INTRODUÇÃO À TÉCNICA HISTOLÓGICA
(TECIDOS ANIMAIS)
Sumário:
Introdução
Obtenção de preparações definitivas
Fixação
Inclusão
Cortes
Colagem dos cortes
Coloração
Montagem
Preparações que não necessitam de
inclusão
Tecido epitelial
Tecido conjuntivo
Tecido cartilagíneo
Tecido ósseo
Tecido sanguíneo
Tecido muscular
Tecido nervoso
Preparação de soluções e reagentes
Solução de Ringer
Hemalumen de Mayer
Aquisição de reagentes
Bibliografia
Ao
pretendermos estudar os tecidos animais deparamos com duas dificuldades
básicas:
-
os tecidos animais constituem na sua grande maioria estruturas opacas que não
podem ser estudadas directamente ao microscópio.
-
falta de contraste entre os componentes dos tecidos, bem como falta de
contraste entre os organitos celulares.
No
primeiro caso a dificuldade pode, em grande parte, ser ultrapassada reduzindo
as estruturas a cortes suficientemente finos para que sejam transparentes, ou
alternativamente dissociando tanto quanto possível os componentes do tecido. A
segunda dificuldade pode também em parte ser ultrapassada com auxílio de
corantes selectivos.
Atendendo
às limitações de material que existem na maioria das Escolas Secundárias,
pensamos que a execução de cortes finos em tecidos animais e a elaboração das
respectivas preparações definitivas não será viável, pelo que faremos aqui
apenas uma descrição sumária destas técnicas.
Todavia,
mesmo com material muito elementar é possível ilustrar certos aspectos
morfológicos dos tipos básicos de tecidos. Na segunda parte deste manual
descrevem-se experiências que envolvem unicamente técnicas de dissociação e
coloração e que por conseguinte não requerem material sofisticado para a sua
execução.
OBTENÇÃO DE PREPARAÇÕES DEFINITIVAS A PARTIR DE CORTES
A
preparação de material biológico para observação ao microscópio leva algum
tempo e corre-se o risco de enzimas celulares destruírem parte das estruturas
que pretendíamos observar (autólise). Para impedir este processo procede-se em
primeiro lugar à chamada fixação. Após a fixação o material tem de ser
reduzido a cortes finos. A fraca consistência dos tecidos animais (exceptuam-se
os tecidos ósseo e cartilagíneo) não permite todavia que se façam manualmente
cortes finos. Assim os tecidos tem de ser previamente endurecidos, o que se
consegue por congelamento ou por inclusão em celoidina ou em
parafina, e em seguida cortados com auxílio de instrumentos mais ou menos
sofisticados chamados micrótomos. Uma vez obtidos os cortes procede-se à coloração
e montagem do material.
Fixação
A
fixação consiste por um lado em matar rapidamente as células e interromper os
processos autolíticos já iniciados; por outro lado endurecer parcialmente os
tecidos para poderem suportar sem deformação a acção de reagentes e
manipulações técnicas a utilizar posteriormente.
O
fixador mais vulgar é o líquido Boiun que tem a seguinte composição:
-
Formol ............................................................ 5 partes
-
Soluto aquoso saturado de ácido pícrico ..........15 partes
-
Ácido acético .................................................. 1 parte
As peças são deixadas 24 horas
neste líquido e passam-se depois para álcool a 70º.
Resumo da técnica de
inclusão
Como
já foi referido a inclusão tem por fim endurecer os tecidos para que se possam
executar cortes finos. As diferentes etapas que a seguir se descrevem podem
racionalizar-se assim: 1) remoção da água dos tecidos com alcoois de grau cada
vez mais elevado; 2) substituição do álcool por um líquido que seja capaz de
funcionar como veículo de parafina; 3) parafina. Indicamos a seguir as etapas e
tempos utilizados correntemente.
primeiro
dia
Deixar
as peças em álcool a 70º de um dia para o outro.
segundo
dia
às
9h ....................................................... álcool a 90º
11h
......................................................... álcool absoluto
12h
......................................................... renovar o álcool
absoluto
13h
......................................................... xilol e álcool
(partes iguais)
15h
......................................................... xilol puro
17h
......................................................... xilol c/ parafina
(soluto saturado)
terceiro
dia
11h
......................................................... xilol e parafina na
estufa
13h
......................................................... banho de parafina
mole
14h
......................................................... banho de parafina
fundida na estufa
15h
......................................................... formação do bloco
Cortes
Os
blocos de parafina devem ser arrefecidos em água e cortados com a forma de
tronco de pirâmide. Em seguida os blocos são colocados na "cabeça do
micrótomo". Esta colagem é feita por fusão da parafina da base do bloco.
A
faca do micrótomo deve estar inclinada em relação ao bloco de tal modo que a
face voltada para a peça seja paralela à superfície do bloco. Se a inclusão
estiver bem feita, após cada movimento da peça sai um corte, e o que se segue
vem colar-se ao anterior pela aresta vizinha de forma que se constituem assim
fitas ou ténias de cortes.
Colagem de cortes
Os
cortes são separados da faca com um pequeno pincel ou uma agulha e em seguida
são colocados sobre lâminas. A colagem faz-se geralmente com água albuminosa
(albumina glicerinada) ou com uma substância conhecida pelo nome comercial de
"tissue tac". A água albuminosa prepara-se da seguinte maneira:
deita-se uma clara de ovo num copo graduado, adiciona-se igual volume de
glicerina, agita-se até à homogeneização e filtra-se.
Para
se efectuar a colagem procede-se da seguinte maneira: coloca-se uma gota de
substância colante, espalha-se e espera-se que seque. Seguidamente coloca-se
uma gota de água e sobre ela o corte. Escorre-se a água e leva-se a lâmina à
chama de uma lamparina para que o corte distenda, mas evitando a fusão da
parafina.
Coloração
Para
se proceder à coloração torna-se necessário remover a parafina e hidratar os
cortes. A sequência que se utiliza neste passo é pois inversa da inclusão:
-
xilol para desparafinar
-
álcool a 90º para remover o xilol
-
álcool a 70º
-
hidratação com água destilada
-
coloração e lavagem
Existem
várias técnicas de coloração. A que a seguir indicamos é uma das mais simples e
em regra dá bons resultados. Na etapa de coloração distinguem-se duas fases: coloração
nuclear e coloração citoplasmática. Para a coloração dos núcleos
filtram-se umas gotas de hemalúmen sobre os cortes, aguarda-se 15 minutos,
escorre-se o corante e lava-se com água. Para a coloração citoplasmática pode
utilizar-se soluto de eosina que se deixa actuar o tempo necessário para o
aparecimento de um tom róseo, escorre-se o corte e lava-se com água.
Montagem
A
montagem, última fase das preparações definitivas, é feita em bálsamo do Canadá
ou em euparal, substâncias que são insolúveis em água. Daí que após a coloração
se torna necessário desidratar os cortes como se indica a seguir:
-
álcool a 70º
-
álcool absoluto
-
xilol
-
bálsamo ou euparal
-
colocação da lamela
PREPARAÇÕES QUE NÃO NECESSITAM INCLUSÃO
Seguidamente
descrevem-se algumas preparações que podem ser facilmente executadas em
qualquer Escola Secundária uma vez que não requerem micrótomos ou outro
material sofisticado.
Tecido epitelial
Um
material de fácil obtenção para ilustração da morfologia do epitélio
pavimentoso é a camada superficial da pele da rã. Efectivamente os Batráquios
largam e renovam com grande facilidade a camada superficial da pele. Para o
efeito proceder da seguinte maneira:
1.
Deixar uma ou mais rãs num recipiente com água durante 2 ou 3 dias à
temperatura ambiente. Notar-se-á o aparecimento de farrapos epiteliais. Caso
isso não aconteça, tentar raspar com um escalpelo o ventre da rã dentro de
água.
2.
Com um pincel recolher alguns farrapos e agitá-los em água. Com duas agulhas
estendê-los sobre uma lâmina de maneira a obter uma preparação sem pregas.
3. Colocar uma gota de água, cobrir com uma lamela e observar.
Se se pretender obter uma
preparação definitiva fazer o seguinte:
4.
Estender um fragmento de epitélio numa lâmina e deitar sobre esta umas gotas de
álcool a 90º. Deixar actuar 5-10 minutos (fixação).
5.
Lavá-lo com água. Adicionar umas gotas de hemalúmen (ver "Preparação de
Soluções e Corantes").
6.
Passados 10 minutos lavar novamente o fragmento de epitélio agitando-o dentro
de água. recolhê-lo com a lâmina e corá-lo com eosina por mais 10 minutos
(coloração).
7.
Lavá-lo e estendê-lo outra vez sobre a lâmina.
8.
Deitar sobre o fragmento umas gotas de álcool a 90º e renovar o álcool por
várias vezes. repetir este processo utilizando agora álcool absoluto
(desidratação).
9.
Esclarecer com xilol (diafinização), com duas agulhas secas estender o
fragmento de modo a evitar pregas.
10.
Montar a preparação utilizando bálsamo ou euparal.
Tecido conjuntivo propriamente
dito
Os
aspectos genéricos da morfologia do tecido conjuntivo propriamente dito podem
ser estudados utilizando a variedade tecido conjuntivo frouxo. Para o efeito
proceder da seguinte forma:
1.
Sacrificar um coelho. Fazer uma incisão na pele da linha média do abdómen.
Puxar com as mãos, rasgando a pele em direcção às patas posteriores.
Notar-se-ão finas lamelas de tecido subcutâneo que ligam a pele às aponevroses
do músculo. Estas lamelas aparecem com maior dimensão na região posterior da perna
do animal.
2.
Introduzir uma lamela, bem limpa e desengordurada, sob uma destas membranas
conjuntivas de modo que ela adira à superfície do vidro. Quando o tecido tiver
aderido cortá-lo em torno da lamela e dobrar as margens que excederam esta,
para que o tecido continue distendido durante as fases subsequentes.
3.
Fixar com umas gotas de álcool a 90º.
4.
Lavar com água e corar com hemalúmen e eosina conforme descrito na preparação
anteriror.
Se se pretender uma preparação
definitiva proceder conforme foi explicado na preparação anterior.
Tecido cartilagíneo
A
estrutura básica do tecido cartilagíneo pode ser estudada utilizando a
cartilagem hialina do externo da rã ou a cartilagem que recobre superfícies
articulares. No primeiro caso proceder assim:
1.
Cortar as partes inferior ou superior do externo da rã.
2.
Colocar um fragmento de tecido numa gota de soluto isotónico de NaCl (0,15 M) e
cobrir com uma lamela.
No caso de se pretender utilizar
uma cartilagem articular proceder assim:
1.
Com uma navalha de barba bem afiada (alternativamente com uma lâmina de bisturi
ou uma lâmina do tipo "Gillette") fazer cortes tão finos quanto
possível na cartilagem que se encontra na extremidade do fémur da rã.
2.
Montar e examinar como no caso anterior.
Se se pretender uma preparação
corada fixar com o fixador de Boiun e corar com hemalúmen e eosina conforme
descrito anteriormente.
Tecido ósseo
Esta
preparação é um pouco morosa e requer muita paciência.
1.
Com uma serra de dente muito fino cortar, longitudinalmente ou
transversalmente, lâminas delgadas (< 1mm) de um osso seco.
2.
Colocar o fragmento do osso entre dois pedaços de pedra pomes, com faces
planas, ou entre duas pedras de afiar. Adelgaçar o fragmento raspando-o com
duas pedras até ficar praticamente transparente.
3.
Montar o fragmento em bálsamo do Canadá ou em euparal. No caso de utilizar
bálsamo deve aquecer a Lâmina, tendo todavia o cuidado de não deixar que o
bálsamo fique demasiado líquido para que não penetre nas cavidades ósseas.
Tecido sanguíneo
A
técnica mais correntemente utilizada para observação das células do sangue é
conhecida pela designação de esfregaço:
1.
Limpar a ponta de um dedo (de preferência o anelar da mão menos utilizada) com
algodão embebido em álcool ou éter. Picar a parte desinfectada com uma agulha
ou uma lanceta esterilizada e desprezar a 1ª gota de sangue.
2.
Colocar uma gota de sangue a cerca de 1 cm da extremidade de uma lâmina que
tenha permanecido em álcool durante algumas horas.
3.
Encostar uma lâmina de bordos esmerilados à lâmina normal de maneira que as
duas formem um ângulo de 45º. Fazer deslizar a Lâmina de bordos esmerilados até
que ela contacte com a gota de sangue. Aguardar que o sangue se estenda ao
longo da aresta; em seguida deslocar a Lâmina em sentido inverso, sem
interrupções e mantendo o ângulo de 45º.
4.
Secar o esfregaço ao ar.
5.
Cobrir o esfregaço com 5 gotas de reagente de Wright e deixar actuar por 2,5
minutos. Adicionar umas gotas de água, homogeneizar a mistura e deixar actuar 3
a 4 minutos.
6.
Escorrer o corante e lavar com água destilada.
7.
Secar ao ar.
Se pretender obter uma preparação
definitiva basta colocar uma gota de bálsamo do Canadá ou de euparal, cobrir
com uma lamela e deixar secar alguns dias.
Tecido muscular
O
tecido muscular liso pode ser estudado por observação directa da bexiga de um
Batráquio.
1.
Sacrificar uma rã. Abrir a cavidade abdominal tendo o cuidado de não cortar a
bexiga. Cortar a bexiga no ponto em que ela se liga à cloaca. Se a bexiga
estiver cheia melhor será, pois isso facilita as operações subsequentes. Neste
caso dever-se-á, com auxílio de um fio, dar um nó para que o órgão seja
extraído com líquido.
2.
Abrir a bexiga no sentido do comprimento e encostar-lhe uma lamela fazendo o
possível para que a face interna fique voltada e colada à lamela.
3.
Montar o conjunto numa lâmina contendo uma gota de NaCl (0,15 M).
Para um estudo simples do tecido
muscular estriado poder-se-á utilizar um fragmento do músculo das patas
posteriores do animal sacrificado na preparação anterior.
1.
cortar um pedacinho de músculo de uma pata posterior da rã. Dissociar
rapidamente com auxílio de duas agulhas numa gota de NaCl (0,15 M). Cobrir com
uma lamela e observar.
2.
Os núcleos podem ser tornados mais evidentes removendo a solução de NaCl e
adicionando agora uma gota de ácido acético a 1%.
Tecido nervoso
O
estudo do tecido nervoso pode ser acompanhado da execução de duas preparações
muito simples: dissociação de células da medula de boi (ilustração de tipos de
células de tecido nervoso); dissociação do nervo ciático da rã (ilustração da
estrutura de um nervo).
Para
a dissociação das células da medula de boi proceder assim:
1.
Obter uma secção de medula de boi e cortá-la transversalmente de modo a
conseguir alguns fragmentos com 2-3 mm de espessura. Colocar os fragmentos em
álcool a 30% durante 24 h.
2.
Com auxílio de uma agulha retirar pedacinhos de substância cinzenta da
"zona dos corpos anteriores" de um dos fragmentos. Introduzir o
material retirado num tubo de ensaio contendo água até 1/4 da sua altura.
3.
Tapar o tubo e agitá-lo fortemente. Juntar em seguida umas gotas de
picro-carmim.
4.
Uma hora depois adicionar algumas gotas de ácido ósmico a 1%.
5.
Decorridas algumas horas decantar o sobrenadante e lavar o sedimento várias
vezes com água destilada.
6.
Após a última lavagem deixar o material sedimentar novamente. Com auxílio de
uma pipeta retirar uma gota do fundo e colocá-la numa lâmina, cobrir com uma
lamela e observar.
Para estudar a estrutura do nervo ciático
da rã proceder como se indica a seguir:
1.
Sacrificar uma rã, tirar a pele dos membros posteriores e dissecar os músculos
com auxílio de 2 agulhas. Ver-se-á aparecer um "cordão" branco-amarelado
que é o nervo ciático.
2.
Seccionar o nervo na parte superior e inferior e com o auxílio de um palito
colocá-lo num frasco contendo ácido ósmico a 1% (evitar aqui o contacto com
objectos metálicos com o ácido ósmico).
3.
No dia seguinte retirar o nervo e lavá-lo com água numa tina pequena. Cortá-lo
em 3 ou 4 fragmentos e colocar um deles numa lâmina contendo uma gota de água.
4.
Prender uma das pontas do fragmento com uma agulha e dissociar
longitudinalmente com outra.
5.
Retirar o excesso de água e observar.
PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES E CORANTES
Solução de Ringer
Podem-se
preparar várias soluções de Ringer de acordo com o material em que vão ser
usadas. Todas elas são soluções isotónicas tamponadas, isto é, amortecedoras
das variações de pH.
Para
preparar 1 litro de solução de Ringer para tecidos de rã:
1.
Pesar: 0,42 g de cloreto de potássio
0, 24 g de cloreto de cálcio
0, 20 g de bicarbonato de sódio
7,50 g de cloreto de sódio
2.
Dissolver em água;
3.
Acertar o volume com água até 1 litro.
Hemalumen de Mayer
hematoxilina
cristalizada .............................. 1 g
iodato
de sódio ou de potássio ..................0,2 g
alúmen
de potássio ....................................50 g
água destilada
........................................1000 g
AQUISIÇÃO DE REAGENTES
Os
reagentes químicos podem ser adquiridos através de firmas tais como Merck,
Sigma e Difco.
Ao
longo do país existem diversos representantes destas firmas. O representante
mais próximo poderá ser facilmente indicado em qualquer farmácia.
BIBLIOGRAFIA
Bailey,
F. R., Copenhaver, Bunge. 1973. Histologia, Editora Edgard Blucher Lda., São
Paulo. Brasil.
Bloom,
W., Fawcett. 1970. A Text Book of Histology, W.B. Saunders Company,
London. U.K.
Costa,
A.C., Chaves. 1943. Manual de Técnica Histológica, Livraria Portugália, Lisboa.
Portugal.
Junqueira,
L.C, Carneiro. 1971. Histologia Básica, Editora Guanabara Koogan SA, Rio de
Janeiro. Brasil
Poirier,
J., Dumas. 1977. Review of Medical Histology, W.B. Saunders
Company, London. U.K.
Texto
baseado no Conjunto Didáctico Tecidos
e Estruturas Animais
Uma
Edição da
