Caracterización de la respuesta inmune hacia paramiosina en la cisticercosis humana y murina.

José Vázquez Talavera y Juan Pedro Laclette

 

I. RESUMEN

 

La paramiosina de la Taenia solium (TPmy) es un antígeno inmunodominante en la cisticercosis humana y porcina; además, las paramiosinas son candidatos a vacuna en contra de la esquistosomosis y la filariasis. Hay pocos estudios para identificar las regiones de importancia inmunológica de la paramiosina. En este estudio se encontraron diferencias en el reconocimiento de tres regiones de la molécula, a pesar de que la TPmy es una molécula fibrosa particularmente homogénea. Las células mononucleares de sangre periférica de individuos sanos de un área endémica para cisticercosis proliferaron con mayor proporción al ser estimuladas con el extremo amino y la porción central de la TPmy. En contraste, las células de individuos con neurocisticercosis proliferaron con la misma proporción contra cualquier región. En otros experimentos se empleó a la TPmy para inducir protección en el modelo murino. Los resultados indican que el extremo amino-terminal induce alrededor del 60% de protección contra la infección por el cisticerco de Taenia crassiceps. Esta protección se puede relacionar con una respuesta inmune tipo Th1 y la proliferación de linfocitos T. Finalmente, al localizar los epitopos de los linfocitos B los resultados mostraron que los anticuerpos de humanos infectados naturalmente y los de ratones inmunizados con la TPmy reconocieron, principalmente, el extremo carboxilo-terminal.

 

II. ABSTRACT

 

Taenia solium paramyosin (TPmy) is an immunodominant antigen in human and porcine cysticercosis, paramyosins shown promise as a vaccine candidate against schistosemiosis and some filariasis. There are few studies directed to identify the immunologically relevant regions of paramyosin. In this work, remarkable differences in the recognition of distinct regions of the molecule were found, in spite of that TPmy is a particularly homogenous fibrous molecule. Mononuclear cells of healthy individuals from an endemic area for cysticercosis were more responsive towards the amino terminal end and the central region of TPmy. In contrast, the responsiveness of cells from neurocysticercotic patients showed no preference to any region of TPmy. A second line of experiments involved protection studies using TPmy as vaccine in the murine model. Results showed that the amino end induced about 60% protection against a challenge with Taenia crassiceps cisticerci. Protection seems to be related to a Th1-like immune response and to specific T cell proliferation. Finally, characterization studies of B cell epitopes indicated that antibodies in the sera of patients and TPmy-immunized mice recognize predominantly epitopes located in the carboxyl-terminal fragment.

 

 

III. PRÓLOGO

 

         La cisticercosis es un problema de salud pública que afecta la economía en algunos países de Latinoamérica, Asia y África. Esta enfermedad es causada por el establecimiento del cisticerco de Taenia solium en los tejidos del hombre y del cerdo. Actualmente, no se cuenta con alguna vacuna establecida que prevenga la enfermedad en humanos o cerdos. Se ha propuesto a las paramiosinas (proteínas del músculo de invertebrados) como antígenos candidatos para el desarrollo de una vacuna en contra de la esquistosomosis y la filariasis, que son también parasitosis provocadas por helmintos. En nuestro laboratorio se ha clonado y expresado el gen de la paramiosina de la T. solium (TPmy), así como de diferentes fragmentos de éste. En el modelo murino de cisticercosis hemos demostrado que la vacunación con fragmentos de la TPmy puede inducir niveles de protección que alcanzan un 70%, en promedio. En el presente proyecto, pretendemos comprender cuál es el tipo de respuesta inmune generada contra la TPmy, para establecer estrategias en un eventual empleo de la TPmy contra la cisticercosis porcina.

En la primera publicación (Apéndice 1) que incluye la presente tesis “Human T- and B-cell epitope mapping of Taenia solium Paramyosin” por los autores José Vázquez-Talavera, Carlos F. Solís, Edith Medina-Escutia, Zoila Morales-López, Jefferson Proaño, Dolores Correa, and Juan P. Laclette, se describe que los anticuerpos de los pacientes con neurocisticercosis reaccionan principalmente con la región carboxilo-terminal y reaccionan escasamente con la región amino-terminal. En contraste, la respuesta inmune celular no mostró preferencia por alguna región de la TPmy, si bien los individuos sanos respondedores lo hicieron preferentemente contra la región amino-terminal.

En la segunda publicación (Apéndice 2) “Characterization and Protective Potential of the Immune Response to Taenia solium Paramyosin in a Murine Model of Cysticercosis.” Por los autores José Vázquez-Talavera, Carlos F. Solís, Luis I. Terrazas, and Juan P. Laclette, se concluye que la inmunización con TPmy recombinante induce protección parcial contra un reto subsecuente con el cisticerco de T. crassiceps y que esta capacidad protectora reside básicamente en el tercio amino-terminal. Además, que la respuesta inmune contra este tercio tiene un fenotipo Th1.

Y en la tercera publicación (Apéndice 3) “Cellular immune response and Th1/Th2 cytokines in human neurocysticercosis: lack of immune supresión” por los autores Edith Medina-Escutia, Zoila Morales-López, Jefferson V. Proaño, José Vázquez, Victor Bermúdez, Vianney Ortiz-Navarrete, Vicente Madrid-Marina, Juan P. Laclette and Dolores Correa. Se describe que los pacientes con neurocisticercosis no muestran las evidencias de inmunosupresión que se observan en los modelos animales.

IV. INTRODUCCIÓN

1. Ciclo de vida

 

         El ciclo de vida de T. solium se puede dividir en dos etapas; la primera ocurre en el hospedero intermediario y la segunda en el definitivo (Figura 1). El ser humano es el único hospedero definitivo del gusano adulto y es el responsable de la infección de los hospederos intermediarios humano y porcino.

 

 

Figura 1. Ciclo de vida de la Taenia solium. (Tomado con modificaciones de: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Taeniasis.htm).

 

 

Desarrollo en el hospedero intermediario. La primera etapa se inicia con la ingestión de los huevos de T. solium (Figura 2) por el hospedero intermediario. Las enzimas proteolíticas del estómago e intestino destruyen al embrióforo (una de las envolturas protectoras que protegen al embrión para sobrevivir en el medio ambiente) liberando al embrión (44[L1] , 102[L2] ). Se cree que el embrión hexacanto activado (también conocido como oncosfera) atraviesa la mucosa intestinal por la acción combinada de sus ganchos (31[L3] ) que desgarran el tejido y de secreciones líticas que digieren la mucosa. Posteriormente, el embrión alcanza los capilares sanguíneos y linfáticos que lo llevan a diferentes órganos, en donde se desarrolla hasta convertirse en un cisticerco.

 

 

 

Figura 2. Micrografía electrónica de barrido de un huevo de Taenia solium. E: embrioforo, G: ganchos oncosferales, O: oncosfera (Tomada de 44[L4] ).

 

El cisticerco (Figura 3) es una vesícula translúcida, ovoide o circular de 5 a 10 mm de diámetro con un pequeño gusano o escólex metido hacia dentro (invaginado), que puede permanecer en los tejidos del hospedero intermediario durante varios años (19[L5] , 20[L6] ), rodeado por una cápsula de tejido conectivo. La vesícula está llena de un fluido  transparente que contiene proteínas del parásito y del huésped (6[L7] ). Cabe hacer notar que el tegumento y la pared vesicular (Figura 4) son el sitio de contacto del parásito con el hospedero y desempeña un papel central en el mantenimiento de la relación hospedero-parásito.

 

 

Figura 3. Ilustración esquemática de la larva o cisticerco de Taenia solium. C: canal espiral, Ex: escólex, P: pared vestibular, Pv: pared vesicular y V: espacio vestibular.

 

Figura 4.  Superficie externa de la pared vesicular de un cisticerco de Taenia solium en la cual se pueden distinguir las microtricas (Tomada de 82[L8] ).

 

Desarrollo del cisticerco en el hospedero definitivo: El ciclo de vida continúa cuando el ser humano consume carne de cerdo infectada e ingiere uno o varios cisticercos viables. La masticación, las sales biliares y las proteasas digestivas  destruyen la pared vesicular e inducen la salida o evaginación del escólex (9[L9] ). Una vez evaginado, el escólex (Figura 5) se fija en la pared del yeyuno por medio de sus ventosas y ganchos rostelares (9[L10] ). A partir de entonces el escólex comienza a  crecer y diferenciarse hasta convertirse en gusano adulto.

 

 

Figura 5. Micrografía electrónica de barrido del escólex de un cisticerco evaginado de Taenia solium (cortesía del Dr. Juan Pedro Laclette).

 

         La tenia adulta mide entre 1.5 m y 5 m de longitud y su cuerpo esta formado por el escólex, el cuello y el estróbilo. El estróbilo es una cadena de segmentos o proglótidos que se desarrollan a partir del cuello. Los proglótidos poseen cientos de testículos y un ovario trilobulado (Figura 6), por lo que se piensa que se autofecunda para producir hasta 50,000 huevos infectantes (4[L11] ). La contaminación de aguas y alimentos con los huevos es favorecida por el fecalismo al aire libre, el hacinamiento y la falta de higiene personal. Se  ha demostrado que el principal factor de riesgo es la presencia de un portador de tenia en el ambiente cercano (18[L12] , 89[L13] , 90[L14] , 91[L15] , 92[L16] , 93[L17] ). El ciclo de vida se cierra cuando el hospedero intermediario ingiere los huevos que contaminan alimentos y agua.

 

 

Figura 6. Representación esquemática de un proglótido de Taenia solium, enfatizando al aparato reproductor. A: atrio genital, D: ducto genital, O: ovario trilobulado, T: testículos, U: útero y Va: vagina.

 

 

2. Importancia de la cisticercosis

 

         La cisticercosis humana es un problema de salud pública en México y otros países (24[L18] , 26[L19] ). En un estudio realizado en 1982, se calculan pérdidas económicas anuales equivalentes a 350 millones de dólares americanos, debidas a la incapacidad laboral de individuos con cisticercosis (115[L20] ). La curación de enfermos con neurocisticercosis tiene un costo de 21 mil millones de pesos al año (88[L21] ). También, se ha calculado que, durante 1986, el costo del cuidado médico de 2,700 nuevos casos de neurocisticercosis ascendió a 14.5 millones de dólares americanos; además, el 75% de los individuos adquieren la cisticercosis en edad productiva (24[L22] ). En 1984, el gobierno de México estableció como prioritario un programa de salud para el control y la eradicación epidemiológicos (24[L23] ).

En cuanto a la cisticercosis porcina, existen diversos estudios que han tratado de estimar la prevalencia de ésta, en diferentes regiones del país. El estudio más completo es el realizado con los registros de 75 rastros en 22 estados de la República, el cuál se puede ver en la tabla I (3[L24] ).

 

 Tabla I. Prevalencia de la cisticercosis en diferentes regiones de país (Tomada de 3[L25] ).

 

La cisticercosis porcina causa considerables pérdidas económicas. En 1980 más de 43 millones de dólares se perdieron por decomisos de los rastros (2[L26] ). Cabe mencionar que la cisticercosis porcina es susceptible al tratamiento con drogas cestocidas (24[L27] ).

Se puede decir que la cisticercosis es un problema de salud pública que se mantiene por ignorancia, y falta de recursos (24[L28] ). La costumbre de dejar deambular a los cerdos (Figura 7) incrementa el riesgo de que adquieran la cisticercosis por ingerir  heces humanas contaminadas con huevos de T. solium. Los animales cisticercosos detectados en la inspección post-mortem deben ser decomisados y procesados adecuadamente para evitar destruir la carne. Cuando el animal infectado llega a un rastro, los animales cisticercosos son decomisados; sin embargo, en nuestro país, algunos animales infectados son distribuidos clandestinamente y no pasan la inspección veterinaria.

 

Figura 7.  El cerdo es el hospedero intermediario de Taenia solium.

 

4. Inmunología de la cisticercosis humana y porcina

 

         La presencia de los cisticercos en los tejidos de su hospedero humano o porcino induce la formación de una respuesta inmune. La respuesta inmune humoral del hospedero cisticercoso ha sido estudiada principalmente de una manera indirecta en trabajos relacionados con el inmunodiagnóstico. Se ha encontrado que la respuesta humoral no participa con la destrucción del metacéstodo. Los humanos con cisticercosis tienen anticuerpos contra el cisticerco y, a pesar de ello, el parásito sobrevive por periodos relativamente prolongados. Algunos estudios han mostrado que el tiempo promedio para la aparición de los síntomas después de la infección en los pacientes es de 7 años y puede llegar hasta los 20 años (20[L29] )

         La IgG es la inmunoglobulina predominante entre los anticuerpos anti-cisticerco, en humanos (14[L30] , 28[L31] ). Inicialmente se mostró que los sueros de pacientes reconocen por inmunoelectroforesis hasta 8 antígenos y por Western blot más de 20 (27[L32] ). En la cisticercosis humana los cisticercos presentan abundante IgG del hospedero asociada a la superficie, sin embargo, estas moléculas tampoco se relacionan con el daño en los cisticercos (14[L33] ). También, se ha informado que hay anticuerpos humanos contra el glicocálix, componentes del citoplasma de los citones tegumentales, antígenos del estroma y del sistema ductural, pero no se ha encontrado en contra del tegumento del canal espiral, ni del músculo de las ventosas del escólex (100[L34] ). En la cisticercosis porcina, la superficie del cisticerco, así como la cápsula inflamatoria formada por el hospedero, están cubiertas por inmunoglobulinas del cerdo (99[L35] ). También, se ha descrito una molécula de 55 kDa que se une a la región Fc de las inmunoglobulinas (57[L36] ).

         Además, el hospedero es capaz de producir un infiltrado inflamatorio, cuyo perfil molecular es complejo y puede eventualmente eliminar al parásito. Por ejemplo, en el humano, en la cisticercosis meníngea, una de las formas relativamente benignas de la enfermedad, la reacción inflamatoria, es en general, escasa y el infiltrado está compuesto por linfocitos, células plasmáticas y epitelioides, pocas veces células gigantes y rara vez se observan eosinófilos. En contraste, en el caso de la cisticercosis meníngea cisternal, una de las formas más graves, la reacción inflamatoria está constituida por numerosas células inflamatorias entre las que se identifican linfocitos, células plasmáticas, algunos cuerpos de Russell, células epitelioides, numerosas células gigantes, pocos son polimorfonucleares y eosinófilos (80[L37] ). El caso de la respuesta del cerdo es diferente. En la cisticercosis porcina en músculo esquelético, los eventos celulares durante la destrucción del parásito sugieren un proceso secuencial comenzado por los eosinófilos. Una vez iniciada la destrucción, se incrementan los macrófagos, células epitelioides, así como células gigantes que invaden la cavidad para fagocitar el exudado y los restos de la larva. Los linfocitos forman agregados similares a folículos, simultáneamente los eosinófilos parecen retirarse de la región más interna del proceso inflamatorio y se observan dispersos entre los demás elementos de la reacción granulomatosa (5[L38] ). Cabe señalar que un punto discordante radica en el tipo de infiltrado celular de la cisticercosis humana y de la porcina, ya que en el padecimiento humano casi no hay eosinófilos, lo cual ha sido explicado por el hecho de que la eosinofilia es un fenómeno temprano.

         Las personas infectadas pudieran tener mayor susceptibilidad a otras enfermedades, lo cuál puede sugerir cierta inmunodeficiencia (14[L39] ). Se ha descrito que la proliferación celular a mitógenos se encuentra disminuida en pacientes con cisticercosis (14[L40] ), pero la evidencia es contradictoria (99[L41] , Apéndice 3). La disminución de la proliferación celular también ha sido descrita en la cisticercosis porcina (34[L42] , 65[L43] , 68[L44] , 106[L45] ). Incluso se ha informado un factor de RNA que inhibe la activación de linfocitos por fitohemaglutinina (67[L46] ). Sin embargo, se ha encontrado que los extractos del metacéstodo de la T. solium pueden ser mitogénicos para linfocitos de ratón (99[L47] ).

Es consistente el hecho de que la disminución de la proliferación celular ha sido descrita en la cisticercosis murina por T. crassiceps (96[L48] , 116[L49] ) y por T. taeniaeformis (50[L50] ). Respecto a esto se ha reportado que antígenos de excreción/ secreción del cisticerco de T. crassiceps pueden inhibir la proliferación de linfocitos T (103[L51] ).

         Se ha propuesto que el cisticerco emplea varios mecanismos para evadir la respuesta inmune del hospedero y sobrevivir por largos periodos (14[L52] ). Entre los mecanismos propuestos se pueden mencionar: 1) secreción de antígenos inmunodominantes para desviar a los anticuerpos lejos de la superficie ("cortina de humo"), 2) enmascaramiento de la superficie con moléculas del hospedero, 3) modulación o supresión de la respuesta inmune del hospedero, 4) establecimiento del parásito en hospederos inmunosuprimidos y 5) alojamiento en lugares inmunológicamente privilegiados, como el sistema nervioso (14[L53] ).

Se ha desarrollado un modelo de cisticercosis intraocular en conejos, la evidencia obtenida en este modelo indica que el cisticerco se puede establecer en sitios inmunológicamente privilegiados, pero que una vez que el hospedero se ha presensibilizado, los parásitos no se desarrollan (10[L54] ).

 

5. Vacunación contra la cisticercosis

 

Se puede inducir inmunidad en cerdos con antígenos de excreción/ secreción obtenidos en cultivos de oncosferas (75[L55] ), con extractos antigénicos del cisticerco de T. solium (65[L56] , 73[L57] ) o de T. crassiceps (58[L58] , 95[L59] ). También se puede proteger ratones de la infección por T. solium y T. saginata con antígenos oncosferales de estos parásitos (66[L60] ). En el caso de la T. ovis y de la T. taeniaeformis, se ha demostrado una alta protección utilizando proteínas oncosferales de excreción/ secreción o sus formas recombinantes (38[L61] , 39[L62] ). Las formas recombinantes empleadas en el caso de T. ovis, también, inducen una elevada protección en la cisticercosis porcina (78[L63] ). También se han detectado antígenos totales de T. crassiceps que pueden correlacionarse con la respuesta inmune protectora. (95[L64] ). Recientemente, se han publicado revisiones sobre la vacunación contra la cistcercosis (25[L65] , 55[L66] ).

En el desarrollo de vacunas contra los céstodos ténidos se han empleado oncosferas vivas con resultados muy positivos; se ha logrado inducir protección homóloga contra T. ovis, T.hydatigena y E. granulosus en borrego y T. pisiformis en conejos; la protección es más efectiva si el embrión eclosiona; además, se puede inducir inmunidad con oncosferas irradiadas para limitar la migración o colonización a otros tejidos (83[L67] ). También, se ha logrado inducir protección con extractos completos de oncosferas contra T. saginata, T. hydatigena, T. ovis y T. taeniaeformis (83[L68] ). Se ha demostrado que se puede inducir protección contra H. nana y se puede lograr protección contra el establecimiento/ supervivencia/ fecundidad de gusanos de E. granulosos en perros. Se ha sugerido que la infección previa de perros con gusanos de E. granulosus puede inducir protección, así como la inmunización oral con protoescólices irradiados, antígenos obtenidos de protoescolices o membranas de cisticercos. También, se puede inducir cierta protección contra E. granulosus con la inmunización parenteral de oncosferas activadas de E. granulosus, T. hydatigena, T. ovis, T. multiceps, T. pisiformis y T. serialis (54[L69] ).

Por otro lado, se ha demostrado que los antígenos liberados por oncosferas vivas son capaces de proteger contra T. ovis, T. taeniaeformis, T. hydatigena, T. pisiformis y T. saginata (83[L70] ). Una sola inmunización con antígenos del cultivo de oncosfera de T. ovis emulsificados en adyuvante incompleto de Freund inducen inmunidad protectora que dura 12 meses en ovejas. Sin embargo, lo mismo no se ha logrado con ganado y se piensa que la permanencia del antígeno tiene un papel determinante; incluso, se ha publicado que en corderos existen niveles elevados de anticuerpos protectores con una vida media corta contra T. ovis y T. hydatigena y, aparentemente, ocurre algo similar en la infección del conejo con T. pisiformis. Esto sugiere que en ausencia del antígeno, el anticuerpo protector tiende a desaparecer (83[L71] ).

         El desarrollo de una vacuna útil para el control de la taeniasis/ cisticercosis no es simple. Al respecto, se ha informado que la vacunación con altas dosis de antígeno de T. crassiceps en cerdos (95[L72] ) y en ratón (98[L73] ) parecen no ser protectoras o incluso podrían facilitar la infección, mientras que bajas dosis inducen la reducción de la carga parasitaria; también, se ha sugerido que el adyuvante empleado podría alterar la eficiencia de la protección en cerdos (95[L74] ). Asimismo, se ha propuesto que algunos anticuerpos podrían facilitar la infección de T. solium en cerdos (95[L75] ) y de T. crassiceps en ratón (94[L76] ) y se ha encontrado que el genotipo puede influenciar la respuesta inmune a la infección por T. crassiceps en ratón  (97[L77] ) y lo mismo se ha sugerido en la cisticercosis porcina (95[L78] ).

 

6. Mecanismo inmunológico humoral de protección

 

         Los estudios sobre el mecanismo inmune de protección se han realizado principalmente en modelos experimentales de rata y ratón. En estos modelos se ha encontrado que el mecanismo de protección dependerá de la etapa de desarrollo del parásito. En rata y ratón se ha visto que la resistencia natural a la infección por oncosferas de T. taeniaeformis tiene componentes humorales. Esta resistencia se detecta en suero a partir de la segunda semana de infección. Existe evidencia que el mecanismo de resistencia depende del complemento. Sin embargo, después de la primera semana se pierde parte de la susceptibilidad del parásito a este mecanismo humoral de ataque. No obstante, después de esta etapa es posible inducir resistencia con extractos de cisticercos; la resistencia, si bien es humoral, depende de un perfil de isotipos diferente al producido después de la infección oral. Por otra parte, la IgA se ha involucrado en la resistencia natural pasiva transferida de ratas madres a sus crías durante la lactancia (117[L79] ).

En ovejas se ha encontrado que la inmunidad inducida con antígenos liberados por cisticercos en cultivo se puede transferir de la madre a las crías por el calostro (83[L80] ). En la hidatidosis ovina, la inmunidad no se transfiere pasivamente de madre a hijo (54[L81] ).

La vacunación con antígenos de oncosferas de T. taeniaeformis ocasionan que muy pocas o ningún metacéstodo se establezcan, sin embargo las que llegan a establecerse permanecen viables y se desarrollan normalmente. La vacunación con antígenos de metacéstodos permite la detección de muchos parásitos después de las primeras semanas del reto; sin embargo, 5 semanas después son eliminados todos los parásitos; 60 días después se evidencia que las lesiones remanentes de los parásitos eliminados desaparecen gradualmente y muy pocas pueden detectarse macroscópicamente (53[L82] ).

Estudios morfológicos en oncosferas de H. nana que han penetrado el epitelio intestinal de ratones inmunes sugieren que el daño de los anticuerpos se localiza en la membrana externa del parásito. Además se ha demostrado que los anticuerpos y el complemento son los principales mecanismos que eliminan a las oncosferas. Sin embargo, la sensibilidad a este mecanismo se pierde en cuanto las oncosferas comienzan con el desarrollo de microvellosidades (83[L83] )

También, ratones con infección intraperitoneal primaria y ratones que no fueron protegidos por la infección subcutánea de T. crassiceps tuvieron niveles elevados de IgM, IgG1 y IgG3 séricos respecto a ratones controles y los ratones protegidos. Se ha demostrado IgG2b e IgG3 en la superficie de larvas viables de T. crassiceps (32[L84] ).

 

7. Mecanismo inmunológico celular de protección

 

         Los eosinófilos han sido frecuentemente relacionados con la destrucción del parásito. Este es el caso de la cisticercosis porcina. En la infección natural del cerdo por el cisticerco de T. solium, los eventos celulares durante la destrucción del parásito sugieren un proceso secuencial iniciado por los eosinófilos (5[L85] ). Similarmente, en cerdos inmunizados con extractos de cisticerco de T. solium se han descrito varios tipos celulares en el proceso inflamatorio que destruye al parásito, tales como: eosinófilos, monocitos, linfocitos, macrófagos y células epitelioides. Sin embargo, los eosinófilos son los que participan en la destrucción del cisticerco, pues se ha encontrado que la inmunización induce eosinofilia. Estas células forman la capa más interna de la reacción granulomatosa que rodea al cisticerco, degranulan en las cercanías del parásito, se infiltran en el tegumento y rodean a los restos del parásito destruido (63[L86] , 64[L87] , 65[L88] , 73[L89] ). En el modelo murino de cisticercosis por T. taeniaeformis se ha encontrado que después de que las oncosferas llegan al hígado, aparentemente, los eosinófilos se convierten en elementos prominentes de la respuesta inflamatoria que rodea y elimina las oncosferas (117[L90] ). En infecciones intraperitoneales por T. crassiceps las células del hospedero tienden a acumularse alrededor del polo que gema antes de que se lleve a cabo la encapsulación del resto del cisticerco (32[L91] ).

Además, al inducir protección con antígenos homólogos de oncosfera, a la infección intravenosa de huevos de T. solium o T. saginatus, se observa que los ratones controles en los estudios histopatológicos muestran una reacción inflamatoria alrededor del metacéstodo y en ocasiones bastante intensa, en dónde se hallan macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Esta respuesta inflamatoria es diferente de la documentada en esquistosomosis o en cerdos infectados por T. solium, donde los eosinófilos se encuentran en contacto con la superficie del parásito. Esto puede sugerir que los eosinófilos no son atraídos hacia las etapas tempranas de los metacéstodos, sino más bien son reclutados en contra de etapas más tardías como en su hospedero natural (66[L92] ).

Finalmente, en la infección intraperitoneal de ratones con metacéstodos de T. crassiceps, la resistencia se ha relacionado más claramente con la inmunidad celular que con anticuerpos (8[L93] ).

 

8. Inmunología de la cisticercosis murina

 

El empleo del modelo murino ha permitido el conocimiento de puntos críticos de la inmunidad contra la cisticercosis, el modelo de cisticercosis murina por el cisticerco de T. crassiceps se discutirá más adelante. La penetración del epitelio intestinal y la diferenciación postoncosferal inmediata, son fenómenos muy importantes en términos de la infección y la respuesta al reto en animales inmunes; porque son en esos momentos cuando se inicia el contacto entre los determinantes antigénicos y el sistema inmune del hospedero. En la infección, el resultado es el desarrollo de una resistencia altamente específica y efectiva contra un reto; sin embargo, el metacéstodo logra establecerse e induce resistencia a infecciones similares posteriores. A partir de 3-4 días después de la infección se observa la infiltración de células fagocíticas atraídas probablemente por las células destruidas durante la penetración del parásito y la aparición de eosinófilos en las triadas portales (117[L94] ).

Diferentes modelos han proporcionado diferentes conclusiones. Por ejemplo, el mecanismo de protección contra T. taeniaeformis en ratones parece no depender de la participación de linfocitos T, ya que ratones atímicos desnudos pueden ser protegidos de la infección por el parásito tan sólo con suero inmune. Por otro lado, se ha publicado que poblaciones enriquecidas de linfocitos B y T pueden causar reducción significativa de la carga parasitaria, en menos tiempo del esperado para el mecanismo humoral (7[L95] , 117[L96] ). Además, se ha informado que los cisticercos de T. taeniaeformis pueden sobrevivir por periodos largos en la cavidad peritoneal de ratas tratadas con grandes dosis de suero inmune protector (117[L97] ).

 

8a. Inmunidad contra el cisticerco de Taenia crassiceps

 

En el modelo murino experimental de cisticercosis por el metacéstodo de T. crassiceps, el cisticerco se multiplica asexualmente por gemación en la cavidad peritoneal del ratón (29[L98] ). El metacéstodo se mantiene por medio de pases sucesivos de ratón en ratón de tal manera que en este modelo experimental el parasito no llega al estado adulto. Sin embargo, este modelo ha permitido sugerir candidatos a vacuna contra la cisticercosis porcina (36[L99] , 58[L100] , 95[L101] ).

Se puede inducir un nivel elevado de resistencia a la reinfección con T. crassiceps por la inoculación subcutánea de cisticercos vivos de T. crassiceps tres semanas antes del reto (32[L102] ). Incluso, se han identificado antígenos de cisticercos de T. crassiceps con la capacidad de inducir protección en cerdos (58[L103] ).

En la infección por T. crassiceps, se ha encontrado una relación entre eosinofilia y resistencia a la infección: la esinofilia fue más pronunciada cuando los cisticercos inyectados intraperitonealmente fueron destruidos o controlados por el hospedero; y mientras más rápido se desarrolla la eosinofilia, más eficiente es el control de los cisticercos (31[L104] ).

La inmunización subcutánea con productos secretados-excretados de cisticercos de T. crassiceps en cultivo, con adyuvante completo de Freund o alumbre, son tan efectivas para inducir protección como los metacéstodos contra los cisticercos de T. crassiceps (32[L105] ).

         Se ha encontrado similitud antigénica entre T. solium y T. crassiceps. Esta similitud se puede aprovechar para inducir protección heteróloga. El suero de cerdos protegidos se ha usado para identificar cuatro clonas de una biblioteca de cDNA de cisticercos de T. crassiceps con la capacidad de inducir protección (58[L106] ).

Recientemente, se ha sugerido que la respuesta Th1 ejerce control en la infección por el cisticerco de T. crassiceps (108[L107] , 116[L108] ). Se ha encontrado que la respuesta protectora inducida con la inmunización con DNA está mediada por linfocitos T productores de IL-2 e IFN-g (16[L109] ). Un péptido con capacidad de inducir protección, también puede inducir la producción de IFN-g (111[L110] ). De manera similar la administración in vivo de IFN-g o anti-IL-10 reduce la carga parasitaria (109). Se ha sugerido que la eliminación del parásito depende de una respuesta Th1 (IL-2 e IFN-g) (87[L111] ). En el laboratorio del Dr. Laclette hemos obtenido resultados similares a estos (Apéndice 2). Además se ha publicado que en esta infección se desarrolla una respuesta inmune mixta, es decir, Th1 y Th2 (103[L112] , 110[L113] ). Previamente, en esquistosomosis, se ha sugerido que la protección inducida por la paramiosina tiene un mecanismo tipo Th1 (ver adelante).

 

9. La paramiosina de la Taenia solium

 

         Uno de los antígenos mejor caracterizados del cisticerco de la T. solium es sin duda el antígeno B (AgB). Este antígeno fue caracterizado inicialmente como un arco de precipitación sin carga neta aparente, identificado por inmunoelectroforesis al confrontar un extracto de cisticercos contra sueros de pacientes con neurocisticercosis (Figura 8). En esta prueba, fue el antígeno reconocido con mayor frecuencia por anticuerpos en sueros de pacientes con neurocisticercosis, es decir, se trata de un antígeno inmunodominante (21[L114] , 119[L115] ).       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figura 8. Diagrama clásico de las 8 bandas de precipitación reconocidas por anticuerpos en sueros humanos, enfrentados contra un extracto de cisticercos de Taenia solium, mediante la técnica de inmunoelectrofofesis (Tomado de 26[L116] , 27[L117] ).

 

En 1982 se publicó el primer método de purificación del AgB. Este método era complejo y laborioso y permitía la purificación de pequeñas cantidades de proteína. El AgB purificado por el método original mostraba dos bandas de 85 y 95 kDa en electroforesis en gel de poliacrilamida (33[L118] ).

         Accidentalmente se encontró que el AgB se une a la colágena (79[L119] ), lo que dio la pauta para desarrollar un procedimiento de purificación por afinidad (Figura 9). El uso de este nuevo método de purificación permitió mostrar que el péptido de 85 kDa era en realidad un producto proteolítico de 95 kDa (41[L120] ).

 

 

Figura 9. Purificación del AgB de Taenia solium a partir de un extracto crudo de cisticercos por afinidad a colágena. A: Gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie de: 1) extracto crudo de cisticercos, 2) extracto crudo de cisticercos después de incubación con colágena polimérica. Fracciones unidas a la colágena cuando el extracto crudo se incubó en ausencia (3) o en presencia (4) de inhibidores de proteinasa. B: Inmuelectroforesis de la fracción A3 (carriles 1 y 2) y A4 (carriles 3 y 4) incubadas con IgG de conejo anti-AgB (tiras 1 y 3) y con suero normal de conejo (tiras 2 y 4) (Tomado de 45[L121] ).

 

         La localización de AgB en el cisticerco ha sido llevada a cabo por métodos de inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa indirecta, así como por métodos de yodación radioactiva de la superficie (43[L122] ). El antígeno se encontró ampliamente distribuido en el tejido del cisticerco, con una fluorescencia más intensa en los citones tegumentales (43[L123] , 45[L124] ) (Figura 10). Dado que estas células participan activamente en la producción de proteínas y glicoproteínas que se envían al citoplasma distal (56[L125] , 112[L126] ), se propuso que el AgB podría ser sintetizado en los citones tegumentales y enviado al tegumento para su liberación hacia los tejidos del hospedero (43[L127] ). Los resultados de experimentos con inmunoperoxidasa indirecta y yodinación radioactiva de superficie, indicaron que el AgB no era una proteína de superficie por lo que se propuso que se trataba de un producto de excreción-secreción del parásito (43[L128] , 45[L129] ). Además, se puede colectar AgB en el sobrenadante de cultivo in vitro de cisticercos (45[L130] ) y se le puede detectar en el líquido cefaloraquídeo de pacientes con neurocisticercosis (14[L131] ). Cabe señalar que recientemente se ha detallado la localización del AgB en el tegumento de helmintos (47[L132] ).

 

Figura 10. Inmunofluorescencia indirecta de cortes del tegumento (A y C) y el escólex (B y D) del cisticerco de  Taenia solium incubado con un suero anti-AgB (A y B) o suero de conejo normal (C y D). Cómo segundo anticuerpo se usó un suero de chivo a-conejo acoplado a isotiocianato de fluoresceína. C.C., corpúsculos calcáreos; S.C., canal espiral; T.C., citones tegumentales; T, tegumento. Barra=80 mm (A y C), 90 mm (B y D) (Tomado de 43[L133] ).

 

         La posibilidad de que se trate de un producto de excreción-secreción concordaba con su inmunodominancia y se correlacionaba bien con la producción intensa de anticuerpos en las células plasmáticas que rodean al cisticerco en el músculo de cerdo (17[L134] ). Sin embargo no concuerda con el infiltrado inflamatorio débil en el granuloma que rodea al cisticerco en el músculo esquelético del cerdo (5[L135] ).

         La relación entre el AgB y la reacción inflamatoria surgió a partir de su propiedad de unión a colágena. Esto llevó ha cuestionar qué otras moléculas con estructura colagénica podrían unirse al AgB. Entre las proteínas con estructura colagénica cuya función se relaciona al sistema inmune, se encuentra el C1q. Esta proteína es un subcomponente del C1, el primer componente de la cascada del complemento.

Ensayos iniciales mostraron que una preincubación de suero humano con AgB purificado, disminuye los niveles de complemento funcional en el suero (45[L136] ). La inhibición del C1, posiblemente debida a la unión del AgB con el C1q (Figura 11) (46[L137] ).

 

 

 

 

Figura 11. Inhibición de la actividad del complemento por la paramiosina. Diferentes cantidades de paramiosina se incubaron a 37°C por 30 min con C1 aislado. La actividad residual de C1 se evaluó con un ensayo hemolítico (Tomado de 46[L138] ).

 

Una secuencia parcial del AgB mostró homología con la secuencia también parcial de la paramiosina del Schistosoma mansoni (42[L139] ). A partir de este hallazgo fue posible obtener clonas de cDNA que contienen la secuencia codificadora completa del AgB de T. solium, tal como se muestra en la figura 12 (49[L140] ). La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia nucleotídica codifica para una proteína de 863 residuos de aminoácidos con un peso molecular de 98,000. El análisis de la secuencia de aminoácidos mostró un 72% de similitud con la parmiosina de S. mansoni y alrededor de un 30% de homología con paramiosinas de nemátodos como Caenorhabditis elegans y Dirophilaria immitis o de artrópodos como Drosophyla melanogaster (49[L141] ). También, se demostró identidad inmunológica de la proteína recombinante, expresada en Escherichia coli, con el AgB (49[L142] ), además de identidad inmunológica entre  paramiosina de S. mansoni  y el antígeno B. Estos resultados demuestran que el AgB es la paramiosina de la T. solium (TPmy), por lo que a partir de aquí se utilizará exclusivamente el término de paramiosina. Las paramiosinas son proteínas del músculo de invertebrados (12[L143] , 43[L144] , 47[L145] ). La paramiosina es una proteína filamentosa con estructura de un a-hélice superenrollada que forma homodímeros paralelos (12[L146] ).

                                                   

              TPmyX1

             1 ATGTCTGAATCACACGTCAAAATTTCTCGTACCATCATACGCGGGACTTCCCCAAGTACTGTTCGACTTGAGAGTCGCGTACGAGAACTGGAGGACCTGC

                M  S  E  S  H  V  K  I  S  R  T  I  I  R  G  T  S  P  S  T  V  R  L  E  S  R  V  R  E  L  E  D  L     33

 

           101 TCGATCTTGAGCGAGATGCTCGCGTCCGGGCTGAACGCAATGCCAACGAGATGAGCATTCAGCTGGACACCATGGCTGAACGTCTTGACGAATTGAGTGG

               L  D  L  E  R  D  A  R  V  R  A  E  R  N  A  N  E  M  S  I  Q  L  D  T  M  A  E  R  L  D  E  L  S  G  67

 

           201 TACTTCCTCTCAGACTCACGATGCTATTCGCCGTAAGGATATGGAGATCTCGAAGCTGCGCAAGGATCTGGAAAATGCCAACGCTGCTTTCGAAACTGCC

                 T  S  S  Q  T  H  D  A  I  R  R  K  D  M  E  I  S  K  L  R  K  D  L  E  N  A  N  A  A  F  E  T  A  100

 

           301 GAGGCCACTCTGCGCCGCAAACACAACACCATGATCTCCGAGATCTCCAGCGAGGTTGAGAATTTGCAGAAGCAGAAGGGCAGGGCAGAGAAGGACAAGA

                E  A  T  L  R  R  K  H  N  T  M  I  S  E  I  S  S  E  V  E  N  L  Q  K  Q  K  G  R  A  E  K  D  K   133

 

           401 GCCAGCTCATGCTTGAAATCGATAACGTTCTTGGTCAACTTGATGGCGCTTTAAAGGCCAAGGCCTCAGCGGAGAGCAAACTGGAGGGCTTGGACAGCCA

               S  Q  L  M  L  E  I  D  N  V  L  G  Q  L  D  G  A  L  K  A  K  A  S  A  E  S  K  L  E  G  L  D  S  Q 167

 

           501 GCTGACGCGCTTGAAGGCGCTGACCGACGATCTTCAACGCCAAATGGCCGACGCTAACTCTGCCAAGTCGCGTTTGGCCGCAGAGAACTTCGAATTGGTT

                 L  T  R  L  K  A  L  T  D  D  L  Q  R  Q  M  A  D  A  N  S  A  K  S  R  L  A  A  E  N  F  E  L  V  200

 

           601 CGCGTAAATCAGGAGTATGAAGCACAAGTCGTCACCTTCTCTAAGACAAAGGCCGCTCTTGAAAGCCAGCTGGATGACCTTAAACGGGCCATGGATGAAG

                R  V  N  Q  E  Y  E  A  Q  V  V  T  F  S  K  T  K  A  A  L  E  S  Q  L  D  D  L  K  R  A  M  D  E   233

                                                                                                          TPmyX6

           701 ATGCACGCAATCGCCTAAGCCTTCAAACACAGTTGTCGAGTCTGCAAATGGACTACGACAACCTGCAAGCACGTTACGAGGAGGAAGCCGAGGCAGCCGG

               D  A  R  N  R  L  S  L  Q  T  Q  L  S  S  L  Q  M  D  Y  D  N  L  Q  A  R  Y  E  E  E  A  E  A  A  G 267

                       TPmyX4

           801 AAATCTGCGCAACCAAGTTGCCAAATTCAACGCCGATATGGCTGCCCTCAAGACCCGTCTTGAGAGAGAACTTATGGCCAAGACTGAAGAGTTTGAAGAA

                 N  L  R  N  Q  V  A  K  F  N  A  D  M  A  A  L  K  T  R  L  E  R  E  L  M  A  K  T  E  E  F  E  E  300

 

           901 CTCAAACGCAAGCTGACTGTTCGCATTACCGAGTTGGAGGATATGGCTGAACATGAGCGCACTCGTGCCAACAACCTGGAGAAGACCAAAGTTAAGCTGA

                L  K  R  K  L  T  V  R  I  T  E  L  E  D  M  A  E  H  E  R  T  R  A  N  N  L  E  K  T  K  V  K  L   333

 

          1001 CTCTTGAGATCAAGGATCTACAGGCTGAGAACGAGGCGTTGGCAGCAGAGAATGGAGAGTTAACGCATCGGGCGAACGAGGCAGAGAATCTTGCCAATGA

               T  L  E  I  K  D  L  Q  A  E  N  E  A  L  A  A  E  N  G  E  L  T  H  R  A  N  E  A  E  N  L  A  N  E 367

 

          1101 GCTGCAGCGTCGAATAGACGAGATGACAGTGGAAATCAACACCCTCAACTCGGCCAACAGCGCTCTAGAGGCGGACAACATGCGCCTCAAGGGGCAGGTC

                 L  Q  R  R  I  D  E  M  T  V  E  I  N  T  L  N  S  A  N  S  A  L  E  A  D  N  M  R  L  K  G  Q  V  400

 

          1201 GGTGACCTCACCGACCGCATCGCCAATCTCGACCGCGAAAACCGCCAACTTGGCGATCAACTGAAGGAGACGAAATCAGCCCTGCGTGATGCGAATCGTC

                G  D  L  T  D  R  I  A  N  L  D  R  E  N  R  Q  L  G  D  Q  L  K  E  T  K  S  A  L  R  D  A  N  R   433

 

          1301 GACTGACCGATTTGGAGGCCCTGCGCAGTCAGTTGGAGGCAGAGCGTGACAACCTCGCCTCTGCTCTCCATGATGCTGAGGAGGCACTGAAGGAGATGGA

               R  L  T  D  L  E  A  L  R  S  Q  L  E  A  E  R  D  N  L  A  S  A  L  H  D  A  E  E  A  L  K  E  M  E 467

 

          1401 AGCGAAGTACGTTGCCTCGCAGAACGCTCTTAATCACCTCAAGTCCGAGATGGAACAACGTCTGCGTGAGAAGGACGAGGAACTGGAGAATCTGAGAAAG

                 A  K  Y  V  A  S  Q  N  A  L  N  H  L  K  S  E  M  E  Q  R  L  R  E  K  D  E  E  L  E  N  L  R  K  500

 

          1501 AGCACGACTCGCACGATTGAGGAGTTGACAACCACCATCTCAGAGATGGAGGTTCGCTTCAAGTCGGATATGTCTCGTCTGAAGAAGAAGTACGAGGCGA

                S  T  T  R  T  I  E  E  L  T  T  T  I  S  E  M  E  V  R  F  K  S  D  M  S  R  L  K  K  K  Y  E  A    533

                                                     TPmyX7           TPmyX5

          1601 CAATCAGCGAGCTAGAGGTGCAACTAGACGTGGCGAACAAGGCGAACGTCAACCTCAACCGCGAGAACAAAACCCTGGCTCAACGAGTTCAAGAGCTGCA

               T  I  S  E  L  E  V  Q  L  D  V  A  N  K  A  N  V  N  L  N  R  E  N  K  T  L  A  Q  R  V  Q  E  L  Q 567

 

          1701 GGCTGCGTTGGAGGACGAGCGACGAGCTCGCGAAGCTGCAGAGAGCAACTTGCAGGTGAGCGAGCGCAAACGCATCGCCCTTGCTTCGGAAGTGGAAGAG

                 A  A  L  E  D  E  R  R  A  R  E  A  A  E  S  N  L  Q  V  S  E  R  K  R  I  A  L  A  S  E  V  E  E  600

 

          1801 ATTCGCAGCCAACTGGAACTCAGTGACCGCGCTCGCAAGAACGCCGAGTCCGAACTCAACGATGCCAATGGACGTATCTCGGAGCTCACCCTATCGGTCA

                I  R  S  Q  L  E  L  S  D  R  A  R  K  N  A  E  S  E  L  N  D  A  N  G  R  I  S  E  L  T  L  S  V   633

 

          1901 ACACTCTTACCAATGACAAACGTCGACTTGAAGGCGATATTGGCGTCATGCAGGGCGATCTCGATGAGGCCGTCAATGCGCGCAAGGCTGCTGAGGATAG

               N  T  L  T  N  D  K  R  R  L  E  G  D  I  G  V  M  Q  G  D  L  D  E  A  V  N  A  R  K  A  A  E  D  R 667

 

          2001 AGCTGACCGTCTGAACGCTGAGGTACTCCGCCTGGCTGATGAGCTGCGACAGGAACAAGAAAATTACAAGCGTGCTGAGACTCTGCGCAAGCAACTTGAG

                 A  D  R  L  N  A  E  V  L  R  L  A  D  E  L  R  Q  E  Q  E  N  Y  K  R  A  E  T  L  R  K  Q  L  E   700

 

          2101 ATCGAGATCCGTGAGATCACGGTCAAGTTGGAGGAGGCTGAGGCTTTCGCTACTCGTGAGGGTCGCCGTATGGTTCAAAAGCTCCAGAATCGGGTGAGGG

                I  E  I  R  E  I  T  V  K  L  E  E  A  E  A  F  A  T  R  E  G  R  R  M  V  Q  K  L  Q  N  R  V  R   733

 

          2201 AGCTTGAGGCGGACGTGGACGGAGAAATTCGTCGCGCCAAGGAGGCCTTCGCCAACGCGCGCAAATACGAGCGTCAATTCAAGGAACTGCAGACACAGAG

               E  L  E  A  D  V  D  G  E  I  R  R  A  K  E  A  F  A  N  A  R  K  Y  E  R  Q  F  K  E  L  Q  T  Q  S 767

 

          2301 CGAGGATGATAAACGCATGATTTTGGAGCTTCAAGACCTGCTAGACAAGACTCAGATCAAGATGAAAGCCTACAAACGTCAGCTTGAGGAACAGGAAGAG

                 E  D  D  K  R  M  I  L  E  L  Q  D  L  L  D  K  T  Q  I  K  M  K  A  Y  K  R  Q  L  E  E  Q  E  E  800

 

          2401 GTGTCTCAGCTGACGATGAGCAAGTACCGTAAGGCGCAGCAACAGATTGAGGAGGCGGAACATCGTGCTGACATGGCGGAGAGGACGATCACCATTAAGA

                V  S  Q  L  T  M  S  K  Y  R  K  A  Q  Q  Q  I  E  E  A  E  H  R  A  D  M  A  E  R  T  I  T  I  K   833

                                                                                           TPmyX2

          2501 GGACAATTGGTGGACCCGGTTCCCGCGCCGTTTCGGTGGTTCGGGAGATCAACAGTGTCTCCCGTGGTAACCGTGCAACCAGCATCATGTAGATGTCCTC

               R  T  I  G  G  P  G  S  R  A  V  S  V  V  R  E  I  N  S  V  S  R  G  N  R  A  T  S  I  M  -  -  -    863

 

Figura 12. Secuencia nucleotídica y de aminoácidos de la región codificadora de la clona de cDNA de la paramiosina de la Taenia solium. Los codones de iniciación (ATG) y de terminación (TAG) se encuentran tachados. Las secuencias subrayadas señalan las secuencias correspondientes a los oligonucleótidos empleados para amplificar los fragmentos de la TPmy (Tomada de 49[L147] ).

 

         Nuestro grupo ha propuesto que las paramiosinas inhiben la producción de mediadores complementarios de inflamación en la interfase hospedero-cisticerco, es decir, que desempeñan un papel inmunomodulador de la respuesta del hospedero (46[L148] , 49[L149] ). El cisticerco puede evitar el reclutamiento de células hacia la interfase para disminuir la confrontación con su hospedero humano o porcino. Por lo anterior, la TPmy se ha convertido en un candidato para el desarrollo de una vacuna en contra de la cisticercosis.

         Cabe mencionar que la paramiosina es también candidato para el desarrollo de una vacuna contra infecciones helmínticas tales como esquistosomosis (23[L150] , 48[L151] , 76[L152] , 77[L153] , 81[L154] , 84[L155] ) y filariasis (51[L156] , 52[L157] , 70[L158] ). Además, se puede inducir protección contra Schistosoma japonicum con un anticuerpo monoclonal IgE anti-paramiosina (71[L159] ) y se ha sugerido que la respuesta inmune a la paramiosina se relaciona con la resistencia natural a la esquistosomosis en humanos (15[L160] ). Incluso, se ha logrado producir anticuerpos anti-paramiosina en ratón al vacunar con fragmentos de DNA que codifican para paramiosina  de Schistosoma japonicum (120[L161] ). Algunos resultados obtenidos en el laboratorio del Dr. Laclette muestran que la inmunización con TPmy recombinante induce protección en contra de la cisticercosis murina (Apéndice 2). Recientemente se ha encontrado que la inmunización con DNA de TPmy puede inducir protección contra la infección por el cisticerco de T. crassiceps (Laclette, comunicación personal). Finalmente, se ha encontrado que un anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno de superficie de 14 kDa de Onchocerca microfilariae reconoce una molécula que parece ser la paramiosina en un extracto de gusano adulto (13[L162] ).

 

         Para caracterizar la interacción de la paramiosina con la colágena y el C1q a nivel submolecular, en nuestro laboratorio se han preparado una serie de construcciones plasmídicas para la expresión recombinante de diferentes fragmentos de paramiosina,  así como de la molécula completa. Cada uno de los fragmentos recombinantes ha sido expresado, purificado en cantidad suficiente (del orden de miligramos) y probado en experimentos de unión a colágena y C1q, así como de inhibición del complemento. Cabe hacer notar que esta estrategia es posible gracias a que disponemos de clonas de cDNA, conteniendo la secuencia codificadora completa de TPmy (49[L163] ).

            Desde los primeros ensayos se determinó que la interacción con C1q es a través del extremo amino-terminal de la paramiosina. Por lo cual, en nuestro grupo se han realizado cinco series más de construcciones de expresión, que han permitido localizar el sitio de unión con C1q en fragmentos peptídicos cada vez menores, siempre asociado al extremo amino de la TPmy. El número total de construcciones de expresión exitosas obtenidas para el gene de TPmy se aproxima a 30. Se ha logrado expresar TPmy en cantidades preparativas incluso en sistemas eucarióticos glicosilantes. En la actualidad se tiene una idea razonable de la región de la TPmy que se une al C1q y este proyecto del grupo se encuentra en una situación investigativa especialmente interesante (Laclette, comunicación personal).

         La expresión de TPmy recombinante también ha permitido estudiar hacia que regiones de la proteína se dirige la respuesta inmune humoral y celular del hospedero. En estos estudios se utilizaron algunos de los fragmentos recombinantes mencionados arriba. Los ensayos de Western blot en los cuales se enfrentan sueros de pacientes con cisticercosis con cada uno de los fragmentos recombinantes, indican que los anticuerpos reaccionan principalmente con el extremo carboxilo-terminal de la TPmy, mientras que la respuesta celular de los sanos muestra una preferencia por el extremo amino-terminal (Apéndice 1). Estos resultados sugieren que el parásito oculta la región que une C1q al reconocimiento por anticuerpos. Recientemente se ha utilizado la técnica de “phage display” para la caracterización de secuencias epitópicas dentro de la TPmy (30[L164] ).

            El caso anterior es un ejemplo de la aplicación de la ingeniería genética para identificar las regiones de una molécula que son relevantes en su interacción con otras moléculas. Debido a que la paramiosina es un antígeno natural e inmunodominante es especialmente interesante determinar cuáles son las regiones de la molécula que interaccionan con el sistema inmune. Este estudio puede ayudarnos a comprender qué características debe reunir una molécula para ser inmunodominante o inmunogénica.

 

10. La paramiosina como antígeno protector

 

La inmunización con paramiosina induce protección contra la esquistosomosis (23[L165] , 77[L166] , 81[L167] , 101[L168] ) y contra la filariasis (52[L169] , 70[L170] ). Incluso el DNA codificante de paramiosina induce protección  contra S. japonicum (121[L171] ) y se ha inducido protección en cerdos contra la infección por S. japonicum (11[L172] ).

La paramiosina también puede inducir protección heteróloga. La Pmy de Caenorhabditis elegans induce protección contra Brugia malayi (70[L173] ) y lo mismo se ha sugerido de Lumbricus terrestris contra Schistosoma japonicum (118[L174] ); algo similar se ha encontrado en el laboratorio del Dr. Laclette, ya que la paramiosina de T. solium induce protección parcial contra T. crassiceps (Apéndice 2). Se ha propuesto que además de la protección de acuerdo al número de adultos de S. mansoni, también induce reducción en la formación de granulomas generados por huevos (35[L175] ).

Existe evidencia que sugiere que la respuesta inmune contra  paramiosina se correlaciona con resistencia en humanos a esquistosomosis (15[L176] ) y oncocercosis (104[L177] ).

         La evidencia respecto al mecanismo protector que induce la inmunización con paramiosina es interesante, especialmente por la polarización que fue descubierta en ratón entre la respuesta Th1 y Th2. Se sabe que la paramiosina induce protección contra S. mansoni o B. malayi junto con hipersensibilidad de tipo tardío o DTH (70[L178] , 101[L179] ), y que provoca la liberación de linfocinas activadoras de macrófagos contra S. mansoni (77[L180] , 101[L181] ); esto sugiere un mecanismo tipo Th1. En otro sentido, se induce protección contra S. japonicum con un anticuerpo monoclonal IgE y se induce citotoxicidad contra esquistosómulas cuando se incuba con eosinófilos (40[L182] ); esto sugiere un mecanismo tipo Th2. Estos datos sugieren que la resistencia contra esta clase de parásitos tiene, en parte al componente celular.

V. OBJETIVO DE PROYECTO:

 

         El objetivo general de esta tesis es contribuir a la caracterización de la respuesta inmune que el ser humano y el ratón desarrollan contra la paramiosina de la T. solium.

Objetivos particulares:

1) Inicialmente se estudió la respuesta humoral y celular del humano con cisticercosis en contra de la TPmy; con el objeto de determinar si la respuesta humoral y celular de los pacientes mostraba una preferencia de reconocimiento hacia alguna región de la TPmy, se expresaron en bacteria cuatro productos recombinantes de la TPmy: la proteína completa, el tercio amino-terminal, el tercio central y el tercio carboxilo-terminal. Todos ellos fueron purificados prácticamente a homogeneidad usando una técnica de cromatografía de afinidad (Apéndice 1), y puestos a reaccionar con sueros de pacientes humanos, o fueron usados para estimular células de sangre periférica de pacientes en un sistema de proliferación de linfocitos in vitro.

2) Debido a que no existe una vacuna establecida contra la cisticercosis evaluamos la capacidad de la TPmy para inducir protección en contra de la cisticercosis en el modelo murino. Además, se decidió estudiar la respuesta humoral y celular del ratón en contra de la TPmy; en concreto, se determinó si la respuesta humoral y celular del ratón mostraba una preferencia de reconocimiento hacia una región de la TPmy. Para ello, se emplearon los mismos cuatro productos recombinantes de la TPmy. Se inmunizaron ratones con la proteína completa y, los tercios fueron puestos a reaccionar con sueros de los ratones inmunizados, o fueron usados para estimular células de bazo en un sistema de proliferación de linfocitaria.

 

VI. HIPÓTESIS

 

            Dado que la paramiosina genera protección contra la esquistosomosis y la filariasis, induce protección contra la cisticercosis. Esto es a través de un perfil de respuesta inmune tipo Th1 que genera protección contra el cisticerco de T. crassiceps en el hospedero murino.