Construcción de ACV sintetasa recombinantes funcionales con diferentes actividades catalíticas
Lamas-Maceiras, M.; Naranjo, L., Casqueiro, J. y Martín, J.F.
Área
de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de León,
24071 León,
Instituto de biotecnología (INBIOTEC), Avda. del Real Nº1,
24006 León.
La
ACV sintetasa de Penicillium chrysogenum es una proteína modular,
codificada por el gen pcbAB, que interviene en el primer paso de la
ruta de biosíntesis de la penicilina catalizando la formación
no ribosomal del tripéptido a-(L-d-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina
(ACV) (Martín, 2000).
Con el fin de definir las regiones conectoras (linkers) entre módulos
para la obtención de ACV sintetasas híbridas se han construido
los plásmidos pACV-A y pACV-CV que contienen respectivamente el módulo
A y los módulos C y V.
Se co-transformó la cepa T-33 de P. chrysogenum (cepa en la que el gen pcbAB endógeno ha sido deleccionado) con estos dos plásmidos. Se seleccionaron 125 transformantes al azar, de los cuales, 24 mostraron producción de penicilina en medio líquido, lo que indicaba que se había reconstituido una ACV sintetasa funcional. De los transformantes productores se obtuvo el DNA genómico con el que se transformó E. coli DH10B. Se aislaron varios plásmidos distintos, entre ellos el pACV-A y 4 tipos de plásmidos recombinantes, denominados I, II, III y IV, en base al patrón de restricción con la enzima de restricción PstI.
Al
re-transformar la cepa T-33 ( no productora de penicilina) con el plásmido
I, el II o el III se recuperó la producción de penicilina mientras
que con el plásmido IV el resultado fue negativo. Sólo cuando
cepa T-33 de P. chrysogenum fue co-transformada con los plásmidos
IV y pACV-A se obtuvo producción de penicilina. La secuenciación
de la región común de 2,2 kb de varios plásmidos de los
tipos I, II, y III reveló la estructura de las proteínas recombinantes.
