Los dos protocolos clásicos de secuenciación (método químico y enzimático) comparten etapas comunes.
Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen como una escalera de bandas cuya longitud varía en un único nucleótido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:
Este método de secuenciación de ADN fue diseñado por Sanger, Nicklen y Coulson también en 1977 y
se conoce como método de los terminadores de cadena o dideoxi. Para este método resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un iniciador
, cebador o "primer" complementario de una región del ADN molde anterior a donde va a iniciarse
la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima ADN polimerasa I que va a
extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de ADN. Es una alternativa al método de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con un
compuesto fluorescente y activar la reacción de secuencia. Los productos de la reacción se
detectan directamente durante la electroforésis al pasar por delante de un láser que al
excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida. Secuenciación empleando cebadores fluorescentes Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se añade el
oligonucleótido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en
cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un único tubo. Secuenciación empleando terminadores fluorescentes Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de
ellos marcados con una sonda fluorescente distinta. Secuenciadores automáticos capilares
Existen instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa clara al
sistema basado en geles de acrilamida/bisacrilamida donde este soporte ha sido sustituido por
un polímero que se inyecta de forma automática en un capilar antes de cargar la muestra de
secuenciación; las muestras se van analizando una a una. Este tipo de secuenciadores se utiliza
para lecturas no superiores a unos 450pb. Secuenciación automática en geles desnaturalizantes de acrilamida/bisacrilamida La secuenciación automática mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando un
gel de acrilamida/bisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el cassette que
sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplará en el secuenciador automático
para proceder a la carga de la muestras. METODO ENZIMATICO DE SANGER
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO
SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
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