no invasor de la cepa.
Los primeros estudios gen�ticos del proceso de invasi�n en S. typhimurium consistieron en clonar genes provenientes de una cepa virulenta que complementaran a una cepa no virulenta para el rat�n; de esta forma se logr� ubicar un locus distinto al descrito para S. typhi, que tambi�n se llam� inv (Gal�n y Curtiss, 1989).
Otra estrategia ampliamente utilizada para comprender la gen�tica del fenotipo invasor, ha sido la caracterizaci�n de mutantes que carezcan de esta propiedad, obtenidas por inserci�n de transposones como Tn10, TnphoA, y derivados de Mu, que inactivan el gen en el cual se insertan. Gal�n y colaboradores utilizaron esta estrategia para caracterizar el locus inv de S. typhimurium. Ellos demostraron que este locus, compuesto de al menos 13 genes, est� presente en la mayor�a de los serotipos de Salmonella, incluyendo S. typhi (Gal�n y Curtiss III, 1991; Gal�n, 1996). M�s a�n, obtuvieron mutantes en distintos genes inv que presentaron defectos en la capacidad de invadir c�lulas epiteliales en cultivo, indicando que estos genes est�n involucrados funcionalmente en el fenotipo invasor. Demostraron adem�s que mutantes inv de S. typhimurium son menos virulentas que la cepa silvestre en ratones cuando son inoculadas oralmente, aumentando la dosis letal cincuenta (LD50) en 2 a 3 �rdenes de magnitud (Gal�n y Curtiss , 1991). Cabe destacar, sin embargo, que estas mutantes son igualmente virulentas que la cepa silvestre cuando son administradas por v�a intraperitoneal (Gal�n y col., 1992). En S. typhimurium ya se han caracterizado seis loci distintos implicados en el fenotipo invasor (Betts y Finlay, 1992). Un estudio similar indic� que en S. enteritidis existen al menos nueve loci distintos, de los cuales uno corresponde al locus inv descrito para S. typhimurium (Stone y col., 1992). Estos resultados sugieren la gran complejidad del proceso de invasi�n o entrada a las c�lulas eucari�ticas en Salmonella.
Tambi�n se han obtenido mutantes de S. typhi defectivas en invasi�n (Hermant y col., 1995; Leclerc y col., 1998). La mayor�a de las mutantes aisladas en estos trabajos coincidieron en el aislamiento de genes hom�logos a algunos descritos en S. typhimurium (Behlau y Miller, 1993; Kaniga y col., 1994, 1995).
En los �ltimos diez a�os se ha logrado descifrar un gran n�mero de genes involucrados en el proceso de entrada de S. typhimurium a c�lulas epiteliales. La mayor�a de los genes identificados est�n agrupados en zonas espec�ficas del cromosoma, de gran tama�o, denominadas "islas de patogenicidad", que probablemente han sido adquiridas por transferencia horizontal, ya que presentan un contenido de G+C distinto del promedio de la bacteria (Hacker y col., 1997). En S. typhimurium se han definido cuatro islas de patogenicidad, SPI, que est�n presentes en aislados cl�nicos virulentos y ausentes en las cepas no virulentas, participando directa o indirectamente en los eventos de entrada de la bacteria a las c�lulas epiteliales y la sobrevida en el interior de los macr�fagos (Gal�n, 1996; Shea y col., 1996; Blanc-Potard y Groisman, 1997; Wong y col., 1998). Tres de estas SPI han sido detectadas en S. typhi (Ochman y Groisman, 1996; Wong y col., 1998).
La mayor�a de los genes involucrados en el proceso de invasi�n a c�lulas epiteliales, descritos hasta ahora, est�n agrupados en la SPI 1. �sta es espec�fica para Salmonella y se ubica en el minuto 63 del cromosoma de S. typhimurium (Gal�n, 1996). Gran parte de los genes presentes en la SPI 1, entre ellos el locus inv/spa, codifican para genes estructurales y regulatorios de un nuevo sistema de secreci�n, denominado tipo III (Gal�n, 1996). Este aparato de secreci�n permitir�a exportar algunas prote�nas, codificadas tambi�n en este locus, a la superficie bacteriana de S. typhimurium. Se ha visto que este sistema de secreci�n permitir�a adem�s translocar algunas prote�nas directamente al citoplasma de la c�lula epitelial (Collazo y col., 1995; Wood y col., 1996; Collazo y Gal�n, 1997). No se ha establecido a�n si las prote�nas caracterizadas en estos trabajos son los verdaderos efectores que inducir�an la internalizaci�n de la bacteria. El sistema de secreci�n ser�a espec�fico para la secreci�n de factores de virulencia. Un an�lisis de la secuencia de los genes que codifican para este aparato de secreci�n indican que existen sistemas semejantes en otros enteropat�genos como Shigella y Yersinia y tambi�n en fitopat�genos como Pseudomonas solanacearum y Xanthomonas campestris y presentan adem�s alta homolog�a con los genes involucrados en el ensamblaje del flagelo de E. coli (Van Gijsegem y col., 1993).
La segunda SPI caracterizada en S. typhimurium, SPI 2, fue descubierta mediante selecci�n negativa de aquellas mutantes incapaces de sobrevivir en el rat�n y se ubica en el minuto 31 del mapa de S. typhimurium (Hensel y col., 1995). El an�lisis de la secuencia de los genes involucrados en este loci, indic� que tambi�n codificar�a para un aparato secretor tipo III, cuya expresi�n ser�a importante en la sobrevida de la bacteria dentro de los macr�fagos y por lo tanto en la virulencia del enteropat�geno (Shea y col., 1996).
Las estrategias gen�ticas m�s recientes utilizadas para la identificaci�n de genes implicados en la virulencia bacteriana, se basan en la obtenci�n de mutantes que disminuyen o pierden su capacidad virulenta, usando al animal como medio de selecci�n. Una de ellas se denomina IVET (tecnolog�a de expresi�n in vivo), que permite el aislamiento de genes bacterianos espec�ficamente inducidos durante la infecci�n. Para ello, se utilizan genes reporteros sin promotor propio, que codifican para una v�a sint�tica que complementa un defecto metab�lico de la bacteria receptora. �ste se expresa s�lo cuando la construcci�n g�nica queda bajo el promotor de un gen que se induce durante el ciclo infectivo de la bacteria. De esta forma, al infectar un rat�n con un grupo de mutantes, se recuperan desde los �rganos internos s�lo aquellas mutantes capaces de sobrevivir en el rat�n (Heithoff y col., 1997). Otro sistema que ha aportado importante informaci�n respecto a los genes de virulencia en S. typhimurium es el m�todo de selecci�n negativa por el cual se identific� la SPI 2, que consiste en marcar individualmente cada mutante con un transpos�n que lleva un segmento de DNA generado al azar y que es diferente para cada clon. Esta marcaci�n permite reconocer los clones ausentes en el grupo de mutantes recuperadas desde el rat�n infectado, lo que implica que corresponden a clones incapaces de sobrevivir en el rat�n (Hensel y col., 1995).
Utilizando estas t�cnicas, se ha demostrado que no s�lo los genes tradicional-mente involucrados en el fenotipo invasor, como los ya mencionados, o aqu�llos que codifican para toxinas son importantes en la virulencia bacteriana, sino tambi�n algunos genes implicados en el metabolismo general o tambi�n llamados "housekeeping genes".
Algunos de los genes identificados usando estas estrategias g�nicas codifican para funciones regulatorias, los que permitir�an responder coordinando la expresi�n de los factores de virulencia necesarios en un determinado momento (phoP/phoQ; envZ/ompR). Un importante n�mero de genes inducidos durante la infecci�n corresponden a genes metab�licos, que probablemente pueden contribuir a la sobrevida del pat�geno y su persistencia en condiciones limitadas de nutrientes. Es factible tambi�n que no sean esenciales para la virulencia de la bacteria debido a sus funciones bioqu�micas, sino que podr�an cumplir otros roles en el proceso de infecci�n (Hensel y col., 1995; Heithoff y col., 1997).
Estos resultados han puesto en discusi�n la definici�n de factores de virulencia, que en un sentido m�s amplio acepta que cualquier propiedad que le permita al pat�geno entrar, crecer o sobrevivir en el hospedero podr�a ser considerado como factor de virulencia. Esto incluye por ejemplo: ant�genos de superficie que eviten los efectos del complemento; estructuras de la bacteria que permitan adherirse a las c�lulas blanco; sistemas reguladores que le permitan adaptarse a las condiciones ambientales que el hospedero ofrece, e incluso actividades enzim�ticas que le permitan sintetizar nutrientes que no est�n disponibles en el hospedero (Slauch y col., 1997).
La interacci�n bacteria-hospedero en el ciclo infectivo de un par�sito intracelular facultativo es un proceso din�mico, durante el cual el pat�geno est� expuesto a diversos ambientes intra- y extracelulares. Estos cambios son percibidos por la bacteria, provocando una respuesta que le permite adaptarse a las nuevas condiciones y sobrevivir en ellas (Mekalanos, 1992).
La expresi�n de muchos, si no todos, los genes requeridos para la invasi�n a c�lulas epiteliales est� finamente regulada en respuesta a las condiciones ambientales presentes en el intestino, donde prima la baja disponibilidad de ox�geno, la carencia de hierro y la alta osmolaridad entre otros (Mekalanos, 1992).
Se ha demostrado por ejemplo, que S. typhimurium crecida en condiciones anaer�bicas aumenta su capacidad invasora en c�lulas en cultivo respecto a la bacteria crecida aer�bicamente (Schiemann y Shope, 1991). Adem�s, se han aislado genes inducidos en anaerobiosis, por ejemplo el gen orgA codificado en la SPI 1, que al ser mutados hacen a la bacteria menos virulenta que la cepa silvestre (atenuada). La prote�na deducida para el gen orgA no presenta similitud con prote�nas conocidas y se desconoce hasta la fecha su funci�n y su relaci�n con el fenotipo invasor (Jones y Falkow, 1994).
Los enteropat�genos est�n presentes en aguas contaminadas, donde el ambiente generalmente presenta temperatura y osmolaridad menor que aqu�llas que la bacteria encuentra en el hospedero. Se ha demostrado que cambios en estos par�metros influyen sobre la capacidad de la bacteria de invadir c�lulas en cultivo. Shigella flexneri por ejemplo, es virulenta in vivo a 37�C pero no a 30�C, hecho que correlaciona con la capacidad de invadir cultivos celulares a 37�C, y no a 30�C (Maurelli y col., 1984; Maurelli y Sansonetti, 1988).
Consecuentemente, no s�lo el fenotipo invasor es afectado por las condiciones ambientales, sino tambi�n la expresi�n de genes involucrados en este fenotipo es modificada por las condiciones del medio ambiente. Usando como gen reportero lacZ fusionado a genes involucrados en el fenotipo invasor, se demostr� que la variaci�n de pH, disponibilidad de ox�geno y osmolaridad modifican la expresi�n de estos genes (Bajaj y col., 1996). Adem�s, se demostr� que estas variaciones son dependientes del regulador transcripcional HilA (Bajaj y col., 1995). Este regulador coordinar�a la expresi�n de los genes pertenecientes a la SPI 1 de acuerdo a las condiciones del medio ambiente, para favorecer la expresi�n del fenotipo invasor cuando la bacteria reconoce las condiciones ambientales que encuentra en el interior del hospedero (Bajaj y col., 1996).
Los mecanismos por los cuales la bacteria responde a los cambios del medio ambiente, en general se basan en los sistemas de regulaci�n de dos componentes. Est�n constitu�dos por una prote�na sensora, generalmente inserta en la membrana citopl�smica que transmite la se�al al segundo componente que es el regulador, prote�na soluble que puede unirse al DNA y modificar su expresi�n. El gen hilA, que forma parte de la SPI, codifica para el regulador HilA y presenta similitud de secuencia con reguladores del tipo OmpR/ToxR, pertenecientes al sistema cl�sico de regulaci�n de dos componentes (Bajaj y col., 1995). Otro ejemplo de genes reguladores de la expresi�n de determinantes de virulencia, lo constituye el sistema phoP/phoQ descrito en S. typhimurium. Este sistema regula la expresi�n de los genes pag (activados por PhoP) y los genes prg (reprimidos por PhoP), involucrados en la capacidad de sobrevivir dentro del macr�fago (Miller y col., 1991) y tambi�n coordinar�a la regulaci�n del fenotipo invasor en c�lulas epiteliales a trav�s de los genes prgH y hilA (Behlau y Miller, 1993; Bajaj y col., 1996).
La variaci�n de la topolog�a del DNA representa una forma de control global que tiene el potencial de influir en la expresi�n de algunos genes bacterianos, constituy�ndose en uno de los mecanismos de regulaci�n de la expresi�n de factores de virulencia (Dorman y Ni Brhiain, 1993). Esto se llevar�a a cabo a trav�s de las enzimas del tipo topoisomerasas y a trav�s de prote�nas que forman parte de la arquitectura del DNA. Se ha relacionado la regulaci�n de los factores de virulencia de Shigella, tanto por osmolaridad como por temperatura, a la expresi�n de la prote�na H-NS, que reprimir�a la expresi�n g�nica a baja temperatura y baja osmolaridad. Esta prote�na es una prote�na tipo histona involucrada en los cambios de topolog�a del DNA y que originalmente se describi� como el regulador VirR (Porter y Dorman, 1994). En S. typhi y S. typhimurium tambi�n se ha descrito que el fenotipo invasor es regulado por cambios en la osmolaridad del medio debido a cambios en la topolog�a del DNA (Gal�n y Curtiss III, 1990; Tartera y Metcalf, 1993).
