VIII. DISCUSIÓN GENERAL

 

         En la presente tesis se estudiaron las propiedades inmunológicas de la paramiosina completa así como de tres diferentes regiones: el tercio amino-terminal, el tercio central y el tercio carboxilo-terminal. Además, en colaboración con otro laboratorio se analizó la respuesta inmune celular del paciente neurocisticercoso. Primero se discutirán ciertos aspectos de los resultados obtenidos al analizar la respuesta inmune humana y murina en contra de la paramiosina de la Taenia solium y posteriormente, se discutirán ciertos aspectos de la respuesta inmune celular en general.

Un hecho básico para el desarrollo de la presente tesis fue el aprovechamiento de técnicas de DNA recombinante. Previamente se habían obtenido, caracterizado y expresado clonas con la secuencia codificadora total de la TPmy (49[L1] ). Estas clonas fueron usadas como templado para obtener por amplificación con PCR, las regiones codificadoras de los tres fragmentos y de la proteína completa  (113[L2] , 114[L3] ). La amplificación se realizó con oligonucleótidos sintéticos diseñados para amplificar solamente las regiones deseadas. Los oligonucleótidos tenían, además, un sitio de restricción (EcoRI o HindIII) para facilitar su posterior ligación a un vector de expresión (pRSET).

         La decisión para usar este vector de expresión se debe, por un lado, a que posee un promotor viral de T7, capaz de inducir altos niveles de expresión de la proteína recombinante. Otra ventaja, es la facilidad y seguridad que ofrece el vector para controlar la expresión del promotor, lo que garantiza la rápida y segura expansión de las bacterias transformantes antes de la inducción. Finalmente, una ventaja más que ofrece el vector es que la proteína se expresa unida a un péptido de fusión con seis histidinas que permite la posterior purificación por cromatografía de afinidad (Apéndice 1).

         La purificación de las proteínas recombinantes consistió básicamente en el aislamiento de los cuerpos de inclusión y su solubilización en un medio altamente desnaturalizante, aprovechando la afinidad del péptido de fusión hacia metales divalentes (Apéndice 1).

         Se ha sugerido que la paramiosina induce protección contra infecciones parasitarias del ser humano. Se ha relacionado la respuesta inmune humana contra la paramiosina  con la resistencia a esquistosomosis o a oncocercosis. Además, con la paramiosina se ha generado protección contra las mismas infecciones helmínticas en el modelo murino; en la presente tesis se muestra que la TPmy induce protección contra el cisticerco de Taenia crassiceps.  Como se puede ver con más detalle en la tabla 4 del apéndice 2, la protección va acompañada de una respuesta inmune tipo Th1.

         Se observó que la respuesta humoral humana se dirige preferentemente contra el tercio carboxilo-terminal, siendo el tercio amino-terminal, pobremente reconocido y que en los ratones inmunizados ocurría el mismo fenómeno que en la infección natural humana. Como se discute con más detalle en la publicación, los anticuerpos de los individuos infectados con Schistosoma japonicum, también reconocen preferentemente al tercio carboxilo-terminal (72[L4] ).

Es posible que el reconocimiento débil del tercio amino-terminal se deba a un  bloqueo causado por la unión del C1q en la vecindad del cisticerco. En resultados no publicados se ha encontrado que en el tercio amino-terminal de la TPmy se concentra su capacidad para unirse al C1q del complemento. Es posible que en el individuo infectado, el C1q se encuentre unido al tercio amino-terminal de la TPmy resultando en una incapacidad del sistema inmune para reconocer a este tercio. Esto podría explicar por qué en dos sistemas (humano y ratón) y por dos métodos (Western blot y ELISA) el tercio amino-terminal es el menos reconocido.

Llama la atención el contraste entre el reconocimiento humoral del tercio amino-terminal y el tercio carboxilo-terminal, en el humano y el ratón. Ambos fragmentos tienen tercios con estructura al azar (random coil) y una gran porción en forma de una a-hélice superenrrollada (12[L5] ). Por lo cual no hay diferencias conformacionales obvias que sugieran que las diferencias en el reconocimiento por anticuerpos estén relacionadas con diferencias estructurales entre los dos tercios. Además, se empleó un programa que analiza secuencias de aminoácidos con el fin de encontrar el punto de mayor hidrofilicidad, lo que permite localizar determinantes antigénicos (37[L6] ), y se pudo realizar ya que se conoce la secuencia de aminoácidos completa de la TPmy. El nivel de hidofilicidad lo calcula asignándole a cada aminoácido un valor numérico (un valor de hidrofilicidad) y repetitivamente promedia esos valores evaluando segmentos de 6 residuos a lo largo de la cadena polipeptídica. La secuencia con valor promedio local más alto invariablemente corresponde, o está inmediatamente adyacente, a un determinante antigénico. Usamos este programa para analizar la secuencia de la TPmy. El programa indicó que el principal determinante antigénico en la secuencia se localiza entre los residuos 489-494 (en el tercio central). En contraste, el principal determinante antigénico del tercio amino-terminal, mucho más débil que el anterior, se localiza entre los residuos 128-133. Estas predicciones correlacionan con los resultados encontrados en ratón, pero no con los de humano; ya que en el ratón, el tercio central y el tercio carboxilo-terminal fueron más reconocidos que el tercio amino; y en el humano, el tercio central fue poco reconocido. Tal vez, epítopos importantes localizados en el tercio central se desnaturalizen durante la inmunoelectrotransferencia. También, encontramos que la secuencia 767-772 (en el tercio carboxilo) tiene una baja probabilidad de ser un determinante antigénico; sin embargo, fue preferentemente reconocido en los dos modelos (humano y ratón) y en ambos sistemas (Western blot y ELISA).

         También, se analizaron los isotipos de anticuerpos de los ratones inmunizados con el tercio amino-terminal, encontrándose dominancia de la subclase IgG1 sobre la IgG2a, lo cual sugiere un perfil de respuesta tipo Th2. Sin embargo, como se muestra en la Tabla 4 del Apéndice 2, esos ratones no mostraban producción de IL-4 antígeno-específica. A este respecto se ha publicado que existen dos tipos de IgG1; un tipo tiene actividad anafiláctica y es dependiente de IL-4. El otro tipo no tiene esta actividad, no es dependiente de IL-4 y su síntesis es estimulada por la IL–12 o por el IFN-g (22). Además, se ha encontrado que si bien la respuesta policlonal de IgG1 se correlaciona con la presencia de IL-4, la respuesta antígeno-específica no se correlaciona (107[L7] ). Por lo anterior, es posible que la IgG1 detectada pueda producirse de manera independiente a IL-4, o bien, solamente se produce IgG1 contra el tercio amino-terminal, aunque policlonalmente sea una respuesta Th1. Este isotipo de anticuerpos es similar al hallado en esquistosomiasis en donde también se detecta IgG1 al inmunizar los ratones con paramiosina de S. mansoni (85[L8] ,  120[L9] ).

Aunque, en las publicaciones incluidas en la presente tesis no se presenta detalle, vale la pena mencionar que la resistencia en la infección natural en humanos parece estar relacionada con la respuesta celular contra el tercio amino-terminal, ya que un mayor porcentaje de individuos sanos reaccionaron contra este tercio, en comparación con los infectados. Como también se describe en una de las publicaciones, es posible inducir 47-87% de protección por inmunización de ratones con el mismo tercio amino-terminal. Además, se encontró que los linfocitos T de ratones inmunizados con la TPmy proliferan principalmente contra el mismo tercio amino-terminal (ver Tabla 3 del Apéndice 2). También se encontró que la respuesta inmune que induce este fragmento es tipo Th1, es decir, que tiene un fenotipo celular. Además, el perfil de proliferación de los individuos sanos que se muestra en la tabla 1 del apéndice 1 es muy similar a la del grupo murino control de la tabla 3 del apéndice 2; es decir, más humanos sanos respondieron al tercio amino-terminal y central que al tercio carboxilo-terminal y, de manera similar, el grupo control murino tiene mayor índice de proliferación al ser estimulado con el tercio amino-terminal y central que al ser estimulado con el tercio carboxilo-terminal. Por lo tanto, pareciera que el nivel de proliferación depende de la región de la proteína que se usa para estimular. Es posible que la respuesta inmune-celular en contra del tercio amino-terminal sea consecuencia de que éste puede unirse a la colágena. Existe un receptor con una región de estructura colagénica que se encuentra en macrófagos, el receptor “scavenger”. De hecho, alguna evidencia reciente de nuestro propio grupo indica que la TPmy interacciona con el receptor “scavenger”, siendo capaz de inducir la internalización de partículas de lipoproteínas de baja densidad (62[L10] ). Se ha sugerido que los antígenos al unirse a este receptor son mejor presentados a los linfocitos T y son más inmunogénicos (1[L11] ). Por lo tanto, el tercio amino-terminal puede tener una mayor capacidad unirse a una célula presentadora cómo el macrófago que el tercio carboxilo-terminal, explicando la mayor proliferación linfocitaria en ambos sistemas (humano y ratón). También, explica la relación entre la respuesta inmune celular y la protección (ver sección II. 10 y 86[L12] ).

Con el objeto de identificar epítopos para  células T, se empleó un programa con un algoritmo basado en el modelo de hélice anfipática (60[L13] ), el cual postula que los sitios antigénicos son hélices con una “cara” predominantemente polar y la opuesta es una “cara” apolar. Por lo tanto, el algoritmo busca a-hélices y b-plegadas en una cadena peptídica. Al analizar la secuencia polipeptídica de la TPmy que es una proteína cuya secuencia de aminoácidos forma a-hélice, se encontró que la secuencia entre los residuos 720-751 (cerca del tercio carboxilo-terminal) tiene la mayor anfipatía, seguida por las secuencias 355-377 y 398-436 (en el tercio central) y posteriormente, la secuencia 57-67 (una secuencia amino-terminal). Sin embargo, estas regiones de la TPmy no se correlacionan con respuesta celular observada en pacientes (Tabla 1 de Apéndice 1), ni en ratones inmunizados (Tabla 3 de Apéndice 2).

Analizamos el perfil de citocinas que liberaban los esplenocitos de manera inmune-específica al ser estimulados con el tercio protector, el tercio amino-terminal,  detectándose la liberación de IL-2, IFN-g, pero no de IL-4. En resultados no incluídos en las publicaciones, este perfil también se observa por RT-PCR, ya que se detectó la producción de mRNA de IFN-g en más ratones inmunizados (4/5) que en ratones controles (2/4). Estas citocinas son propias de un tipo de respuesta Th1, similar a lo descrito previamente por otros grupos para T. crassiceps (ver II.8a).

También se realizó el análisis del fenotipo (CD4+ o CD8+) de los linfocitos T para determinar si una población dominante participaba en la protección. Sin embargo, los porcentajes obtenidos en los grupos experimentales y los controles no mostraron diferencias significativas ni en ratones sólo inmunizados, ni en ratones protegidos, ni en cultivos de esplenocitos estimulados con antígeno de ratones inmunizados. Estos resultados son similares a los encontrados en otras publicaciones en donde buscan qué linfocito T (CD4 o CD8) participa de forma dominante en el control la infección  (16[L14] , 59[L15] , 69[L16] , 108[L17] ). La evidencia indica que ambas poblaciones (CD4+ y CD8+) participan en la protección.

También, exploramos la duración de la protección, ya que no sabíamos cuanto tiempo pasaría entre la inmunización y el reto por lo tanto se infectó a los cinco, diez y quince días después de la última inmunización. A los quince días la protección desciende al 16% (datos no mostrados en esta tesis).

         En la presente tesis se estudiaron las propiedades inmunológicas de una región de la TPmy que induce protección contra la cisticercosis murina (tercio amino-terminal) (Apéndice 2). Se detectó la liberación de IL-2, IFN-g, pero no de IL-4 de manera antígeno-específica, en los ratones inmunizados con el tercio amino-terminal (ver Tabla 4 del Apéndice 2). Sin embargo, no se encontraron evidencias claras acerca de si los linfocitos CD4+ o los CD8+ participan en la protección. Finalmente, también se observó que la protección desaparece rápidamente. En este sentido, es necesario establecer un método de inmunización que prolongue la protección antes de realizar pruebas de campo.

En la tercera publicación (Apéndice 3) en que se compara la respuesta inmune celular de pacientes con neurocisticercosis con la respuesta inmune de individuos sanos, se reporta que ambos responden de la misma forma; es decir que en pacientes con cargas parasitarias bajas no se detectan señales de inmunosupresión (ver Tabla I del Apéndice 3). Este resultado contrasta con varias publicaciones que muestran fenómenos de inmunosupresión  en cerdos o ratones cisticercosos (ver II. 4). En otra publicación que analiza la respuesta inmune de pacientes humanos (14[L18] ), además de la cisticercosis padecían otras enfermedades tales como: amibiasis, ascariasis, teniasis, asma, rinitis y alergias a alimentos. Es posible que estos pacientes posean una inmunodeficiencia que los hace más susceptibles a diferentes enfermedades, entre ellas, la cisticercosis. La idea del establecimiento de cisticercos en individuos con inmunodeficiencias ya ha sido sugerida anteriormente (14[L19] ), quienes no especifican si los pacientes estaban siendo tratados con corticosteroides. Los corticosteroides se emplean en neurocisticercosis para controlar la sintomatología; además, los corticosteroides inhiben la proliferación de linfocitos T y la transcripción de genes de citocinas (105[L20] ). Puesto que en 1984 se empleaban los corticosteroides (61[L21] ) es posible que los pacientes incluidos en aquella publicación (14[L22] ) hubieran sido tratados con corticosteroides, por lo que podrían estar inmunosuprimidos por el tratamiento; sin embargo, este efecto en el sistema inmune no permite explicar la presencia de las otras infecciones (amibiasis, ascariasis, teniasis, asma, rinitis y alergias a alimentos); por lo tanto, es posible que los pacientes poseyeran una inmunodeficiencia que los hiciera más susceptibles a diferentes enfermedades. En cambio, en nuestra publicación los pacientes no recibieron tratamiento inmunosupresor, cestocida, ni presentaban infecciones recurrentes. La inmunodeficiencia previa permite explicar  las diferencias en la evidencia presentada en ambas publicaciones.

IX. CONCLUSIÓN

 

Hemos obtenido evidencia en el humano y el modelo experimental murino de cisticercosis por el metacéstodo de T. crassiceps, que permite sugerir que la respuesta inmune celular en contra de la región amino-terminal de la TPmy se correlaciona con resistencia y/o protección a la infección por el cisticerco. Se ha demostrado que este modelo experimental permite sugerir candidatos a vacuna contra la cisticercosis porcina (36[L23] , 58[L24] , 95[L25] ). Debido a que es más plausible la aplicación de este antígeno en el hospedero porcino, es necesaria la realización de estudios piloto en cerdo antes de aplicar este antígeno al nivel de campo.