Teória e Instrucciones para usar el Spec 20 y Spec 21D
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| Spectronic 20 | Spectronic 20 | Spectronic 21D | Spectronic 21D UV-Vis |
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| Qué es Espectrofotometría? | Teória Básica| BLANCOS | Instructivo de Manejo | Ley de Beer-Lambert |Diapósitivas| |
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Espectrofotometría es una técnica empleada para mediar cuanta energía radiante absorbe una sustancia ante diferentes longitudes de onda de luz. Algunas sustancias absorben energía en el rango de luz visible (380-760 nm = Vis) mientras que otras substancias lo hacen a longitudes más cortas (Ultravioleta = UV) ó más largas (Infrarojo = IR). Midiendo el Espectro de Absorción de una sustancia, es decir todas las longitudes de onda en las que absorbe , es posible identificarla a partir de una muestra o al menos identificarla en un grupo de compuestos. La longitud de onda de absorción máxima, es útil para identificar una sustancia desconocida. Crenado y midiendo un serie de estándards (patrones ó referencias) podemos cuantificar la cantidad, concentración ó actividad de un asustancia en una mezcla.
La longitud de onda se selecciona ajustando un prisma dentro del instrumento de tal manera que solo un haz de luz se direccione a la muestra contenida en un dispósitivo llamado celda ó cubeta.
Teória: Transmitancia y Absorbancia
Transmitancia (T) se define como la fracción de luz incidente que es transmitida (dejada pasar) a través de una muestra en solución. Así, T = I/Io, donde Io es igual a la intensidad de luz que llega a la muestra, I es la intensidad de luz que logra atravesar la muestra. La transmitancia es frecuentemente expresada como porcentaje:
%T = (I/Io) x 100
Absorbancia (A), Densidad Óptica o Extinción, es una función logarítmica de T y se expresa como:
A = log10 (1/T) = log10 (Io/I)
Nota.- La absorbancia no tiene unidades. La notación para Absorbancia es Axxx, donde xxx es la longitud de onda a la cual se realiza la medición.Se expresa con formato x.xxx, siendo x un valor entero (0, 1) y xxx un valor decimal de tres dígitos.
Así, por ejemplo, con 100% de Transmitancia, A
= log 1.0 = 0. En 50% de transmitancia, A = log
(1/0.5) = 0.30. La escala es generalmente de 2 escalas, una calibrada de 0 a
100%. Transmitancia y la otra como Absorbancia, en rango desde infinito a
0. Observa que la más alta unidad calibrada de absorbance es 2.0. Los
datos espectrales son usualmente graficados como absorbancia (eje-Y) vs longitud
de onda ó concentración (eje-X).
Para medir la
absorbancia de una sustancia en particular en una mezcla, es necesario "calibrar
a cien" el espectrofotometro de tal forma que solo la absorbancia de la
sustancia de interés sea leida, es decir que solamente sea tomada en cuenta por
el detector la absorbancia correspondiente al (los) metabolito(s) presente en la
celda o cubeta. Esto se consigue con un Blanco de reactivo(s), una
cuveta que contiene todos los reactivos EXCEPTO la sustancia de
interes.
Algunas técnicas reuqiren que el poceso de calibración a "100" se
realize con blanco de agua (agua destilada) o con aire (sin celda).
| Paso | Spectronic 20 Analógico Vis | Spectronic 21D Digital (UV-Vis) | ||
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1. Encender el Spec 20/21D y permitir calentamiento por 5 - 10 minutos. Fijar la longitud de Onda con la perilla en panel. |
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Panel Trasero | ||
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2. Seleccionar la longitud de onda en que se habrá de realizar la determinación UV-Vis-IR. |
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4. Preparar un BLANCO adicionando los reactivos, EXCEPTO la sustancia a ser medida. |
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Un BLANCO es usado para calibrar el Spec 20/21D para que la absorbancia atribuible a los reactivos no sea tomada en cuenta. Ajustando a 100 el Spec con el blanco, mediremos solo la absorbancia debida a la(s) sustancia(s) de interes. | ||||
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5. Sin tubo en el compartimento de celdas, o con un cuerpo obscuro (didimo) ajusta la absorbancia a (= 0% transmitancia) usando la perilla de ajuste correspondiente. En este paso se cierra el paso de luz a través del compartimento de inserción de la celda.
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6. Usando un
pañuelo adecuado, limpia las paredes externas del tubo BLANCO para remover
huellas de grasa u otros contaminantes.
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7. Usando la perilla correspondiente, ajuste la escala en 0.0 (= 100 % transmitancia). Este paso se denomina ajustar "Escala Completa" o ajustar a 100. |
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| El Espectrofotómetro está ahora calibrado con el BLANCO. Si tu experimento involucra múltiples tubos de reacción, cada uno necesitará su propio BLANCO, y el Spec 20 debe ser calibrado a "0". | ||||
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8. Retira el BLANCO e inserte la celda conteniendo la muestra (puede ser el estándard). Cerrar la tapa y leer en la escala analógica o digital la absorbancia. |
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9. Repetir lectura para el resto de las muestras usando el mismo blanco o cambiandolo si se efectuará lectura de otro experimento o serie de tubos.
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NOTA: En ocasiones es necesario recalibrar si se trabaja con múltiples lecturas a la misma longitud de onda, es OBLIGATORIO calibrar cada vez que se desea efectuar mediciones a diferentes longitudes de onda. | |||
La ley de Beer-Lambert explica la relación entre absorbancia (A) y 2 parametros de la muestra: concentration de soluto (c) y longitud de ruta de luz (l) , el ancho de la celda. Simplemente la ley indica que la absorbancia, A, es directamente proporcional a c e l, y se representa por la ecuación:
A = µcl
donde, µ es una constante, el coeficiente de absorbancia.
Si se obtiene una curva estandard, graficando concentración vs absorbancia es posible predecir la concentración problema, apartir de la absorbancia, mediante la expresión,
c = A / µl
En la práctica clínica a partir de una curva de calibración, preparada a partir de diluciones de una mezcla, con concentraciones conocidas, es posible predecir la concentración a partir de la lectura de Absorbancia |
