Terapia génica

 

 

 

       La terapia génica se define como la introducción artificial de genes en un tejido enfermo para modificarlo genéticamente con el objetivo de curar o mitigar la enfermedad. Una definición más rigurosa sería que la terapia génica es la restauración de la función de un gen mediante la introducción de su equivalente funcional en una célula que posee una versión mutada del mismo. Básicamente se trata de corregir enfermedades de origen genético mediante la reparación de un gen defectuoso o la sustitución de éste por uno sano. La terapia génica introduce un gen que funciona en el lugar dónde se necesita el producto de ese gen. Y tales prácticas solo han llegado a buen fin en dos casos: Drosophila melanogaster y en ratones.

            En la mosca del vinagre los ojos de los individuos normales son de color rojo aunque existen, de forma natural en las poblaciones, mutantes completos o defectivos para el gen que controla este carácter los cuales tienen ojos de color blanco o intermedio entre blanco y rojo respectivamente. Además, desde hace años se sabe que en el patrimonio genético de estos animales están presentes, al igual que en bacterias, levaduras y plantas, unas secuencias con capacidad autónoma para cambiar de posición dentro del genoma. Son los denominados genes “saltadores”, elementos móviles o transposones (elementos que se transponen vía DNA). Valiéndose de esta propiedad se ha conseguido insertar nuevos genes mediante el elemento P, un transposón característico de D. Melanogaster. Por efecto de la transposición del gen normal, los individuos mutantes adquirieron la  pigmentación roja habiéndoseles devuelto el fenotipo silvestre a estas moscas ahora transgénicas. El transposón P unido al gen silvestre o salvaje (el no mutado) fue inyectado en los huevos fecundados, integrándose éste con gran eficacia en el genoma y además en una única dosis y en lugares bien localizados (características propias y muy ventajosas de los transposones). En cualquier caso, los elementos móviles no han sido detectados en vertebrados, por lo que tales métodos no pueden llevarse a cabo de manera similar; no obstante cabe la posibilidad de emplear parte de dicho transposón, concretamente las secuencias de inserción, para facilitar la transposición de genes de interés terapéutico.

            Si se tiene en cuenta que la transposición cambia la estructura nucleotídica del ADN y consecuentemente altera el funcionamiento de los genes colindantes, es fácil entender que tales elementos, cuya función exacta no es bien conocida, han influido y lo seguirán haciendo de manera decisiva en los complejos procesos que modulan la evolución de los seres vivos.

            Por otro lado, el primer caso de éxito real conseguido en la curación de enfermedades genéticas mediante las técnicas de ADN recombinante fue el descrito por Hammer y colaboradores en 1984. Estos autores disponían de una cepa de ratones enanos cuyo fenotipo anormal era causado por una mutación del gen “little” (de ahí el nombre de mutantes li) asociada a la presencia de bajas concentraciones de hormona del crecimiento en el suero de estos animales. Tales ratones fueron curados mediante técnicas similares a las descritas anteriormente introduciendo el gen normal de esta hormona (GH) en su propio genoma. No obstante, también fueron observados casos en los que la regulación de dicho gen no era la adecuada siendo esto fuente de aberraciones fenotípicas tales como el gigantismo.

           

            En general, ¿cómo se introduce el gen en el tejido enfermo?. El material genético puede ser transferido directamente a las células del paciente in situ (terapia génica in vivo) o a las células que previamente han sido recogidas y cultivadas in vitro, que después de modificarlas son transferidas de nuevo al paciente (terapia génica ex vivo).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

            Esta última estrategia es aplicable a células como los hematoblastos y las células de la piel, que son accesibles, de manera que se puede coger una muestra del paciente  para transferirla posteriormente al mismo individuo, una vez tratada. Además, también es posible en estos tipos de intervenciones seleccionar las células que han adquirido el gen.

            En ambos casos se pretende que los genes introducidos se puedan expresar en las células receptoras.

            Hay varios métodos de transferencia de DNA a células:

           

a)      Métodos físicos:

 

-         Microinyección de DNA en núcleos celulares; fue el primero que se utilizó, concretamente con ratones (se inyectaban los genes en óvulos fecundados del ratón).

-         Electroporación.

-         Mediante proyectiles de tungsteno.

 

b)      Métodos químicos:

 

-         Introducción de complejos DNA-(DEAE dextrano).

-         Coprecipitación del DNA con fosfato cálcico.

-         Introducción de complejos DNA- lípidos.

 

 

Los métodos fisicoquímicos presentan serios inconvenientes:

 

-         Muy baja eficiencia de transferencia de genes.

-         Gran número de copias de DNA por célula.

-         Las células que han incorporado el DNA introducido no pueden ser separadas de las que no lo han incorporado.

 

Podemos concluir que los métodos fisicoquímicos se consideran inaplicables cuando se necesita transfectar, con alta eficacia, un gran número de células.

 

            c) Fusión, proporcionando la unión de las células con vesículas de membrana que contienen DNA, como son los liposomas, los glóbulos rojos y los protoplastos.

 

 

 

d) Métodos biológicos:

 

-         Transferencia de DNA mediante vectores víricos. Esto es, técnica viral, virus RNA (retrovirus) y virus DNA (SV40, adenovirus y el virus del papiloma bovino): lo que ha de preocuparnos de este método es que puede causar infecciones.

 

 

Como vectores para transferir estos genes, se utilizan construcciones derivadas de virus de mamíferos, como los retrovirus y los adenovirus. Los primeros tienen capacidad para inserirse en el cromosoma de las células receptoras, pero sólo infectan células que se dividen activamente. Los segundos infectan una gran variedad de células eucariotas diferentes, pero no se integran eficientemente. La integración es importante para asegurar una expresión continua y estable del gen inserido, lo que constituye una ventaja importante cuando se trata de actuar en enfermedades hereditarias y alteraciones crónicas. Pero también comporta algunos riesgos, como posibles alteraciones debidas a una sobreexpresión del producto génico, o bien la posible introducción de cambio mutagénicos como resultado del efecto de la inserción.

No obstante ya comentaré más adelante este tema de un modo más riguroso.

Hay otros métodos alternativos para facilitar la entrada de genes que no utilizan sistemas virales, como por ejemplo el uso de liposomas sintéticos, que penetran en el interior de las células por endocitosis.

 

Cada uno de estos cuatro tipos de técnicas tiene sus ventajas según el tipo de experimento, pero ninguna de estas técnicas se ha podido utilizar para introducir un gen dentro de un cromosoma específico en una célula elegida. La técnica de los vectores virales parece ser la más prometedora para el uso posterior en humanos.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Enfermedades candidatas al tratamiento mediante terapia génica

 

 

 

            Inicialmente se pensó que las anormalidades en la hemoglobina (especialmente las talasemias) serían las primeras candidatas en la utilización de la terapia génica, ya que la alteración  se evidencia únicamente en los glóbulos rojos y las células de la médula ósea son las más fáciles de manipular in vitro. Además, los genes implicados en dichas anomalías ya habían sido clonados. Pero si bien era posible la transferencia del DNA protector a las células portadoras, la síntesis de las globinas tiene una regulación bastante compleja, lo cual ha dificultado este objetivo.

            Conviene que nos detengamos un instante en describir la talasemia. La talasemia es una grave anemia de la infancia y es heredada recesivamente, aunque los pacientes heterocigotos tienen síntomas hematológicos menores. A la anomalía de heterocigoto se le denomina talasemia menor, y a la del homocigoto se la conoce como talasemia mayor. Una enfermedad híbrida, la talasemia falciforme, se presenta clínicamente como anemia calciforme en los caucasianos.

            En la talasemia mayor la anemia se desarrolla en los primeros dos años de vida. El abdomen se agranda con una masiva hepatosplenomegalia. Se aprecia un retraso en el crecimiento.  La muerte normalmente está motivada por infección o diátesis hemorrágica.

            Otras enfermedades candidatas a terapia génica son:

            - Fibrosis cística del páncreas: los pacientes sufren una infección respiratoria aguda en la infancia, ya sea bronquitis, afecciones de los bronquios o bronconeumonía. Los primeros síntomas de la enfermedad se refieren al tubo digestivo. El abdomen se distiende. La ganancia en peso es pequeña a pesar del voraz apetito de estos individuos.  Un análisis microscópico de las deposiciones revela un número anormalmente grande de gránulos de glucógeno, glóbulos de grasa y fibras de carne. Los análisis químicos revelan un aumento en la concentración de grasa fecal. El páncreas tiene una superficie granulada y es duro al tacto. Aparecen a veces quistes diminutos. Microscópicamente se encuentra que los acini y túbulos están dilatados por una sustancia mucoide, siendo a veces la dilatación tan grande que los túbulos parecen como quistes.   

-Distrofia muscular: es una anomalía progresiva que se manifiesta en los muchachos alrededor de su tercer año de vida y termina fatalmente durante los siguientes quince años. El primer signo es una debilidad muscular, teniendo el niño dificultad para andar o para elevarse del suelo a una posición erecta. Al principio los músculos, particularmente los de la pantorrilla, se presentan mayores de lo normal. A continuación hay una progresiva debilitación y aparición de atrofia, que afecta por último a todos los músculos estriados, incluyendo las músculos del diafragma e intercostales. La muerte puede originarse por parálisis respiratoria y neumonía.

-Fenilcetonuria: las personas con esta enfermedad son gravemente retrasadas. A menudo se encuentra una ligera microcefalia. La manera de andar y los movimientos son espasmódicos, los músculos tensos y los reflejos hiperactivos. Las anormalidades en la piel incluye un descenso en la pigmentación. La piel es frecuentemente rugosa y con eczemas. La esperanza de vida apenas supera los treinta años en el 75% de los casos. La causa principal de la muerte es la infección.

-Anemia falciforme: esta enfermedad es una anemia hemolítica grave heredada como anomalía recesiva autosómica, que es aparente por vez primera en la infancia y frecuentemente fatal. Se debe a un ritmo excesivo de destrucción de eritrocitos (vida media de sólo 60 días). Los pacientes presentas los síntomas típicos de una enfermedad hemolítica crónica, incluyendo la reticulocitosis. También se da eritrofagocitosis en el bazo. En los comienzos de la vida el bazo es grande, pero repetidos infartos debidos a trombos de células falciformes, lo reducen a un pequeño órgano fibrótico. Hay crisis hemolíticas y sintomáticas.   

     

    

 

 

 

-Requerimientos que deben cumplir las enfermedades candidatas a terapia génica:

           

·        El defecto génico que causa la enfermedad debe ser, preferiblemente, monogénico y de modo de herencia recesivo (esto es, debe ser producido por un único defecto en un único gen ).

·        El gen debe haber sido aislado y clonado.

·        La morbilidad y mortalidad de la enfermedad deben justificar la aproximación experimental para su tratamiento.

·        El tejido al que se ha de transferir el gen deberá ser fácilmente accesible para su manipulación in vitro y transplante (y por supuesto que se le pueda devolver al paciente).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Primeros intentos de terapia génica, actualidad y perspectivas

 

 

           

            Los primeros pasos:

 

Hipotéticamente la terapia génica se podrá realizar en primer lugar en los casos en que no sea necesario regular con gran precisión los niveles de proteína (Factor VIII). Es decir, genes que se expresan de forma constitutiva en la célula y que por tanto no precisan de mecanismos específicos de regulación. Se eligieron tres genes como candidatos iniciales: la hipoxantina- guanina- fosforribosiltransferasa (HPRT), cuya deficiencia produce la enfermedad de Lesch-Nyhan, la purina nucleótido fosforilasa (PNP) y la adenosina deaminasa (ADA), de la cual hablaré más adelante, y cuya falta genera una severa inmunodeficiencia. En los tres casos no ha sido posible evidenciar niveles enzimáticos detectables en las células de la médula ósea de los pacientes homozigóticos para cada uno de estos tres defectos. Por otra parte, los genes de estas tres enzimas están ya clonados y se dispone de su DNA complementario, por lo que la presencia de pequeñas dosis de tales enzimas podría significar la curación genética de las enfermedades que causan cuando éstos son defectuosos. Es más, concentraciones ligeramente superiores a las normales no tendrían efectos perjudiciales sobre los pacientes tratados. Un cuarto gen elegido fue el de la fenilalanina hidroxilasa (PAH).

            En resumen, los fenotipos defectivos para tales actividades presentan inmunodeficiencias profundas (PNP y ADA) o bien retraso mental (HPRT y PAH).

            Otro dato significativo es que ya ha sido posible la transformación genética vía plasmídica bien de organismos superiores, como es la transformación de ratones con el gen HPRT, bien de células eucariotas en cultivo, como es la línea celular NIH 3T3 de mamífero con el gen PAH. Para ello, se han tomado células pluripotenciales de médula ósea las cuales han sido transformadas in vitro y reimplantadas en estos animales. Al poco tiempo se detectó la presencia en las células transformadas no sólo del mRNA específico de cada gen sino de las proteínas estructurales y enzimáticas codificadas por los mismos. Aún más, sorprendentemente tales proteínas poseían idénticas propiedades inmunológicas y enzimáticas que las originales presentes en humanos normales.

            Los únicos tejidos humanos en los que se podrían aplicar las técnicas de transferencia genética son la médula ósea y la piel. Ningún otro tipo celular se puede, por ahora, extraer del cuerpo, crecer en cultivo y reimplantar de nuevo en el mismo paciente del que se extrajo. Los experimentos de transferencia génica están bastante más avanzados en médula ósea. Ésta contiene una población heterogénea de células, la mayoría de las cuales están programadas para diferenciarse en eritrocitos, linfocitos, megacariocitos, etc. Solamente una pequeña proporción (0,5-1%) de las células de la médula ósea son pluripotenciales. Estas células serían las idóneas para la terapia génica.

            El primer intento de terapia génica, que ha tenido cierto éxito en una enfermedad monogénica, fue el caso de la deficiencia en adenosina desaminasa (ADA), una enfermedad hereditaria recesiva poco frecuente. ADA es una enzima que mantiene el metabolismo basal celular (“house- keeping”), sintetizada en diferentes tipos celulares, que participa en la ruta metabólica de la degradación de los ácidos nucleicos. Una deficiencia en esta enzima tiene consecuencias graves para el paciente, afectado en el sistema inmunológico, principalmente en los linfocitos T.

            Este caso constituye el primer protocolo de terapia génica en humanos y data del 14 de septiembre de 1990. El objetivo no era otro que corregir la deficiencia en ADA en una joven.

            Los objetivos del protocolo eran:

1)      Objetivo clínico: evaluar la posible eficacia terapéutica de la administración de linfocitos autólogos modificados con un gen de ADA normal.

2)      Objetivo científico: evaluar la supervivencia in vivo de células T manipuladas y la duración de la expresión de los genes insertados.

 

Además existe un protocolo modificado que consiste en la transferencia génica a una  fracción enriquecida en células hematopoyéticas madre (vida media más larga que TIL).

Las razones que explican el por qué de una terapia génica en esta enfermedad son:

-         El gen ADA es pequeño y está bien estudiado molecularmente.

-         Las células diana, los linfocitos T, son muy accesibles y fáciles de cultivar en el laboratorio, y eso posibilita una terapia ex vivo.

-         La enfermedad es recesiva y no se requiere un nivel estricto del producto génico para el buen funcionamiento (hay un amplio rango de actividad enzimática en los individuos normales).

Estos datos indican que la regulación de la expresión de este gen no es muy compleja.

           

           

 

 

 

            El protocolo para la aplicación de la terapia génica en la deficiencia  de adenosina desaminasa está esquematizado en la figura 12.7 e implica cuatro pasos esenciales:

1.      Clonar un gen ADA normal en un vector de tipo retrovírico.

2.      Transferir la construcción recombinante a un cultivo de linfocitos T procedentes de los enfermos y, por tanto, deficientes en la enzima ADA.

3.      Identificar las células ADA⁺ y multiplicarlas en el cultivo. Esta labor se facilita si el retrovirus lleva un marcador seleccionable, como por ejemplo el gen neo^R, que confiere resistencia a la neomicina.

4.      Finalmente, reimplantar estas células en el paciente.

 

Es importante destacar que este protocolo no cura la enfermedad, sólo transmite ciertas mejorías a los pacientes, porque la manipulación genética se ha hecho en células diferenciadas, que mantienen la expresión del gen introducido de forma temporal (mientras viven). En cambio, la manipulación genética en células no diferenciadas de la médula ósea aseguraría la curación de esta enfermedad, pero este tipo de células es más difícil de aislar.

A raíz de este trabajo, se llevaron a cabo experimentos de terapia génica en otras enfermedades hereditarias, incluso en casos en que esta idea parecía poco realista, como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). Algunas dificultades se centran en la voluntad de expresar el gen DMD, de gran tamaño, en un tejido relativamente poco accesible como es el músculo. El problema del gran tamaño del gen se resuelve porque la región codificadora representa el 0,5 % del total, es decir, unas 14 kb (kilobases), y una parte de ésta puede ser eliminada sin ninguna consecuencia clínica grave. De este modo es posible construir un minigen de tamaño aceptable para cualquier vector de transferencia y que sea portador de la secuencia esencial del gen DMD.

En líneas generales el empleo de la ingeniería genética en el tratamiento de las enfermedades humanas sólo está empezando. En julio de 1990, dos comités del “National Institutes of Health” aprobaron tratamientos de terapia génica en humanos. En el primer caso, se tenía que inyectar un gen de factor de necrosis de tumor en gente con cáncer. El factor de necrosis a menudo reduce los tumores. El gen está en linfocitos que han sido manipulados. El primer grupo que se tratará será el de los que tengan un melanoma maligno, una forma incurable de cáncer de piel. El otro estudio es el que acabo de exponer. A un niño se le inyectaron células para reemplazar el gen de la enzima adenosina desaminasa, una enzima cuya falta provoca una disfunción del sistema inmune (son los llamados niños burbuja). El SIDA, la hemofilia y la diabetes son otras enfermedades que deberían ser asequibles a la terapia génica en un futuro próximo. 

 

 

 

 

 

Situación actual:

 

Las enfermedades genéticas hereditarias, a día de hoy, se pueden mitigar pero no curar. Y dado que 1 de cada 100 niños nacidos sufre una enfermedad genética, los estudios en este campo están progresando bastante, pero aún se desconocen muchas cosas.

En la actualidad la terapia génica en humanos está restringida a los tejidos somáticos, es decir, las consecuencias del tratamiento afectan tan sólo al paciente. Una alternativa más ambiciosa es conseguir que el cambio genético deseado sea estable, para que se transmita por las células de la línea germinal. Así, los descendientes del individuo tratado tampoco presentarían la tara génica. No obstante, la modificación genética de estas células no se considera por cuestiones éticas y, por tanto, al menos de momento, este objetivo está aparcado en los humanos.

La terapia génica se puede dividir pues en dos tipos:

-         Terapia génica de las células somáticas: inserción de un gen normal en células somáticas.

-         Terapia génica de la línea germinal: inserción de un gen normal en células germinales (óvulos o espermatozoides) o en células embrionarias tempranas. Tales prácticas darán lugar a organismos transgénicos con un gen normal en lugar del gen defectuoso o con el gen defectuoso.

 

La modificación genética de células germinales solamente se aplica a animales para la obtención de individuos transgénicos, con el fin de conseguir una mejora en la producción o la creación de modelos animales. Se entiende por organismo transgénico aquel organismo eucariota portador de genes alienados de forma estable y se habla de transgenes para referirse a estos.

Las enfermedades de herencia monomérica en que el gen responsable está bien caracterizado molecularmente son objetivos claros de la terapia génica. En el caso de enfermedades recesivas (enfermedad de Tay-Sachs, fibrosis cística del páncreas), en las cuales la ausencia del producto génico normal es la causante de la enfermedad, la introducción de un alelo normal funcional sería teóricamente suficiente para combatirla (terapia con aumento génico). Por el contrario, las enfermedades hereditarias de manifestación dominante (como por ejemplo el enanismo) son mucho más difíciles de tratar por manipulación genética, porque el efecto patogénico del alelo mutante está presente. Generalmente, no es la falta del producto génico normal la causa de la enfermedad, sino la presencia del producto génico anómalo. Por consiguiente, en estos casos la solución sería corregir el gen mutante, es decir, sustituir la secuencia alterada por otra equivalente del alelo normal o inactivar de manera selectiva el gen mutante. En principio, los dos procesos se pueden conseguir por recombinación homóloga, pero no es tan fácil, sobretodo con la precisión requerida.

Hay otras formas de inhibir selectivamente un gen. Técnicamente es posible hacerlo en los diferentes niveles de expresión. Por ejemplo, se puede bloquear la transcripción de un gen mediante un oligonucleótido específico capaz de formar una triple hélice en la región promotora del gen. En cuanto al RNA, es posible impedir el proceso de postranscripción, el transporte del mRNA o la unión de éste con los ribosomas. En general, se suele transferir a las células enfermas un gen antisentido que codifica  un RNA antisentido o una ribozima específica. En el primer caso, se impide la traducción del mRNA a proteína porque se forma un híbrido entre éste y el RNA antisentido, pero cuando se utiliza la ribozima esta molécula puede destruir directamente el transcrito de RNA. La tecnología necesaria para impedir la funcionalidad de la proteína está menos desarrollada, pero se pueden utilizar genes que codifican anticuerpos intracelulares que se unen específicamente al polipéptido.

 

 

 

 Perspectivas:

 

            Los logros alcanzados en el campo de la terapia génica en animales de laboratorio mediante técnicas de transferencia de genes de procedencia exógena hacen presagiar un futuro esperanzador en el caso de las enfermedades genéticas humanas (enzimopatías, anemia falciforme y talasemias sobretodo) si tenemos en cuenta que la complejidad genética de algunos mamíferos como el ratón no es en esencia muy diferente de la humana y que tales errores genéticos pueden ser detectados y subsanados mediante métodos tan fiables como el diagnóstico prenatal.

           

            Las siguientes listas se refieren a los protocolos actuales de terapia génica y a las perspectivas futuras de esta disciplina:

 

 

            - Protocolos de terapia génica:

 

            Transferencia génica a células hematopoyéticas.          

            Transferencia génica a fibroblastos.

            Transferencia génica a células hepáticas.

            Transferencia génica a células del sistema nervioso.

            Transferencia génica a otros tipos celulares.

                        Células endoteliales.

                        Mioblastos.

            Terapia génica de enfermedades adquiridas:

                        Cáncer.

                        SIDA.

 

 

 

 

            -Perspectivas futuras de la terapia génica. Áreas de trabajo:

           

            Regulación de la expresión de determinados genes.

            Técnicas de transferencia génica más eficientes.

            Técnicas de reparación y/o reemplazamiento de genes (en lugar de introducir un gen normal, actuar directamente sobre el gen erróneo).

 

            La terapia génica tiene una perspectiva muy amplia, ya que se puede emplear en enfermedades muy variadas: cardiovasculares, cáncer, desórdenes endocrinos e incluso infecciones víricas. La transferencia de genes tiene una utilidad general que se basa en sustituir la administración de una proteína con carácter terapéutico por la administración del DNA que la codifica. De esta forma se puede conseguir, en teoría, la elaboración in situ de la proteína.

            No obstante, aunque con la tecnología actual parece posible corregir algunos defectos genéticos en animales, su aplicación en humanos no es apropiada por varias razones prácticas. Primera, las técnicas no son lo suficientemente eficientes, solamente del 1 al 5% de los huevos que se inyectan llegan a expresar el gen en los ratones. Segunda, ya que el sitio de integración del DNA exógeno es impredecible, no se pueden reemplazar las secuencias del DNA mutante por las secuencias del gen normal. Por tanto, el gen mutante no se elimina del conjunto de genes y probablemente se segregará independiente del gen exógeno en la siguiente generación. Además, la falta de predicción en la integración hace posible que el DNA exógeno pueda destruir un gen normal creando una nueva mutación.

 

 

 

 

RATONES TRANSGÉNICOS

 

 

 

 

En otro frente, los ratones transgénicos han demostrado que la ingeniería genética se puede aplicar a los organismos superiores. Ya había hablado antes de que la modificación genética de células germinales se aplicaba solamente para obtener individuos transgénicos. Otro de los problemas en la preparación de protocolos para una futura terapia génica es la expresión correcta de los genes en las células específicas en las que se han introducido. Las técnicas de transferencia genética en células en cultivo que permiten el manejo de una gran población de células, se utilizan para el clonaje y mapeo de genes, así como en ciertos estudios de regulación génica. No obstante, aunque se ha logrado introducir genes exógenos en un amplio rango de células a través de distintas técnicas de transferencia genética, en la mayoría de los casos no se ha conseguido una expresión normal de los mismos.

Para el análisis de los factores que determinan la expresión correcta de los genes en diferentes tejidos y a través del desarrollo del organismo, se está desarrollando un nuevo método de transferencia genética en embriones. Los datos hasta el presente son muy escasos, pero este sistema permitirá la creación de modelos animales para enfermedades humanas y la alteración del fenotipo de las especies animales de interés.

Ya hemos definido los animales transgénicos como aquellos que llevan integrado DNA exógeno en varias de sus células, como consecuencia de la introducción experimental del DNA, generalmente previa al nacimiento. Según este criterio, los primeros ratones transgénicos se produjeron por microinyección del DNA del virus SV40 dentro de la cavidad blastocélica de los embriones tempranos. El DNA se integró establemente a través de la línea germinal con una segregación mendeliana.

Otra estrategia utilizada ha sido la transferencia de DNA a células pluripotenciales de teratocarcinoma, seguida de la inyección de las células seleccionadas dentro del blastocito. El inconveniente de los teratocarcinomas está en la dificultad de obtener transmisión a través de las líneas germinales, pues dan lugar a mosaicismo. Alternativamente se pueden introducir los núcleos de estas células en los huevos fertilizados, a los que previamente se les ha quitado el pronúcleo.

Sin embargo la gran mayoría de los ratones transgénicos se originan por inyección del DNA directamente dentro de los pronúcleos de los huevos fertilizados (fig.4).             

 

 

           

 

 

 

 

 

 

 

La eficiencia en la producción de ratones transgénicos puede llegar a ser del 25%. Este porcentaje depende de factores tales como concentración, tamaño y forma del DNA, así como del sitio de inyección (pronúcleo femenino o masculino o citoplasma) y de la composición del tampón. Las condiciones óptimas también dependen de la cepa de ratones elegida.

            Se desconoce el mecanismo de integración del DNA en los cromosomas después de la microinyección. Parece ser que las moléculas lineales se integran más eficientemente que las circulares; generalmente todas lo hacen conjuntamente en el mismo locus cromosómico, formando concatémeros que pueden llegar a tener varios cientos de copias organizadas en tándem de cabeza con cola, posiblemente como consecuencia de una recombinación homóloga entre las moléculas inyectadas.

            Aunque la metodología está todavía en vías de mejora, las técnicas actuales proporcionan una oportunidad para estudiar la regulación y la función de los genes, ya que la mayoría de los genes inyectados se expresan. Sin embargo, el nivel de expresión varía de un ratón transgénico a otro y no siempre se correlaciona con el número de copias del gen.

            Una eficiencia comparable a la que se obtiene por microinyección se consigue mediante la infección de los embriones con los vectores virales antes de la fase de implantación. La microinyección tiene la ventaja de no tener limitaciones en cuanto al tamaño y secuencia del DNA que se introduce. Si el DNA se microinyecta en el estado unicelular y se integra antes de la división, todas las células del tejido embrionario y extraembrionario llevan el DNA exógeno. De este modo los ratones están capacitados para transmitir el DNA exógeno a la mitad de su descendencia. En algunos casos el gen se transmite a menos del 50% de la descendencia e hibridando por la técnica de Southern se ha observado un incremento de la intensidad de las bandas que hibridan con el gen integrado en la progenie con relación a los padres. Esto indica que algunos animales son mosaicos debido a que el fenómeno de integración genómica a veces se retrasa en los embriones.

            Cuando se utilizan retrovirus, generalmente se integra una copia del DNA viral por célula. Sin embargo, una desventaja de los vectores retrovirales es que la infección se inicia generalmente en los estados embrionarios tardíos y como consecuencia se origina un animal mosaico. Una complicación adicional es que más de una célula puede infectarse, generando ratones con diversas integraciones. Si esto ocurre, analizando la descendencia del ratón transgénico, se pueden establecer líneas puras que sean hemizigóticas para un sitio único de integración. No se sabe todavía si los genes clonados en los vectores retrovirales pueden expresarse en los ratones transgénicos y en caso de hacerlo, si el nivel de expresión será uniformes de un ratón a otro. Puede ser una ventaja combinar la propiedad de integración de los vectores retrovirales con la simplicidad de la microinyección o idealmente desarrollar una técnica que sea capaz de integrar el DNA en un sitio predeterminado en el cromosoma.      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Vectores eucarióticos

 

 

 

            Deseamos estudiar la organización y la expresión del genoma eucariótico in vivo, algo que solamente se puede conseguir trabajando directamente con células eucarióticas. También queremos aprender cómo manipular genomas de eucariotas por razones médicas y económicas.

            Por ello hay una serie de plásmidos eucariotas con los cuales podemos manipular directamente los genomas eucarióticos in vivo.

 

- Vectores de la levadura:

 

            La levadura del pan, Saccharomyces cerevisiae, tiene un plásmido natural de unos 2 micrómetros de longitud. Además se han introducido plásmidos bacterianos en la levadura. Estos plásmidos se denominan cromosomas artificiales de levaduras (YAC).

 

 

            - Vectores vegetales:

 

            El sistema de introducción de genes foráneos en plantas mejor estudiado es el sistema natural del tumor de la agalla. La agalla está formada por células de la planta transformadas por un plásmido de la bacteria denominado plásmido inductor de tumores, o plásmido Ti.

 

 

 

 

            - Vectores animales:  

 

            El vector más usado en animales superiores es el ya nombrado anteriormente virus tumoral SV 40, un virus de DNA. El SV 40 es una partícula icosaédrica con un pequeño cromosoma (5224 bp), el cual es una molécula circular de DNA de cadena doble.

            Igual que con los vectores λ, se puede reemplazar parte del DNA de los viriones SV 40 por DNA foráneo. Por lo tanto, los virus se pueden usar en estudios de DNA recombinante de dos maneras. Pueden replicarse y completar su ciclo biológico con la ayuda de virus no recombinantes, o pueden replicarse en el huésped sin producir partículas víricas activas, permaneciendo como plásmidos circulares en el citoplasma o integrándose en el cromosoma del huésped. El SV 40 se ha convertido en una herramienta valiosa en el estudio del genoma de los mamíferos. Por ejemplo, el gen de la β- globina de conejo fue clonado en SV 40 y las secuencias intensificadoras se descubrieron en SV 40. Gran parte de los nuevos conocimientos sobre la oncogénesis se han obtenido a partir del uso de virus tumorales como vectores.

 

 

- Expresión de DNA foráneo en células eucarióticas:

 

            Se puede introducir DNA foráneo en células eucarióticas mediante métodos similares a la transformación bacteriana pero denominados transfección porque  el término transformación en eucariotas ha tomado el significado de crecimiento canceroso. Un organismo eucariótico que tome este DNA foráneo se conoce como trasngénico.

            Las células animales o vegetales en las que se ha eliminado la pared (protoplastos), pueden tomar cromosomas o DNA foráneo directamente del ambiente con una eficiencia muy baja (en presencia de fosfato cálcico). Se puede mejorar mucho la eficiencia mediante la inyección directa del DNA. Por ejemplo, los ratones transgénicos se preparan ahora rutinariamente mediante la inyección  de los oocitos o los embriones de una o dos células. Se obtienen a partir de una hembra de ratón después de un tratamiento hormonal apropiado. Después de la inyección de unos dos picolitros de DNA clonado se reimplantan las células en hembras receptivas.

            La transfección también se puede hacer mediante retrovirus ( virus de RNA que contienen el gen de la transcriptasa inversa), tal y como comentaré en el siguiente punto del trabajo.    

 

 

           

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Vectores retrovirales

 

 

           

            Los retrovirus son virus que contienen RNA monocatenario y la enzima transcriptasa inversa. Al infectar la célula, transcriben el RNA en una molécula de DNA bicatenario que se une al DNA celular. Pertenecen a este grupo el virus del SIDA y los productores de algunos tipos de cáncer.

            Los retrovirus introducen su RNA, copian a DNA de cadena sencilla, luego a DNA de cadena doble y se introduce como provirus en el material genético de la célula.

 

 

 

 

 

- Diseño de un vector retrovírico para su uso en terapia génica:

 

·        Objetivos: i) contener el gen exógeno.

                       ii) ser incapaz de replicarse por sí mismo.

 

·        Procedimiento para cumplir estos objetivos: sustituir los genes estructurales (gag, pol, env) víricos por:

 

-         El gen que se desea introducir y expresar en las células.

-         Un marcador seleccionable.

 

Una vez eliminados estos genes el DNA ya no puede replicarse.

 

 

 

 

- Requerimientos de los vectores retrovíricos en terapia génica:

 

-         Alto título de vectores recombinantes.

-         Ausencia de virus competentes para la replicación.

-         Estabilidad de integración.

-         Eficiente expresión del gen introducido.

 

 

 

 

- Generalidades del uso de vectores retrovíricos:

 

            El virus no se utiliza tal cual, sino que se usa la zona ζ que se empaquete y se use en terapia génica.

            Usamos dos retrovirus a la vez: el retrovirus defectivo para la replicación (que lleva el gen que nos interesa) y el retrovirus auxiliar. El retrovirus defectivo para la replicación no construye cápsidas vacías, se introduce dentro de las cápsidas que fabrica el retrovirus auxiliar. El retrovirus auxiliar tiene una mutación en la secuencia de empaquetamiento (ζ - ), por lo que no puede empaquetarse si infecta una célula, sólo forma cápsidas vacías.

            Las células empaquetadoras tienen en su genoma los genes del retrovirus auxiliar y producen, pues, cápsidas vacías, y si se introduce el plásmido a partir del DNA se obtiene el RNA correspondiente que se empaqueta en las cápsidas proporcionadas por los retrovirus auxiliares. No tienen los genes de la transcriptasa inversa, pueden infectar pero no multiplicarse.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- Empleo de los vectores retrovirales:   

 

La utilización de los vectores derivados de los retrovirus como sistema para transferir genes clonados tiene varias ventajas. Primero, es posible infectar prácticamente el 100% de las células y los genes exógenos y virales integrados se pueden  expresar. En cualquier otro método, después de 48 horas, solamente una célula de cada 10² o 10⁷ expresa establemente el gen exógeno. Segundo, se pueden infectar a la vez tantas células como se desee. Tercero, bajo condiciones apropiadas el gen se puede integrar como copia única en un único sitio al azar, mientras que las técnicas físicas y químicas a menudo dan lugar a la integración de copias múltiples del gen que se transfiere, todas unidas cabeza con cola, dando lugar a repeticiones en tándem. Cuarto, aunque la integración es al azar en el genoma del huésped, el gen integrado tiene una localización precisa con respecto al genoma  viral. Quinto, la infección con vectores retrovirales no daña la célula. Por último, se pueden infectar un rango muy variado de tipos celulares.

Se han transferido por inyección una gran variedad de genes insertados en vectores retrovirales. La mayoría de estos genes han sido marcadores seleccionables, como el gen de la timidina kinasa (TK), el ya mencionado anteriormente gen de la hipoxantina fosforribosiltransferasa (HPRT), el gen que confiere resistencia a la neomicina (neo^r), el gen mutante de la dehidrofolato reductasa que confiere resistencia a la selección con metotrexato (DHFR) y también genes no seleccionables unidos a marcadores seleccionables.

Casi todo el trabajo realizado con vectores retrovirales se ha llevado a cabo con vectores derivados del virus Moloney de la leucemia murina (MoMLV). El virus se compone de un núcleo de RNA- proteína y una cubierta glicoproteica. El RNA de este virus, una vez dentro de la célula actúa como molde para la transcripción en reverso de su información genética, dando lugar a la doble cadena de DNA. Este DNA se integra al azar como copia única, llamada provirus, en una zona del genoma del huésped.

Se sabe que se pueden delecionar casi todas las regiones que codifican para las proteínas virales (gag, pol y env) y reemplazarlas por otro DNA. Una vez delecionados los genes virales, el vector retroviral es defectivo. Para obtener partículas infectivas en una célula que tiene un provirus defectivo, ésta tiene que ser infectada por un virus helper que suministre todas las funciones virales necesarias. Después de infectar la células con un virus helper (como el virus intacto MoMLV), se producen partículas virales infectivas, unas que contienen el vector retroviral y otras correspondientes al propio virus helper. Estas partículas que salen al medio de cultivo se utilizan para infectar las células elegidas.

Este protocolo se ha utilizado para infectar las células de la médula ósea que se han puesto previamente en cultivo. Posteriormente, estas células se inyectan por vía intravenosa en otro ratón que ha sido irradiado letalmente. Después de la reconstitución se analiza si las colonias que han repoblado el bazo contienen y expresan el gen del vector. Por medio de esta técnica se ha logrado transferir el gen de la resistencia a la neomicina (neo^r) a las células progenitoras de un ratón adulto. La utilización de un vector retroviral que contiene un gen seleccionable tiene la ventaja de poder enriquecer las células infectadas antes de ser inyectadas de nuevo en el animal. Con este mismo protocolo, en experimentos posteriores, se han analizado los sitios de integración cromosómica del vector retroviral en el DNA de células de la médula ósea, del timo y del bazo de los animales reconstituidos. La integración de los vectores retrovirales en un sitio único común para los tres órganos, permitió identificar inequívocamente que las células de estos tejidos provenían de una sola célula progenitora. Esto demuestra la posibilidad de insertar genes eficientemente dentro de células pluripotenciales del sistema hematopoyético. Este es uno de los requisitos necesarios antes de la utilización de los vectores retrovirales con propósitos terapéuticos en humanos.

Como mejora a este procedimiento se ha puesto a punto una técnica que evita la infección de las células de la médula ósea con el virus helper, cuya propagación dentro del animal podría originar complicaciones posteriores. Los retrovirus tienen unas secuencias reguladoras denominadas psi, que dirigen el empaquetamiento del RNA dentro de la partícula viral. Mediante la deleción de estas secuencias se construyó un virus helper que es capaz de producir todas las proteínas virales pero no de empaquetar su propio RNA. Así, se estableció una línea celular de NIH 3T3 con el DNA del helper integrado permanentemente. Esta línea celular (psi 2) proporciona en trans las proteínas retrovirales necesarias para el empaquetamiento del vector. La transfección en esta línea celular con el DNA del vector retroviral da lugar después de 48 horas a un sobrenadante que contiene solamente los retrovirus recombinantes defectivos en replicación.

Empleando estas células psi 2 se obtuvieron retrovirus con el gen neo y dhfr y posteriormente con estos virus se infectaron células de la médula ósea de ratón (figura 3):

 

 

 

 

Para aumentar la eficiencia de infección, se co-cultivaron las células productoras de virus con las células de la médula ósea durante seis días, bajo condiciones de cultivo especiales. Diez días después de la infección de médula ósea, en ratones irradiados letalmente, se analizaron las colonias del bazo para ver la integración de los genes dhfr y neo. Cada colonia individual del bazo, que surge de una sola célula progenitora, se utilizó para repoblar otros ratones irradiados letalmente. Cuando se analizó el DNA del bazo de estos últimos ratones se vio que los dos genes tenían un patrón de integración igual al que mostraban en la colonia del bazo de que derivaban.

Por otro lado, se ha desarrollado otro sistema similar de vectores retrovirales, también libre de helper, denominado pSAM. En el virus helper se ha sustituido el gen env del MoMLV, que codifica para la proteína de la envuelta, por un gen env anfotrópico para que de esta forma las partículas virales lleven una proteína de cubierta que les permita infectar un amplio rango de tipos celulares. Este mismo laboratorio ha construido un vector retroviral anfotrópico que contiene el gen mutante de la dehidrofolato reductasa. La utilización de este vector tiene varias ventajas. Primera, con este vector se puede aumentar el número de copias del gen dhfr al emplear concentraciones cada vez más altas de metotrexato. Así, aumentando las concentraciones de esta droga se puede aumentar el título de los virus que tienen integrado el gen dhfr. Como segunda ventaja, es posible seleccionar directamente las células infectadas, en el animal entero, suministrando metotrexato en la dieta.

En los experimentos realizados hasta ahora con vectores retrovirales que contienen dos genes dentro del mismo vector, hay resultados contradictorios. En muchos de los trabajos publicados se ha visto que a veces las células infectadas con el vector tienen alterado el DNA del provirus. El principal problema parece ser que los retrovirus tienen una propensión bastante fuerte a la deleción de secuencias durante la replicación del virus. Así, al utilizar los vectores con los genes dhfr y neo para la infección de las células de la médula ósea, se vio que ambos genes aparentemente estaban presentes en las colonias del bazo. Sin embargo, en los ratones sólo se ha encontrado expresión para el gen de la resistencia a la neominina, pues parece que durante la producción de las partículas virales se pierde una porción del gen dhfr. Por otro lado, también se ha visto que cuando hay dos genes integrados, el gen situado más hacia el extremo 3´ es generalmente suprimido cuando hay una selección para la expresión del gen que se encuentra en el extremo 5´,y viceversa.

Sin embargo, otros grupos han realizado experimentos donde se observa la expresión de los dos genes. En uno de ellos se utilizó dentro del mismo vector retroviral el DNA complementario del gen que codifica para la enzima adenosina deaminasa humana (ADA) y el gen de resistencia al antibiótico G418 (neo^r). Tanto las células seleccionadas como las que no, expresan el gen de adenosina deaminasa a un nivel del 25-50 % con respecto al de la enzima endógena. También se ha transmitido establemente un minigén de la hormona de crecimiento con su promotor natural utilizando como vehículo un vector retroviral que tiene el gen de la HPRT como marcador seleccionable. Al infectar distintos tipos celulares con el vector retroviral, la producción de la hormona de crecimiento y su inducibilidad en distintos clones fue altamente variable. Estas variaciones en la expresión pueden ser debidas a un efecto posicional en el cromosoma, según el lugar de integración del gen, un que ya se había observado anteriormente en otros casos. A pesar de este problema, parece posible propagar genes eucarióticos de una forma estable y regulada adecuadamente a través de vectores retrovirales seleccionables.

A pesar de las evidencias descritas, la introducción de genes por medio de vectores retrovirales con fines terapéuticos, requerirá aún bastante trabajo. Un sistema ideal no sólo debería introducir un gen de forma estable, sino que además debería hacerlo de una forma específica de tejido. Cuando el desorden genético es en el sistema hematopoyético, se pueden tratar de aislar las células de la médula ósea, pero ningún otro tejido, con excepción de la piel, puede extraerse, tratarse y  reemplazarse de nuevo. Como existen virus que infectan tejidos específicos únicamente, se podría utilizar una partícula retroviral con una cubierta glicoproteica que fuera reconocida solamente por los receptores de un tipo celular. Pero el sistema óptimo no sólo debería introducir el gen específicamente en un tipo de células, sino que también debería dirigir la integración del vector a un determinado sitio cromosómico. Existe la dificultad adicional de que es probable que para obtener un efecto sostenido se necesite integración y ésta requiere la replicación del DNA y por tanto sólo sería posible en tejidos que estén proliferando; de aquí la restricción a piel y células de origen hematopoyético. Hasta el presente, se sabe que en organismos inferiores la inserción de un gen por recombinación homóloga es algo relativamente común, pero no así en mamíferos, donde este fenómeno está poco explorado.

 

 

 

 

- ¿Son seguros estos protocolos?

 

Consideraciones respecto al uso de vectores retrovíricos:

 

1.- Riesgo de mutagénesis insercional: hacemos una infección y puede entrar por la parte equivocada de la célula.

2.- Posibilidad de recombinación con secuencias retrovíricas endógenas.

3.- Posibilidad de transferencia de material genético exógeno.

4.- Producción de virus competentes para la replicación.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La enfermedad de Gaucher

 

 

 

      ¿ Cual es la Historia de la Enfermedad de Gaucher ?

La enfermedad de Gaucher es llamada después, de la descripción por primera vez

del  médico francés Philippe Charles Ernest Gaucher en 1882 en una persona de 32

años cuyo higado y bazo estaban agrandados. En 1924 el médico alemán

H. Lieb aisló un componente graso particular del bazo de personas con enfermedad

de Gaucher. Diez años más tarde, un médico francés A. Aghion identificó este

compuesto como un glucocerebrósido, que es un componente de la membrana celular

de los glóbulos rojos y blancos de la sangre. En 1965, el médico norteamericano

Roscoe O. Brady y sus colaboradoros demostraron que la acumulación del

glucocerebrósido resulta de la deficiencia de la enzima glucocereboxidasa. Las

investigaciones del Dr. Brady fueron la base para el desarrollo de la terapia

enzimática de reemplazo, usando glucocerebroxidasa para reemplazar la enzima

perdida en los pacientes.

Enfermedad de Gaucher: El desorden por almanacenamiento lisosomal más comun

¿ Cual es la base de la enfermedad de Gaucher?

El cuerpo humano contiene células especializadas, llamadas macrófagos, que

remueven las células agotadas degradádolas a moléculas simples para su

reciclado. Los macrófagos  “comen” las células degastadas y las degradan dentro

de compartimientos celulares llamados lisosomas que sirven como tubo digestivo 

de Ios macrófagos. La enzima glucorerobroxidas esta localizada dentro de los

lisosomas y es responsable de la separación del glucocerebrósido en glucosa y un

lipido llamadó ceramida.

Las personas con Gaucher carecen  de la forma normal de la enzima

glucocerebroxidasa y son incapaces de desintegrar el glucocerebrósido. Por lo

tanto el glucocerebrósido permanece almacenado dentro de los lisosomas,

impidiendo el funcionamiento normal de los macrófagos. Los macrófagos agrandados

contieniendo glucocerebrósido no digerido se denominan células de Gaucher. Estas

células son el distintivo de la enfermedad. La enfermedad de Gaucher es el más

común de los 10 desordenes de llamados de “almacenamiento”. El más ampliamente

concido de estos desorddenes es la enfermedad deTay-Sachs.

¿ Que ocurre cuando las células Gaucher se acumulan ?

Las células Gaucher se acumulan con mayor frecuencia en el bazo, el higado y la

médula osea. Sin embargo, ellas también pueden reunirse en otras tejidos,

incluyendo el sistema linfático, pulmones, piel, ojos, riñones, corazón y en

raras occasiones en el sistema nervioso. Frecuentemente el órgano que contiene

las células Gaucher se agranda y no funciona normalmente provocando los síntomas

clínicos asociados a la enfermedad. El tipo y la severidad de los síntomas

varian ampliamente entre los pacientes. Algunas condiciones que amenazan la

vida.

Células de Gaucher en el bazo

Un lugar común de acumulación de células Gaucher es el bazo. En forme tipica, la

acumulación de células Gaucher en este órgano provoca que se agrande y aumente

sua actividad. El agrandamiento causa la distensión del abdomen de tal

embarazada. Normalmente el bazo destruye las viejas células sanguíneas al mismo

ritmo que se producen las nuevas en la médula osea. Cuando el bazo se torna

hiperactivo. tiende a destruir los glóbulos rojus más rapidamente que lo que

pueden qenerarse y se produce un deficiencia, o sea anemia. Los glóbulos rojos

transportán oxígeno de los pulmones a todas las células del cuerpo. Por carecer

de suficientes glóbulos rojos los pacientes anémicos sufren los efectos de una

oxigenación insficiente. Como resultado, Ios músculos no pueden producir la

energia necesaria y tienden a fatigarse.

La hiperactividad del bazo puede tambíen causar deficiencia de los glóbulos

blancos, lo cual reduce la capacidad  del cuerpo de luchar contra las

infecciones bacterianas. O puede reducir el número de plaquetas que disminuye la

capacidad de formar coágulos, aumenta la tendencia a sangrados y hematomas. Como

resultado son frecuentes y profusos los sangrados nasales comunes en los

pacientes con Gaucher.

Células de Gaucher en el higado

El higado es otro lugar frecuente para la acumulación de células Gaucher. Se

agranda y funciona anormalmente. En  algunos individuos se agranda tanto como el

bazo. En pacientes cuyo bazo a sido extirpado, el higado puede aqrandarse

muchisimo dado el desplazamiento de la acumulación de células Gaucher  del bazo

al higado. Los efectos de la funcion hepática anormal son generalmente minimos,

aunque algunas pocas  personas pueden desarrollar cirrosis. En la cirrosis el

higado se transforma en un tejido cicatrizal.

Células de Gaucher en  la médula osea

El otrotc lugar donde frecuentemente se reunen células de Gaucher es en la

médula de los huesos del esqueleto. Las células de Gaucher acumuladas reducen la

función normal de la médula osea en las zonas donde están más concentradas. Esto

provoca la variedad de problemas oseos que comunmente son encontrados en Ias 

personas con Gaucher. Por ejemplo, las células Gaucher pueden inteferir en la

producción de células de la sangre en la médula osea, combinándose con la

deficiencia que causa el hiperactivo y agrandado bazo.

Los huesos afectados por Gaucher pueden ser más propensos a la infección. Pueden

ser más delgados o débiles que lo normal y pueden deformarse. Además pueden

ocurir crisis oseas cuando hay una súbita falta de oxigeno en un area donde las

células de Gaucher interfieren en la circulación  normal de sangre. Estos

episodios pueden ser extremadamente dolorosos, se siente semejante a un ataque

cardíaco de los huesos. La restricción en la circulación de sangre puede también

resultar en la destrucción del tejido sangre puede también resultar en la

destrucción del tejido osea (llamada necrosis aséptica) y provocar problemas

permanentes de la movilidad.

Además, los huesos pueden debilitarse y estar propensos a fracturas espontaneas.

Si esas fracturas ocurren en la columna vertebral, llamadas fracturas por

compresión, pueden causar daño a los nervios. Los individuos con Gaucher amenudo

se quejan de dolores generales  oseos y articulares. Este dolor es probablemente

debido a la inflamacíon en el sistema esquelético causada por la presencia de la

de células Gaucher.

¿ Hay individuo tipico Gaucher ?

Aunque todas las personas con Gaucher tienen deficiencia en actividad de la

glucocerebroxidasa, hay veriaciones de persona a persona. Como resultado el

momento de comienzo y la severidad de los síntomas varían ampliamente. Hasta

ahora,  Ios especialistas en Gaucher dividen a la enfermedad en 3

clasificaciones:

Tipo 1,  Tipo 2  y  Tipo 3  basándose en los síntomas particulares y eI curso de

la enfermedad. En general cuanto más tarde en la vida aparezcan los primeros

síntomas, es menos probable que la enfermedad llegue a ser severa.

¿ Que es el Tipo  1 ?

El Gaucher tipo 1 es la forma más común, referida engañosamente como Gaucher del

adulto. Personas de cualquier edad pueden ser afectadas.  El gen defectuoso se

encuentra en menos de cda 40 mil personas en la población general. Es más comun

entre los Ashkenazi.  Como este tipo no afecta el sistema nervioso, algunas

veces lo refieren como el Gaucher no neuropático.

El Gauicher tipo 1 tienne una varinción partticularmrnte amplia en los signos

clínicos, síntomas y el curso de la enfermedad. Mucha gente con Gaucher tipo 1

no tiene síntomas clínicos y lleva una vida normal. En algunos casos, sin

embargo puede poner en riesgo la vida. En general, cuanto más tardía la 

aparición de los síntomas es menos probable que la enfermedad sea severa.

Tal vez el signo más frecuente del Gaucher tipo 1 es el agrandamiento del bazo

y/o el higado. La hiperactividad del bazo agrandado provoca una tendencia

aumentada al sangrado por disminución de las plaquetas  o fatiga relacionada con

la anemia. El agrandamiento del bazo es el hallazgo inicial más frequente y

puede encontrarse hasta en niños de 6 meses. El bazo puede agrandarse lo

suficamente para afectar la movilidad del niño y llamar la attención . Un niño

con enfermedad severa puede ser de baja estatura respecto del promedio y puede

adoptar una postura lordotica para suportar  el peso del abdomen agrandado.

Los síntomas esqueléticos del compromiso oseo pueden occurrir en cualquier

momento de la vida: en niños tan jovenes comio 2 años de edad o en adultos tan

viejos como 70. En más de la mitad de las personas con Gaucher tipo 1, las

radiografías revelan una deformida característica denominada deformidad en

frasco de Erlenmeyer en los huseos del muslo. Los huseos del se ensanchen en la

rodilla en vez de tener un contorno redondeado normal.

 

¿ Que es el Gaucher Tipo 2 ?

El gaucher tipo 2 es muy raro, es una forma rapidamente progresiva de la

enfermedad que afecta el cerebro tanto como los órganos afectados en el tipo 1

del Gaucher. Antiguamente denominada Gaucher infantil, el tipo 2 se caracteriza

por un severo compromiso neuroiógico en el primer año de vida. También se

denomina Gaucher neurorpático agudo. Esta forma de Gaucher no aparece con más

frecuencia en ningún qrupo étnico.

Los niños con Gaucher tipo 2 aparentan tipicamente normales durante los primeros

poco meses de vida, hasta desarrollar síntomas neurológicos y muchos de los

síntomas asociados al tipo 1. El niño afectado habitualmente no supera los 2

años debido al sevoro compromiso del sistema nervioso.

¿ Que es el Gaucher Tipo 3 ?

Antaño denominada Gaucher juvenil, el tipo 3 se caracteriza por un compromiso

neurológico lentamente progresivo. El Gaucher tipo 3 es también muy raro. Asi

como el tipo 2 no aparece con preferencia en ningún grupo étnico, aunque un

número de casos se han reportado en Escandnavia particularmente en Suecia y

tambien en España y Japón.

Los signos y síntomas del Gaucher tipo 3 aparercen en la infancia temprana.

Salvo por el compromiso del sistema nervioso, los síntomas del Gaucher tipo 3

recuerdan al tipo 1. Los individuos con tipo 3 que llegan a la adolescecia

pueden sobrevivir hata la tercera o cuarta década.

¿ Como se contrae la enfermedad de Gaucher ?

La enfemedad de Gaucher es hereditaria

Mucho de la constitución de una persona es el resultado de lo heredado de cada

uno de sus padres. Ciertas características, tales como el color de ojos,

estatura, y enfermedades genéticas pasan de padres a hijos. Los genes para estas

características estan retinidos en 23 pares de cromosomas. Los genes contienen

los calcos que las células del cuerpo usan para producir proteínas, los

ladrillos de la vida. Cada cromosoma contiene miles de genes. Un individuo

normalmente hereda una copia de cada gen de cada progenitor.

Los genes de la glucocerebroxidasa también se pasan de padres a hijos. En el

Gaucher, el calco, la copia de la enzima glucocerebroxidasa (un tipo de

proteína) es defectuoso. Como resultado, la glucocerebroxidasa producida desde

genes defectuosos es incapaz de cumplir una función normal.

¿ Es el riesgo de heredar Gaucher lo mismo para mujeres y varones ?

Las copias del gen para la glucocerebroxidasa  son transportados en un cromosoma

que no esta involucrado en la determinación del sexo del individuo. Como

resultado, el gen de la glucocerebroxidasa defectuoso puede pasar tanto  a

mujeres como  a varones. Un par de cromosoma, llamados cromosomas sexuales,

difiereb entre hombros y mujeres de tal forma que determinan su identidad

sexual. Los otros 22 pares de cromosomas se denominan autosómicos. El gen de la

enzima glucocerebroxidasa es una de los pares de  cromosomas autosómicos. El

Gaucher es referido como un transtorno autosómico recesivo. Recesivo explica el

hecho que para desarrollar la enfermedad, un individuo debe heredar dos copias

defectuosas del gen, una de cada progenitor

¿ Quienes son portadores de Gaucher ?

Una persona con un gen normal y uno defectuoso para la glucocerebroxidasa es un

portador de la enfermedad de Gaucher. Estas personas no desarrollan la

enfermedad porque mientras que uno de los dos genes para la glucocerebroxidasa

sea normal, suficiente cantidad de glucocerebroxidasa puede producxirse para

prevernir la acumulación de glucocerebrósido. Aungue el portador de Gaucher no

tendrá síntomas de la enfermedad, las probabilidades son 50:50 que el gen

Gaucher se trasmitirá a cada uno de sus hijos o hijas. Un niño solo puede

desarrollar la enfermedad de Gaucher si hereda un gen defectuoso de cada uno de

ambos padres.

¿ Cual is la probabilidad de tener niños con Gaucher o portadores ?

Si ambos padres tienen genes  normales para la glucocerebroxidasa, cada niño

heredará dos  genes normales, uno de cada progenitor y nunca tendrá Gaucher ni 

será portador.

Si un padre es portador de la enfermedad y el otro no, hay una chance de 50:50

de tener un niño que herede el gen Gaucher de su padre portador y sea a su vez

portador de la enfermedad. Ninguno de los hijos de esta pareja tendrá la

enfermedad porgitendran un gen normal heredado del otro  progenitor.

Si ambos padres son portadores  de Gaucher, con cada embarazo hay un 25% de

chance de tener un niño que herede un gen Gaucher de cada uno de su padres y

desarolle la enfermedad de Gaucher. Hay un 50% de chance de tener un hijo que

herede un gen Gaucher de uno de los progenitores y un gen normal del otro, será

por lo tanto portador. Finalmente hay un 25% de chance por cada embarzo de tener

un niño que herede 2 genes normales, uno de cada progenitor y nunca  tendra

enfermedad ni será portador.

Debe señalarse que la probabilidad por cada embarazo de heredar la enfermedad de

Gaucher es totalmente independiente de lo ocurrido en el embarazo anterior.

Tener un hijo con enfermedad de Gauclier no significa que los próximos 3 no

heredaran la enfermedad.

Si uno de los padres tiene  enfermedad de Gaucher y el otro no, ni es portador,

todas los hijos heredarán el gen Gaucher del padre enfermo y seran portadores.

Ninguno desarrollará la enfermedad en si mismo.

Si un padre tiene enfermedad de Gaucher y el otro es portador, hay una chance de

50:50 de tener un hijo que herede un gen Gaucher de cada padre y tenga la

enfermedad. Hay también una chance 50:50  dle heredar un gen Gaucher solo de un

proqenitor y se transforme en portator.

Si ambos padres tienen enfermedad de Gaucher, todas sus hijos heredarán dos

genes Gaucher y tendán la enfermedad también.

¿ Quien deberia ser estuduado por estado de portador de Gaucher ?

Dado que el Gaucher es una enfermedad genética, todos los parientes cosanguíneos

de los pacientes tienen riesgo de tener la enfermedad, o son potenciales

portadores del gen Gaucher. Las familias con antecedentes de Gaucher debería

discuitir la posibilidad de test genéticos con sus médicos. Para el rastreo

diagnóstico se toma una muestra de sangre para medir la actividad de la

glucocerebroxidasa. El nivel de actividad encontrado determina si la persona

tiene Gaucher o es portador. Para detectar portadores,  los test sanguíneos no

son siempre seguros debido a la vairiaeción de los niveles deb enzima. Muestras

de vellosidades coriales y aminiocentesis pueden usarse para el diagnóstico

precoz de Gaucher en el embarazo. La consulta genética esta disponible para

parejas que son portadores o han tenido antecentes familiares de Gaucher.

¿ Como se diagnostica la enfermedad ?

El proceso del diagnóstico de muchas enfermedades,  y especialmente el Gaucher,

no es siempre directo. A menudo el paciente consulte inicialmente por otro

problema tal como gripe, dolores inespecíficos, o un examen de rutina. Aunque

hacer un diagnóstico de Gaucher no es dificil, algunos síntomas pueden semejar

otras enfermedades. El médico puede realizar primero otros test para eliminar

los desordenes más comunes. Por ejemplo, en los casos cuando los pacientes tiene

bajos recuentos de plaquetas, los médicos descartan primero leucemia. Si un

paciente se queja de dolor articular, sospecharían artritis. Algunas veces, un

médico especialista, como un genetista o un hematólogo, puede ayudar a

distinguir los síntomas de Gaucher de otras enfermedades con síntomas

semejantes.

La enfermedad de Gaucher puede ser sospechada en una persona con un

agrandamiento inexplicable del bazo, o tendecia a sangrar, o dolores oseas o

articulares, o fracturas espontaneas. Un pediatra podría hacer el diagnóstico en

un niño que se queja de disconfort abdominal o frequentes epistaxis. Un

hematólogo en una persona con recuentos globulares o de plaquetas bajos. Un

ortopedista, en el curso del tratamiento de alquien que sufre fracturas

frecuentes e inexplicables. Gaucher deberla ser particularmente sospechado en

personas con parientes cosanguineos que tienen la enfermedad. Debe notificarse a

los médicos si hay antecédentes de enfermedad genética familiar. Hay indicadores

del Gaucher que no son registrados por el paciente, pero aparecen en los

analisis del laboratorio incluidos niveles elevados de fosfatasa ácida y/o

enzima convertidora de angiotensina en suero, y caracteristicas esqueléticas que

revela el examen radiológico.

Cuando hay una firme sospecha de Gaucher, el diagnóstico se realiza con un test

en sangre que demuestra una disminución en el nivel de actividad de

glucocerebroxidasa en los glóbulos blancos. Si hay dudas acerca del diagnóstico

el médico puede querer obtener una muestra de médula osea o de piel, para buscar

células Gaucher. Ciertas células de piel  llamadan fibroblastos pueden crecer en

cultivos y luego usarse para medir el nivel de actividad de la

glucocerebroxidasa.

 

 

Origen: Genzyme Corporation, 1992. Modificado julio de 1999

Traducido por: Fabion Alvares, Argentina.

 

 

 

 

 

 

La terapéutica genica para la enfermedad de Gaucher

 

Al presentar al Profesor John Barranger de la Universidad de Pittsburgh, en Pennsylvania, USA, Jeremy Manuel dijo en la segunda conferencia de la asociación Guacher: "Una cura puede estar a la vista. John Barranger ha dedicado la mayor parte de su carrera investigando sobre enfermedades lysosomal y fue instrumental en el desarrollo de la terapéutica de reemplazo de la enzima. El dió la primera infusión al primer paciente con lo que ahora conocemos como Ceredase. "El cuadro de abajo muestra al Profesor Barranger explicando uno de los aspectos principales de la terapéutica genética para la enfermedad de Gaucher.

El Profesor Barranger explicó que la enfermedad de Gaucher es una de 17 condiciones médicas similares causadas por la deficiencia de una enzima, que pueden ser potencialmente curadas con la terapéutica genética. Los trasplantes de médula han tenido éxito en algunos de estos trastornos, incluyendo Gaucher, y ahora la enfermedad de Gaucher es el prototipo para el desarrollo del tratamiento de la terapéutica genética en todo el grupo de alteraciones.

El explicó que la terapia de reemplazo de la enzima (Ceredase) indica que el producto del gen puede funcionar. "La corrección parcial de la deficiencia de la enzima a traves de la terapia genética puede ser terapéutico." Dijo. La viabilidad del tratamiento ha sido probada en ratones y la conclusión es que el trasplante de gen funciona durante el resto de la vida del ratón. Las pruebas de laboratorio con células humanas también han tenido éxito.

Los planes para los ensayos clínicos

Los ensayos clínicos planeados involucran a los pacientes que recibiran la medicina (G-CSF) para estimular el número de células CD34 (células de la médula) que circulan en su sangre. Después de 10 días se colectaran células blancas de la sangre del paciente por leukophoresis (una máquina recoge estas células y devuelve el resto de la sangre al cuerpo). Las células blancas recolectadas pasaran varios procesos en el laboratorio para producir una solución rica en células de CD34 y particularmente en stem cells. Entonces sera añadido un retroviral vector corregido genéticamente. Las células seran examinadas por contaminantes y también para ver que el gen esta trabajando para producir la enzima.

Este trabajo de laboratorio durará como un mes, después del cual las células genéticamente corregidas son trasplantadas de nuevo en el paciente. Si no hay suficiente actividad enzimatica después de tres meses, esto sera repetido hasta cuatro veces al año. La esperanza es que suficientes células de la médula incorporadas por la deficiencia de la enzima para ser corregida.

El primer ensayo clínico empezará pronto. Se espera que sólo con una incorporación de un 1% de las células de la médula alteradas genéticamente, esto pueda llevar a una mejora significante de la enzima disponible en el cuerpo. (Se estima que los pacientes de Gaucher tipo 1 sólo tienen una deficiencia de la enzima del 5% al 15%).

La monitorización

Los pacientes participantes en el ensayo seran monitorizados cada mes con análisis de sangre y una biopsia de la médula después de un año, para examinar hasta que punto las células alteradas genéticamente se han establecido en el cuerpo y dan por resultado una mejora clínica.

Comentando sobre seguridad, él dijo que en los ratones no habían aparecido efectos secundarios. En la primera prueba no se destruirá el resto de la médula. El retroviral vector no se puede reproducir el mismo. "Ninguno de los 150 pacientes del mundo entero que han recibido trasplante de gen han sufrido efectos mutagénicos ( cancerosos)", dijo.

Es posible que un futuro ensayo de esta terapéutica del gen se lleve en el Reino Unido.

Las patentes

Le preguntaron al Prof Barranger si la terapia del gen para la enfermedad de Gaucher iba a ser patentada. El contestó que el gen fue clonado en 1983 y que no estaba sujeto a una patente. Sin embargo el vector, que transfiere el gen al cuerpo, puede ser patentado.

 

 

Origen: Gauchers News de febrero de 1995

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1995, 1997

 

 

 

 

 

La segunda conferencia de la asociación Gaucher - nuevos desarrollos

 

La Segunda Conferencia de la asociación Gaucher en Nuevos Desarrollos en el Tratamiento de la Enfermedad de Gaucher, tuvo lugar en el Hotel Clive de Londres el 20 de Noviembre de 1994 con una audiencia de 130 personas.

El día comenzó con la reunión annual general de la Asociación (un informe sera enviado pronto a los miembros); al mismo tiempo en otra habitación había una reunión para doctores, que les facilitó a los expertos médicos intercambiar información y puntos de vista de una manera informal y confidencial entre ellos y los oradores médicos de la Conferencia. El Profesor Timothy Cox dirigió la reunión.

En la apertura de la Conferencia, el Presidente Jeremy Manuel dió la bienvenida a los delegados. Dijo: " Tenemos reservado un día lleno de información". " El crecimiento de la Asociación ha sido casi milagroso. Hace tres años sabiamos sólo de ocho personas con la enfermedad de Gaucher, ahora conocemos a 160 de los cuales 63 estan recibiendo Ceredase."

El Prof Cox Informa del Progreso, Experiencia e Investigación en el Reino Unido

El Professor Timothy Cox, el cual trata a 60 pacientes con Gaucher en el Hospital Addenbrooke en Cambridge, Explicó la historia y trayectoria de la deficiencia de la enzima que afecta a los pacientes con Gaucher: " Fue Philippe Gaucher, un doctor Frances, el primero en identificar el agrandamiento del bazo lo cual es un signo de la enfermedad. Pero estaba equivocado. Pensó que era causado por algo maligno. " Fue tan solo hacia el 1960 que se descubrió que la causa era la falta de la enzima glucocerebrosidase.

El Prof Cox explicó que la clave de la enfermedad estaba en los macrophages (células en el higado, bazo, médula y en todas partes) que pasan toda su vida comiendo las células gastadas. En los macrophages hay lysosomes, " sacos suicidas que contienen muchos enzimas" que son responsables de disolver las células viejas. En el caso de la enfermedad de Gaucher, la enzima glucocerebrosidase no trabaja apropiadamente y se acumula un tejido graso, glucocerebroside, se mantiene en los macrophages en vez de ser disuelto y pasado por el sistema.

Los macrophages se vuelven grandes en los órganos y la médula y son estas células las que contribuyen a los síntomas de engrandamiento del bazo e higado. En los huesos, se corta el suministro de la sangre, dando por resultado crisis muy dolorosas y fracturas espontáneas en los huesos.

"Pero los genes no lo son todo", dijo el Prof Cox. Mencionó a dos gemelos, uno de ellos tenía síntomas de Gaucher y le tenian que extirpar el bazo. El otro gemelo no tenía ningún síntoma. Otra cosa debía de haber contribuido al desarrollo de los síntomas.

Tratamiento Exitoso

Siguió describiendo el éxito del tratamiento con Ceredase en algunos de sus pacientes. El primer paciente adulto tratado en el Reino Unido había sufrido de fallo en la médula y estaba recibiendo transfusiones de sangre regulares. El paciente sufria también de dolor en los tobillos lo cual le había hecho dejar de trabajar.

En tratamiento con Ceredase con una dosis muy baja dos veces por semana, el paciente tuvo una recuperación dramática. Después de unos meses, una Resonancia mostró una recuperación casi completa de los tobillos. El paciente recibe una dosis aún más baja y ahora después de 3 años permanece en buenas condiciones. Sus Resonancias son perfectamente normales.

El estudio importante

El Prof Cox describió el estudio llevado a cabo por su colega el Dr Pram Mistry en la Universidad de Cambridge acerca de donde va en el cuerpo el Ceredase y cuanto tiempo permanece allí. " Me gustaría también reconocer a los miembros de la Asociación que tuvieron parte en este trabajo."

Dijo que era importante la historia en el desarrollo de la terapia de reemplazo de la enzima. Las infusiones iniciales de la enzima glucocerebrosidase fueron infructuosas porque llego a las partes del cuerpo equivocadas. Sólo después de que la enzima fue modificada y apuntada hacia los receptores de mannose ( los cuales estan ligados a los macrophages), que la enzima, conocida como Ceredase, fue efectiva. Sin embargo la enzima encuentra obstáculos en su camino y pueden haber receptores aparte de los mannose que absorvan la enzima.

Por investigaciones previas se sabe que el Ceredase tiene una vida media de sólo unos minutos en la sangre de los pacientes, pero lo que no se sabia era donde y como iba desde allí. ( la vida madia es el tiempo que lleva a la mitad de la sustancia en desaparecer). Otras células además de los macrophages pueden tomar Ceredase.

En un período de pruebas para descubrir adonde iba la enzima, tomaron parte 9 pacientes. Todos ellos tenían Gaucher Tipo 1. Además tomó parte una persona sana.

Se engancho una cantidad muy pequeña de yodo radiactivo efímero a una pequeña cantidad de enzima, para poder seguir su trayectoria en el cuerpo con un escáner. Se utilizaron ambos Ceredase y Cerezyme. El experimento fue aprobado por la Administración del Comité Asesor para Substancias Radiactivas del Departamento para la Salud, Reino Unido.

La absorción rápida en el higado y bazo

El Professor Cox mostró unas diapositivas extraordinarias que enseñaban la enzima inyectada llendo directamente a las áreas requeridas - el higado y el bazo, y en algunos pacientes con problemas de huesos, a los sitios que se sabía que habian causado problemas o que todavía los causaban.

Los escáners mostraron una absorción rápida del higado y un poco más lenta del bazo, aunque en un paciente más severamente afectado, la absorción del bazo fue más grande que la del higado.

En un paciente, después de 5 minutos de infusión el escaner mostró una desaparición rápida de la sangre, pero con una absorción muy marcada por el higado. A los 10 minutos la cantidad máxima estaba en el higado pero el bazo absorvió la enzima mucho más despacio. Los escaners se hicieron en los pacientes en un periodo de 48 horas para estimar la vida media de la enzima en los diferentes órganos.

Fue visible también la absorción en la médula. No hubo diferencia en la absorción de la médula entre los pacientes con o sin bazo.

El Professor Cox comentó el hecho de que la enzima fue a los huesos del pie de un paciente que había tenido previamente ahí problemas graves. De acuerdo con una Resonancia los pies habian vuelto a la normalidad después del tratamiento con Ceredase, aunque el paciente todavía se quejaba de vez en cuando de dolor.

El Dr Pram Mistry presentó previamente un trabajo sobre esta investigación en la Reunión de Trieste del Grupo Europeo de Trabajadores en la Enfermedad de Gaucher. Concluyó que la enzima llegaba eficientemente a los lugares afectados por la enfermedad, y que una proporción considerable de la enzima tenía una vida media de 1-2 días en el higado y bazo. Enfatizó que había necesidad de encontrar un nivel de saturación óptimo para cada paciente.

 

 

Origen: Noticias de Gaucher de Febrero de 1995

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1995, 1997

 

 

 

Lo último en la terapia génica - un paciente empieza el tratamiento

 

 

El Dr John Barranger habló sobre su investigación acerca de la terapia del gen en la conferencia de la asociación en noviembre de 1994. Aquí estan las últimas noticias:

Una mujer de 48 años de edad fue el primer paciente que empezó la terapia génica en octubre de 1995 en la Universidad de Pittsburgh Medical Centre, USA. Van a ser estudiados cinco pacientes durante el primer año del protocolo y dos más que seran trasplantados a principios de 1996.

"Estamos en el principio de poder desarrollar una solución permanente asociada a la enfermedad de gaucher," dijo el Dr John Barranger, jefe del equipo de investigación y profesor de pediatria, genética humana, genética molecular y bioquímica en la Universidad de Pittsburgh.

El comienzo de la terapia

En el comienzo de la terapia, los pacientes reciven granulocyte-macrophage colony stimulating factor, o GM-CSF. Esta substancia aumenta la producción en el paciente de células blancas especializadas (haematopoeitic stem cells) las cuales son células primitivas que tienen la habilidad única de reconstituir toda la médula del hueso. Entonces las stem cells son extraidas de la sangre con un procedimiento llamado leukapheresis y expuesto a un retrovirus que lleva el gen correctivo para la deficiencia del glucocerebrosidase. Las células que llevan (transmitir) este gen son recolectadas y se le devuelven al paciente con una infusión. Las células vuelven a la médula por un proceso natural.

"Estamos estudiando cómo estas células competiran con la médula ya existente, donde continuaran dividiendo y produciendo el glucocerebrosidase. Este estudio va a proporcionar una información muy importante lo cual esperamos que resultara en una terapéutica avanzada significante," añadió el Dr Barranger.

"Este experimento es el primero en una serie de estudios y llevara bastantes años el completarla. Las curas normalmente no vienen de un experimento solo, pero son el resultado de ciencia cuidadosa y minuciosa, hecha en el laboratorio y clínica. No es prudente el esperar que la terapia génica sea un éxito de la noche a la mañana."

"Hace bastantes años, desarrollamos el primer tratamiento para la enfermedad de Gaucher utilizando una enzima, que diseñamos para reforzar su llegada a las células de la médula, y funcionó. Ahora podremos sanar este problema transferiendo el gen por la enzima a la misma clase de células. Esta es la posibilidad que estamos estudiando."

Los estudios de la terapia génica en la enfermedad de Gaucher son considerados como un prototipo para el tratamiento de más de 15 desórdenes heredados.

 

 

Origen: Gauchers News de marzo de 1996.

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1996, 1997

 

Los prometedores primeros resultados de la terapia génica

 

 

Los resultados de la primera fase del ensayo de terapia génica en tres adultos con la enfermedad de Gaucher fueron revelados por el Profesor John Barranger en una reunión el domingo 19 de Abril 1998 en el NYU Medical Center en Nueva York. Susan Lewis informa:

El Prof Barranger empezó su discurso sobre la terapia génica diciendo que no sabia todavia si funcionara la terapia génica, pero que la primera fase de su estudio mostró que el gen para el glucocerebrosidase habia sido transferido con éxito a tres pacientes y que estaba produciendo la enzima con seguridad.

Tres pacientes, una mujer y dos hombres alrededor de los 50 años de edad, continuaban teniendo enfermedad en los huesos a pesar de recibir la terapia de reemplazo de la enzima durante algunos años.

Despues de recibir cuatro transferencias génicas en intervalos de tres meses, un paciente continua produciendo bastante enzima para poder cesar la terapia de reemplazo de la enzima Cerezyme en Octubre de 1997. Antes de eso, la dosis fue reducida de 60u/k/bw (unidades por kilo) a 3u/k/bw durante un periodo de 12 meses.

El Prof Barranger informó que el paciente esta produciendo tres cuartos de la actividad normal de la enzima, el equivalente al de un portador sano y sigue bien.

El segundo paciente tambien recibió cuatro transferencias génicas. Aunque su actividad enzimática aumentó, ha recibido subsiguientemente otras tres transferencias génicas. Permanece en la terapia de reemplazo de la enzima.

El tercer paciente cesó de formar parte del estudio, después de recibir dos transferencias génicas, debido a efectos adversarios producidos por una medicina adicional (Neupogen) necesaria en el proceso. Sin embargo su elevación en su actividad enzimática ha continuado.

El Prof Barranger explicó que para que la terapia génica funcione, el gen tiene que ser introducido en células primitivas no especializadasen la médula espinal del paciente llamadas stem cells. Son estas stem cells las que generan todas las células de las sangre incluyendo las células rojas y blancas. Los stem cells también producen los monocytes los cuales se convierten en macrophages, las células que no trabajan apropiadamente en la enfermedad de Gaucher y por lo tanto acumulan la substancia grasa (glucocerebroside) en el higado, el bazo y la médula.

Un pequeño porcentaje de las células CD34 son stem cells y estas pueden ser recolectadas de un paciente cogiendo sangre de la forma usual de una vena del brazo.

Pero primero se administra al paciente la medicina Neupogen para estimular el desprendimiento de estas células CD34. La medicina, la cual es administrada en un periodo de cinco dias, puede producir un poco de dolor de huesos, dolor de cabeza y nausea, pero estos síntomas se pasan una vez que se deja de tomar la medicina. Ocasionalmente la medicina puede reducir el nivel de las plaquetas y es por este último efecto que el tercer paciente descrito cesó de participar en el ensayo.

A medida que se extrae la sangre del paciente, las células CD34 son extraidas y el resto de la sangre es devuelta al paciente.

Durante un procedimiento complejo que envuelve diferentes procesos, las células se colocan en una bolsa de plástico, con un retroviral vector el cual contiene y lleva el invariable gen glucocerebrosidase,  estas son removidas en una centrifuga. Entonces las células son recogidas y devueltas al paciente por medio de una infusión en la vena.

Los primeros resultados

El Prof Barranger explicó que la primera fase del estudio era para ver si habia algún riesgo para el paciente, no para ver si producia algún beneficio.

El y su equipo han demostrado que la medicina Neupogan puede estimular el desprendimiento de las células CD34, que las células pueden ser recogidas de la sangre de los pacientes y que de 20-30% de los stem cells ocupan el gen. 

También han demostrado que el gen puede ser reintroducido en la médula por medio de una infusión en el riego sanguineo. Esto puede hacerse sin tener que destruir primero la médula del paciente (lo cual se tiene que hacer cuando se hace un transplante de médula utilizando a un donante). 

En los tres pacientes, han podido medir que su actividad de gluco-cerebrosidase es más alta de lo que era antes de la transferencia del gen.

El Prof Barranger dijo que los tres pacientes tenian genotipos diferentes (N370/N370, N370/no conocido; L444P/no conocido) pero esto no ha mostrado diferencia en la respuesta.

¿Cuantos años faltan?

El Prof Barranger dijo que el siguiente paso era el reclutar más pacientes. Tiene bastantes voluntarios pero los estudios siguen siendo muy caros debido a los materiales que se necesitan para purificar las células CD34.

No puede empezar todavia a niños en la terapia génica pues no tiene bastante información en su seguridad y en otras cuestiones.

Dijo que no sabia todavia cuantas transferencias son suficientes para la cura de la enfermedad de Gaucher. Puede ser una, muchas o puede que no funcione núnca.

Si tuviera un millón y medio de dólares y pudiera estudiar a 10 pacientes, podria tener datos razonables en dos años. Puedo encontrar en que puedo reproducir mis resultados y puede ser que no.

Si no hubieran efectos secundarios y una respuesta clínica, la terapia génica podria ser posible de 12 a 15 meses después de esto.

Hemos retrasado el hacer más estudios por la posibilidad de que exista un nuevo vector que sea portador del gen. Sabremos pronto si seguiremos con el actual. sin embargo si en nuevo vector es mejor, esperaremos a tener la aprobación del FDA para utilizarlo.

Más de 1,500 pacientes han utilizado los vectores retrovirales en diferentes tratamientos y no hay evidencia de que estos puedan producir cáncer.

"También estamos haciendo pruebas para aumentar la absorción de las células CD34 en la médula de los stem cells".

Otras investigaciones

El Prof Barranger esta también haciendo una investigación en colocar el gen en las células del músculo para ver si pueden producir la enzima y llevarla a la médula, el higado y el bazo.

El Prof Barranger enfatizó que puede que la Terapia génica no funcione núnca o que pude funcionar en unos años. Han sido cerrados otros dos estudios de terapia génica en USA. Somos el único centro en USA que esta llevando a cabo el estudio sobre la Terapia génica para la enfermedad de Gaucher.

 

 

Origen: Noticias de Gaucher de Julio de 1998

Traducido por Victoria Villar Casares

Todos derechos reservados (c) Copyright Gauchers Association 1998

 

 

 

 

La actualidad en la terapia del genLa actualidad en la terapia del gen

 

 

 

Contenido

 

 

 

La Dr Pamela Becker Prefesor Asistente en el Centro Médico de la Universidad de

Masachusets, ha estado haciendo una investigación sobre la terapia del gen para

la enfermedad de Gaucher, desde Marzo de 1996 y ha colaborado con el Prof John

Barranger en el ensayo de la terapia génica que ha llevado a cabo en tres

pacientes de la enfermedad de Gaucher. Ella habló sobre las pruebas en la

Conferencia de Gaucher en Menfis.

El Dr Becker explicó que han empezado a un cuarto paciente en las pruebas de la

terapia del gen, recibiendo una transferencia del segundo gen esa semana. Esta

programado que el paciente reciba cuatro transferencias del gen en intervalos de

tres meses. Hay dos pacientes más que empezaran pronto.

Se han efectuado modificaciones al proceso de la transferencia del nuevo y sano

gen en el tronco de las células de la sangre del paciente, lo que se espera que

mejore la cantidad del nuevo gen introducido y por lo tanto producir más enzima.

 

"No importa el genotipo (mutaciones genéticas heredadas) del paciente. La

esperanza es aumentar la actividad enzimática de su deficiente nivel. Puede ser

que el medio ambiente de la médula tiene que ser bueno para permitir agarrarse a

las células modificadas".

"Todavia se tiene que hacer mucho trabajo pero espero que la terapia del gen sea

un tratamiento efectivo dentro de 5 a 10 años".

El Dr Becker dijo que cada persona tiene cerca de 100.000 genes y cualquiera de

ellos puede causar enfermedad. Desde hace cinco años, bastantes miles de

pacientes que sufren de diferentes enfermedades han recibido la terapia del gen,

aunque hasta ahora los resultados no han sido efectivos. Más de dos tercios han

sido para pruebas contra el cancer y sólo un 0.2% en enfermedades congénitas

como la enfermedad de Gaucher.

 

 

 

Origen: Noticias de Gaucher de enero de 1999

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1999

 

 

 

 

                       

                       

La terapia génica en el Reino Unido

 

 

 

 

 

 

Actualmente no se esta estudiando la terapia génica para la enfermedad de

Gaucher en el Reino Unido, pero sí para otras enfermedades. En la conferencia

annual en septiembre de 1994 de la conferencia sobre la Investigación para las

Enfermedades Metabólicas en los Niños, en Stoke-on-Trent, dos doctores hablaron

sobre su trabajo en la terapia génica a los 300 miembros que atendieron. La

Conferencia de dos días tuvo un gran éxito. La enfermedad de Gaucher destacó de

forma prominente cómo la primera enfermedad de su tipo en tener un tratamiento

exitoso (Ceredase). El Profesor Timothy Cox habló sobre la terapia de reemplazo

de la enzima y su papel en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Su

discurso está en la conferencia de la asociación Gaucher.

El Profesor Bob Williamson del Hospital St Mary, en Londres habló sobre la

terapia génica, lo cual ha estado investigando desde 1959, para la enfermedad de

cystic fibrosis. El dijo que hay alrededor de 4.000 enfermedades genéticas de

las que de 600 a 700 han aislado los genes. Para enfermedades más recesivas ( la

enfermedad de Gaucher es una), el 90% de los que las sufren no tienen historial

familiar. Las enfermedades heredadas eran raras.

Una vez que el gen ha sido localizado y aislado, hay la oportunidad de llevar a

cabo una detección genética. "Nosotros ahora tenemos la oportunidad de hacer una

detección para cystic fibrosis si la quieren. Esto ni siquiera requiere una

muestra de sangre - podemos hacer la detección utilizando un liquido para

enjuagar la boca, hecho con agua del grifo." El dijo también que la diagnosis

prenatal se puede hacer con un huevo obtenido de la madre antes de ser

fertilizada, pues sólo un huevo sano puede ser utilizado para la fertilización

in vitro.

La medicina verde

El Profesor Williamson dijo que la idea de la terapia génica era la de poner una

copia de un gen normal para reemplazar el defectuoso. Esto se llamaba

terapéutica genética somática y no cambió ningún modelo de la herencia, aunque

sugirió que dentro de 20 a 25 años podrá ser ético el corregir un huevo o célula

de esperma antes de ser concebido, lo cual afectará a las futuras generaciones.

El desechó las críticas sobre la ética de la terapéutica genética somática.

"Esto es verdaderamente medicina de baja tecnologia" dijo. "Debe de ser posible

el poner genes en las células para prevenir que aparezcan las enfermedades. Es

mucho más difícil el invertir algo que esta mal que el preservar la función

normal."

Los problemas

El problema con la terapéutica génica es el inventar un método eficaz para

enviar el gen normal al cuerpo, de manera que se quede allí y reemplace al gen

defectuoso. El gen necesita entrar en las células requeridas. Por lo tanto es

necesario apuntar a la céula, entrar en ella y presionar al gen para que haga lo

que se le pide. En el tratmiento de cystic fibrosis el encontró que utilizando

partículas de grasa como un inhalador era seguro pero no eficaz. Otro método

utilizando un adenovirus se encontró que producia efectos secundarios. El tercer

método, cogiendo células de la médula del paciente, modificandolas y

devolviendolas a la sangre utilizando un retrovirus es el camino al que estan

dirigidas las investigaciones. Otro método que puede ser utilizado sería el

poner un gen debajo de la piel para activar una reacción cuando fuese requerido

(ej. El producir insulina para un diabético cunado alguien come).

Pero el Profesor Williamson advirtió "La terapéutica génica no va a ser una

varita mágica." Puede necesitar el ser utilizado en relación con otras formas de

terapéutica y hay peligros posibles que no necesariamente pueden ser prevenidos.

Utilizando un virus puede causar enfermadad y puede ser difícil el librarse de

ello. Tiene el potencial de causar problemas. El Profesor Williamson enfatizó

que la seguridad era absolutamente importante.

El futuro

Mirando al futuro, dijo que por el momento la terapéutica génica estaba siendo

aplicada a dos enfermedades pero que en los próximos cinco años, otros

problemas, incluyendo la enfermedad de Gaucher, seran tratados con la terapia

génica y que en 20 a 30 años, sera un tratamiento general para muchas

enfermedades.

La deficiencia ADA

El Dr Gareth Morgan del Hospital Great Ormond Street, de Londres habló sobre la

terapéutica génica que el había efectuado en un niño que sufria de la

deficiencia ADA. Precedió su charla declarando "No hay nada especial sobre los

genes. Pueden ir mal como cualquier parte del cuerpo." Dijo que nueve pacientes

en todo el mundo habían recibido la terapéutica génica por la deficiencia de ADA

( la cual al igual que la enfermedad de Gaucher es causada por una deficiencia

del enzima). El método fue coger algunas células de la médula del paciente,

separar las stem cells, estimular y crecer estas en el laboratorio durante un

dís o más y entonces hacer una cultura con un retrovirus portador de un gen

normal. Una proporción de las células ha demostrado una expresión de la enzima

perdida del ADA. Cuatro días más tarde se le devolvieron al paciente.

Desafortunadamente no hubo una mejora en el paciente durante los primeros tres

meses. Seis meses después del tratamiento no hubo células con el gen normal en

la sangre aunque había unas pocas en la médula. Un año después no se encontraron

genes normales en la médula. (El paciente esta siendo tratado también con la

terapéutica de reemplazo de la enzima PEG y se mantiene bien). A otros dos

pacientes en Holanda y Francia se les dió el mismo tratamiento con resultados

similares.

Por un lado positivo, ninguno de los pacientes empeoraron por tener la

terapéutica génica aunque parece que hasta ahora no ha funcionado para ellos.

(Un informe reciente indica que una terapéutica génica para ADA ha sido llevada

con éxito en el NIH en Washington.)

El Dr Morgan describió algunos criterios necesitados para la terapéutica génica.

Tenía que haber:

  un solo gen defectuoso.

  el gen había sido clonado.

  la enfermedad era corregible con trasplante de médula.

  mecanismos simples para controlar el gen.

  se requeria niveles bajos de la expresión del gen para corregir el defecto.

El Dr Morgan también describió algunos de los problemas. El gen modificado:

  puede causar daño a los otros genes normales del cuerpo.

  puede interferir con las defensas normales del cuerpo contra el cáncer.

El Profesor William Krivit del Institute of Human Genetics, de la Universidad de

Minnesota habló sobre el trasplante de médula. Empezó diciendo que ya no era

necesario hacer una prueba por biopsia de la médula; se puede hacer con una

muestra de sangre utilizando spectroscopy. Comentó que el desarrollo del

Ceredase significa que los trasplantes de médula ya no son deseables para los

pacientes de Gaucher, excepto posiblemente algunos pacientes de Gaucher tipo 3.

 

 

 

 

Origen: Gauchers News de febrero de 1995

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1995, 1997

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Terapia génica en USA

 

 

 

Corrientemente hay tres grupos de investigadores en USA que estan planeando

hacer ensayos. Los tres hablaron en el Gene Transplant panel en la Conferencia

de la Fundación Nacional de Gaucher que se sostuvo en Filadelfia en noviembre de

1994.

El Dr John Barranger de la Universidad de Pittsburgh habló en detalles más

técnicos del misma tema en nuestra propia conferencia.

El segundo orador, Dr Donald Kohn Children's Hospital Los Angeles ya ha estado

involucrado en la terapia actual génica en pacientes con deficiencia de ADA.

Aunque estos ensayos hasta ahora no han mostrado efectos secundarios por la

terapia, no han tenido éxito en tratar la enfermedad.

Su método es trasplantar el material geneticamente alterado dentro de la médula.

Su trabajo indica que los trasplantes génicos en los pacientes de Gaucher pueden

involucrar quimioterapia y radiación para poder matar las células no alteradas

restantes en la médula. Sin embargo esto envuelve un riesgo pues llevará de 2 a

4 semanas para las células geneticamente alteradas, el crecer y reemplazar las

muertas por lo tanto hay un riesgo de muerte de casi un 5% de los pacientes.

Este tratamiento esta relacionado también con la pérdida del pelo y nausea.

Se hizo notar que en ninguno de los tres ensayos de la terapia génica había una

relación con quimioterapia o radiación. El estudio del Dr Kohn está en relación

con los Drs Brady y Barton del National Institute of Health, en Washington DC.

El grupo del Dr Kohn estan utilizando un retrovirus genéticamente alterado

diferente que el utilizado por el Dr Barranger.

El Dr Friedrich Schuening del Fred Hutchinson Cancer Research Centre, en Seattle

informó sobre ensayos utilizando perros a los que les habían sometido el

procedimiento propuesto por el Dr Barranger para ensayos clínicos con humanos.

El informó de como sus experimentos con perros habían mostrado que los que

habían recibido quimioterapia o radiación tuvieron algo de absorción del

material genéticamente alterado, mientras que los que no absorvieron muy poco o

nada. El concluyó que las capacidades corrientes para la terapia génica son

modestas. Del lado positivo, el informó que la terapia génica parecia ser

relativamente segura pues el tenia perros sanos cinco años después de recibir el

trasplante de gen.

 

 

Origen: Gauchers News de febrero de 1995

Traducido por Victoria Villar Casares

(c) Copyright Gauchers Association 1995, 1997

 

 

 

 

 

 

 

                       

 

 

 

 

 

Polémica en la terapia génica

 

 

 

¿Tratamiento genético para modificar

la memoria o la personalidad?

 

        (Neil Boyce-New Scientist/El Mundo).- La terapia génica podría iniciar una revolución en el campo de la medicina, pero ¿caeremos en la tentación de emplear estos tratamientos en personas sanas para alterar la personalidad, la memoria y otras facultades humanas?. Una empresa llamada Cattaca ha publicado en los periódicos de EE.UU un anuncio en el que ofrece sus servicios para crear niños a medida empleando técnicas de ingeniería genética.

        "¿Hasta dónde está usted dispuesto a llegar?", se pregunta a los lectores. "¿Hasta dónde podría llegar su hijo?". A continuación se presenta una lista de rasgos y comportamientos que pueden alterarse genéticamente, como el color de la piel, la calvicie precoz, la capacidad intelectual, las habilidades deportivas, las tendencias agresivas, las destrezas musicales, así como la obesidad, el alcoholismo y la predisposición a padecer ciertas enfermedades. Si bien las modificaciones que ofrece Cattaca pertenecen a la ciencia ficción, en la vida real la línea que separa el tratamiento de las enfermedades y la mera potenciación de rasgos humanos es cada vez más tenue.

        Los tratamientos a base de la hormona del crecimiento, por ejemplo, fueron desarrollados para las personas que padecían de una deficiencia hormonal hereditaria, pero en la actualidad también se emplean para estimular el crecimiento de personas sanas de baja estatura. Se teme que lo mismo ocurra con los tratamientos genéticos. De hecho, en la actualidad los investigadores no sólo alteran los genes para tratar enfermedades raras y devastadoras. Los primeros ensayos clínicos de tratamientos genéticos comenzaron en 1990, y desde entonces los científicos han llevado a cabo cientos de estudios con miles de pacientes.

        A principios de este año, miembros del Comité Asesor sobre ADN Recombinante de los Institutos Nacionales de Salud, de EE.UU, aprobaron el primer ensayo clínico de un tratamiento genético para personas sanas. Las pruebas, dirigidas por Ron Crystal, de la Universidad de Pittsburgh, Pennsylvania, consisten en inyectar a un grupo de voluntarios un virus portador del gen de la citosina deaminasa, tratamiento que se ha utilizado en enfermos de cáncer de colon, para estudiar las reacciones de un sistema inmunológico normal ante este virus. Si bien el estudio de Crystal está, en el fondo, relacionado con la terapia de una patología, a algunos miembros del comité asesor les preocupaba que se estuviese cruzando la frontera que hasta ahora ha impedido manipular el código genético de personas sanas.

        Lo que distingue a la terapia genética es que los genes trasplantados podrían llegar a los espermatozoides o a los óvulos y, por tanto, ser transmitidos a los hijos. De ocurrir esto, el cambio genético estaría presente en todas las células del cuerpo, no sólo en los tejidos tratados, y podría afectar a las siguientes generaciones. Si bien no existen pruebas científicas de que un gen trasplantado pueda llegar a introducirse en las células germinales, tampoco se puede afirmar rotundamente que nunca se dará el caso. La posibilidad de alterar las células germinales con métodos de ingeniería genética para crear un niño inquieta a la mayoría de las personas.

Ningún científico o empresa ha propuesto en público intentar curar una enfermedad mediante la manipulación de espermatozoides, óvulos u óvulos fecundados, y la mayoría rechaza la idea de potenciar genéticamente las facultades humanas. Los Institutos Nacionales de Salud de EE.UU han dicho tajantemente que no autorizará ningún tipo de terapia germinal, porque se desconocen los riesgos que pueden representar, y algunos países, como Alemania, han prohibido estos experimentos.

Theodore Friedman, de la Universidad de California en San Diego, autor de un importante artículo sobre terapias genéticas publicado hace 20 años, afirma que Dolly, la oveja clonada por investigadores del Instituto Roslin, de Edimburgo, es una prueba de que las nuevas tecnologías pueden convertir la ciencia ficción en realidad. Friedman cree que el NIH ya no podrá refugiarse en sus argumentos contra las alteraciones germinales. "Siempre existirá la tentación de pasar a modificar los rasgos heredados". ¿Ud. qué opina?...

Health I.G. Consultora Periodística habilita este espacio para compartir las opiniones de los profesionales de la Salud. Los comentarios deben remitirse a:mailto:%[email protected]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

La terapia génica  bajo sospecha:

el caso del paciente nº 18.

Fecha: 10/03/2000

 

La terapia génica se basa en un principio elemental: se selecciona una enfermedad causada por un único gen normal hereditario y se cura administrando al paciente un gen substitutivo normal. Las expectativas son enormes, sin embargo su eficacia clínica está aún por ver. Esta terapia se ha intentado con escaso éxito en enfermedades tales como la fibrosis quística, la hemofilia B, o la beta-talasemia,entre otras.

Episodios como el que se comenta, recogido en la prensa científica médica pueden perjudicar el desarrollo de esta nueva estrategia terapéutica. Jesse Gelsinger murió de síndrome de distrés respiratorio del adulto (SRDA) mientras participaba en un ensayo clínico de terapia génica diseñado por la Universidad de Pennsylvania, en Filadelfia, para el tratamiento de su enfermedad: la deficiencia del enzima ornitin-transcarbamilasa. Este tratamiento consistía en administrar los pacientes por vía endovenosa un adenovirus modificado con el gen normal sustitutivo. Poca semanas después la Federal Drug Administration de USA anunció la suspensión de todos los estudios de terapia génica que se llevaban a cabo en dicha Universidad. El informe final de este organismo señalaba que: el paciente sufrió una activación difusa de su sistema inmune tras la inyección del vector "manipulado genéticamente", como consecuencia de la cual sufrió en SDRA. Este caso es especialmente grave y esencialmente diferente al de otros pacientes actualmente sometidos a terapia génica, la deficiencia en ornitin-transcarbamlasa puede controlarse razonablemente con fármacos y régimen dietético.

Aparte del fallecimiento de Jesse, el paciente nº 18, los componentes de la FDA obtuvieron otra información trascendental para la suspensión de los estudios. En efecto, revisando la documentación del estudio, detectaron 18 violaciones del protocolo, entre ellas la ausencia de documentación que indicara el cumplimiento de los criterios de selección de todos los 18 pacientes participantes en el estudio (precisamente el paciente nº 18 que murió presentaba niveles séricos de urea pre-ensayo que desaconsejaba su selección). No constaba tampoco la aceptación por parte de los pacientes de la biopsia hepática. A los tres meses de la muerte de Jesse, los responsables de la investigación piden excusas por sus errores.

¿Cómo pueden los investigadores en terapia génica recuperar la confianza de los pacientes y del público en general?. En la actualidad los científicos se muestran optimistas acerca del futuro de este tratamiento, sin embargo para evitar que se repitan episodios como el del paciente nº 18,  hay que considerar diferentes propuestas entre las que destacan: a) la constitución de un lobby de pacientes que debe participar en la elaboración, diseño y seguimiento del protocolo; b) las comisiones que analizan los datos deben ser independientes del grupo investigador, del centro investigador y del financiador del proyecto, y deben supervisar los estudios previos cuyos resultados podrían constituir una tentación excesiva para los investigadores, y c) únicamente hay que aceptar en los protocolos de terapia génica pacientes cuyas expectativas de vida sean realmente bajas.

 

Barbour V. The balance of risk and benefit in gene therapy trials. BMJ 2000;355:384.

Editorial. Gene therapy under cloud. BMJ 2000;355:329-330.

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Genética: Novedades genética9 - 1/10/98

 

 

Terapia genética en fetos:

se abrió el debate en Nueva York

 

El debate sobre el tema se centró en el Colegio de Medicina Albert Einstein de

Nueva York.

Uno de los pioneros de la genética desea aplicar técnicas en fetos a fin de

prevenir enfermedades mortales.

 

"Estamos hablando sobre un cambio radical respecto a cualquier cosa que haya

ocurrido en medicina", dijo el doctor W. French Anderson, quien realizó las

primeras acciones en el campo de la terapia genética en 1990.

 

Anderson desea inyectar genes sanos en fetos que se encuentren en el segundo mes

de gestación con el fin de curar dos enfermedades raras: El mal conocido como

"enfermedad del muchacho de la burbuja", que le impide al cuerpo enfrentar hasta

infecciones menores, y la alfa talasemia, un tipo de anemia que en los casos más

graves mata a los fetos en el útero.

 

Ambas enfermedades son causadas por el mismo gen. Anderson, quien ahora trabaja

en la Universidad del Sur de California, dice que la terapia genética funcionará

mejor en los fetos debido a que los genes sanos pueden integrarse más fácilmente

a las células de los minúsculos pacientes antes de su nacimiento.

 

Pero subsisten riesgos. El nuevo gen podría integrarse a las células del sistema

reproductor del feto, lo cual significa que la alteración genética podría ser

heredada a sus descendientes.

 

Si el experimento funciona y el nuevo gen previene enfermedades, entonces su

transmisión a futuras generaciones será benéfico. Si el gen falla, los

descendientes del paciente podrían enfrentar mucho mayores riesgos, o la terapia

podría funcionar solamente de forma parcial.

 

Según algunos sectores, las nuevas investigaciones podrían llevar al desarrollo

de humanos "diseñados" para tener ciertas características físicas o mentales.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

NOVEDADES EN TERAPIA GÉNICA

 

 

 

 

SIDA: NovedadesSida/8 - 20/10/97

 

 

Terapia genética contra el VIH

 

 

        Investigadores estadounidenses lograron matar células del organismo

infectadas por el virus del SIDA con glóbulos blancos (las mismas células que

forman el sistema inmunitario). Estos glóbulos fueron extraídos del cuerpo y

modificados genéticamente en el laboratorio.

 

        Según este estudio, realizado por un equipo del laboratorio

norteamericano Cell Genesys y de la Universidad de Harvard (Massachusetts), esos

glóbulos blancos -también llamados linfocitos T- modificados, reconocen las

células infectadas por el VIH y las eliminan tanto en las primeras etapas de la

infección como al cabo de largos tratamientos antivirales.

        Target privilegiado del virus del SIDA, los linfocitos T desaparecen

progresivamente desde el comienzo de la infección y dejan el sistema inmunitario

del organismo sin defensa frente el VIH. Los linfocitos T utilizados por los

investigadores fueron modificados para perseguir a una proteína bautizada

"gp120", que aparece en la superficie de las células infectadas por el virus.

        Según los primeros ensayos clínicos, estas células pueden eliminarlo de

manera tan eficaz como lo harían los linfocitos T atacados por el virus.

        "Pensamos que hemos identificado una nueva estrategia importante en el

tratamiento del SIDA", explicó uno de los investigadores, el doctor Bruce

Walker, de la Facultad de Medicina de Harvard.

        "No sólo hemos demostrado que los linfocitos modificados genéticamente

actúan de manera tan eficaz como los linfocitos naturales, sino que también las

células reconocen "a tiempo" a aquellas infectadas para permitir su destrucción

antes de que liberen su carga viral", dijo el investigador. En otras palabras,

impiden que el virus siga su invasión.

        Según los autores del estudio, células modificadas, aplicadas en la

sangre de los enfermos, son también capaces de atacar eficazmente a varios

mutantes del VIH. Al hallazgo le siguen ahora nuevas pruebas clínicas en los

próximos meses para confirmar la eficacia de esta nueva técnica de lucha contra

el SIDA.

 

        Vacuna: experiencia con voluntarios sanos

 

        Investigadores norteamericanos anunciaron que probarán en seres humanos

una vacuna contra el VIH. Julia Hurwitz y Karen Slobod, del Hospital de

Investigación St. Jude, en Memphis, dijeron que la FDA había autorizado el

inicio de pruebas en un grupo de voluntarios.

        También señalaron que esta vacuna, de funcionar, será preventiva porque

protegerá a personas saludables y no a quienes ya están infectados.

        El objetivo de la vacuna es alertar al sistema inmunológico contra

formas del virus más resistentes que pueden aparecer en el futuro.

        La vacuna desarrollada en el Hospital St. Jude usa las capas proteínicas

exteriores, conocidas como envolturas, de 23 diferentes mutaciones del VIH, cada

una contenida en una vacuna contra la viruela..

        "Nuestra preocupación es que este virus sea el maestro de los disfraces.

Un VIH puede tener una envoltura que parece un círculo y otro, un cuadrado, y

así sucesivamente", dijo Hurwitz.

        Lo que hicieron entonces fue combinar las envolturas para mostrarle al

sistema inmunológico las distintas formas en que el virus puede presentarse

 

 

 

 

 

Cáncer: NovedadesCáncer/7 - 27/10/97

 

 

INVESTIGAN NUEVAS VACUNAS

GENETICAS CONTRA EL CANCER

 

 

        En la Argentina se están investigando las primeras vacunas para tratar

el melanoma o cáncer de piel. Un equipo de la Fundación Campomar ya trató a 30

pacientes y, aunque todavía está en etapa de experimentación, hay resultados

alentadores.

        Vale recordar que el melanoma se produce cuando los melanocitos, las

células de la piel, se degeneran. El equipo de Campomar trató en el Instituto

Fleming a 30 pacientes con melanoma a los que ya se les había extirpado un

tumor.

        Estas personas comenzaron a vacunarse dos meses después de la operación.

Recibieron una vacuna cada tres semanas y luego las inyecciones se espaciaron a

tres y seis meses durante cinco años.

        La evolución de este grupo se comparó con otro de 24 pacientes que no

fueron vacunados. La conclusión fue que el tratamiento con vacunas, llamadas

alogénicas, aumentó las defensas del paciente y mejoró su cuadro clínico.

        El último trabajo sobre esta investigación, que es apoyada a través de

donaciones por la Fundación Sales, fue publicado en la revista de Medicina de

Buenos Aires, del mes de agosto.

        La vacuna tradicional que se comenzó a usar con buena suerte para frenar

la epidemia de viruela en 1796, ataca enfermedades infecciosas como la

poliomielitis, la difteria o la hepatitis C.

        Para la epidemiología, las vacunas tienen un rol preventivo muy claro.

Pero desde hace 10 años, un camino se está abriendo: las nuevas vacunas

genéticas contra el cáncer.

        José Mordoh, jefe de Cancerología de la Fundación Campomar y director de

esta experiencia, relató su hipótesis: "hay cánceres que pueden ser controlados

si se aumentan las defensas específicas del organismo".

        La vacuna contra el cáncer es un desafío complicado para la ciencia. Los

agentes infecciosos, contra los cuales algunas vacunas son eficaces, son agentes

extraños y apenas el sistema inmunológico los identifica, reacciona y los ataca.

Pero el cáncer crece dentro del organismo a partir del desarrollo de células

defectuosas.

        Por eso, estas nuevas vacunas se producen a partir de las mismas células

del organismo que son extraídas, modificadas en laboratorios y vuelven al cuerpo

con sustancias nuevas para luchar contra sus hermanas malignas. Así lo explica

en un informe Alan Houghton, jefe del Programa de Inmunología del Memorial Sloan

Kettering Cancer Center de Nueva York. En ese centro se trabaja con vacunas para

tratar elmelanoma genéticamente desde 1994.

        Se comprobó que el cáncer de piel tiene un alto componente genético, al

igual que el de mama y el de colon, según recordó José Mordoh, disciípulo del

Premio Nobel Luis Federico Leloir e investigador del Instituto Pasteur francés.

        En la primera etapa de esta experiencia, se utilizaban células de los

propios pacientes, irradiadas y mezcladas con BCG, un microbio que aumenta el

rechazo del sistema inmunológico. Los pacientes demostraron una leve mejoría.

        Después se descubrió que las vacunas podían actuar en lo que se llama

estadío 3 de la enfermedad, "cuando el tumor ya fue extirpado y hay de un 40 a

un 60 por ciento de posibilidades de que vuelva a aparecer. En ese momento se

aplica la vacuna modificada ahora con interferón, una proteína muy chiquita",

explicó Mordoh.

        Las sustancias con las que son modificadas tienen la virtud de atraer al

lugar de la inyección a los macrófagos, células del sistema inmunitario, que

comen a las foráneas. Cargados con nuevas armas, viajan a los ganglios

linfáticos donde "reclutan" células defensivas que pelean contra el cáncer.

        Después de un período de vacunación se comprobó que estas vacunas, al

aumentar las defensas prolongaban el período libre de enfermedad después de la

operación.

        Según datos de la Sociedad Argentina de Dermatología, uno de cada tres

cánceres que se diagnostica en el país es de origen cutáneo. Todas las personas

tienen de 10 a 20 lunares. Si aparecen nuevos lunares o algunos cambian de color

y tamaño, hay que consultar a un especialista.

        Como en tantas otras enfermedades es importante diagnosticar el melanoma

de manera temprana porque con el paso del tiempo se vuelve más profundo y más

difícil.

        Cuando se diagnostica rápido, es tratable a través de la cirugía y se

cura prácticamente en todos los casos. Cuando ya avanzó, hay dos caminos:

fortalecer las defensas o atacarlo con drogas anticancerosas. Ahora está la

vacuna.

        En el laboratorio los científicos son optimistas: "Esperamos que en

menos de una década, podamos serlo en un ciento por ciento con los pacientes",

afirmó Olivera Finn, directora del Programa de Inmunología del Instituto de

Cáncer de la Universidad de Pittsburgh. Allí se estudian vacunas para la lucha

contra el cáncer de mama.En ningún lugar del mundo se usan estas vacunas clínica

y masivamente, "pero sólo es cuestión de tiempo -afirma Mordoh-. En el futuro

podrán usarse de manera preventiva porque, además, tienen un plus interesante:

son económicas.

 

 

      Genética: Novedades Genética4 - 7/1/98

 

 

Nueva terapia con genes para pacientes cardíacos

 

 

(CNN) -- Investigadores médicos anunciaron el lunes el desarrollo de una nueva

técnica que permitiría a las personas con problemas cardíacos evitar la

angioplastia y la cirugía de desvío coronario. Profesionales del Centro Médico

de la Universidad Cornell en Ithaca, Nueva York, han inyectado por primera vez

un gen en el corazón de un paciente con isquemia, o reducción del flujo

sanguíneo hacia el corazón.

"Para el paciente, significa que podemos llevar sangre a los tejidos cardíacos

necesitados de oxígeno", dijo el doctor Ronald Crystal del Centro Médico

Cornell. "Y eso, para los centenares de miles de individuos que sufren

enfermedades de la arteria coronaria, podría ser un verdadero avance".

Generalmente, un paciente con isquemia necesita cirugía para abrirle las

arterias bloqueadas o crear un desvío alrededor de ellas.

Con el tratamiento genético, sin embargo, se supone que el nuevo gen "instruye"

al corazón para que busque atajos en torno de las arterias bloqueadas

estimulando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.

"A partir de los estudios con animales sabemos que es espectacularmente

exitoso", dijo Crystal. "Esperamos que lo mismo sea cierto para los humanos,

pero no lo sabremos antes de varios

meses".

Aunque esta es la primera vez que se usa el tratamiento genético en el corazón,

dos equipos de investigación lo han aplicado anteriormente para tratar bloqueos

en las piernas.

El doctor Jeffrey Isner del Centro Médico Santa Isabel, cerca de Boston, usó una

técnica de tratamiento genético similar a la empleada en Cornell en un intento

por salvar la pierna izquierda de una mujer. Ya había perdido la derecha debido

a la ateroesclerosis.

"No recibía suficiente sangre en la parte inferior de la pierna, y como

resultado se le había desarrollado una gangrena en el pie", contó Isner.

El experimento funcionó, y el tratamiento se ha utilizado en 21 pacientes, con

casi un 75 por ciento de éxito. Los médicos predicen que el tratamiento genético

pude usarse algún día en combinación con (o en lugar de) la cirugía de desvío y

la angioplastia. Pero tal vez pasen años antes de que se lo pueda emplear de

manera rutinaria en pacientes con enfermedades cardiovasculares.

 

 

     

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Otras técnicas para la introducción de DNA recombinante en células eucarióticas

 

 

 

Vale la pena describir otras tres técnicas recientes para la introducción de DNA recombinante en células eucarióticas: electroporación, transferencia mediante liposomas y transferencia “biolística”.

En la electroporación, las células toman DNA exógeno al estar sujetas a una exposición breve a electricidad de alto voltaje. Presumiblemente, este campo eléctrico crea unos microporos transitorios en la membrana celular que permiten la entrada de DNA exógeno.

La transfección mediante liposomas es una técnica en la que el DNA foráneo es encapsulado en unas vesículas de membrana artificial, llamadas liposomas. Los liposomas se usan entonces para llevar su DNA a las células diana.  En un experimento, se transfectaron con éxito el 50% de los ratones inyectados con estos liposomas portadores de DNA, esto es, expresaron las proteínas codificadas en el DNA transfectante.

La última novedad es el desarrollo de técnicas para introducir DNA foráneo en mitocondrias y cloroplastos, que han demostrado ser objetivos difíciles para la ingeniería genética porque, entre otras razones, tienen paredes de membrana doble que no resultan adecuadas para el suministro de DNA recombinante. Recientemente, se ha conseguido la transfección tanto en mitocondrias como en cloroplastos mediante el procedimiento de la “biolística” (balística biológica), técnica en la  que el DNA recombinante se suministra en forma de cubierta de microproyectiles de tungsteno que son literalmente disparados contra estos orgánulos.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ÍNDICE

 

 

            Terapia génica...........................................................Página 1

            Enfermedades candidatas al

tratamiento mediante terapia génica......................................Página 5

            Primeros intentos de terapia génica,

actualidad y perspectivas.......................................................Página 8

            Ratones transgénicos..................................................Página 13

            Vectores eucarióticos..................................................Página 16

            Vectores retrovirales...................................................Página 18

            Otras técnicas para la introducción

de DNA recombinante en células eucarióticas.......................Página 26

            La enfermedad de Gaucher y

la terapia génica......................................................................Página 27

            La terapia génica en el Reino Unido...........................Página 40

            Terapia génica en USA...............................................Página 43

            Polémica en terapia génica..........................................Página 44

            Últimas noticias referentes a terapia génica................Página 47

            Bibliografía..................................................................Página 55

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIBLIOGRAFÍA

 

 

 

- Ingeniería Genética. Miguel Vicente y Jaime Renart.

            Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 1987.

 

- Però, què és això de la genética?. M.Dolors Moltó. Lluís Pascual.

                        Universitat de Valencia, 1999.

 

 

- Principios de Genética. R. Tamarin.

                        Editorial Reverté, 1996.

 

- Perspectivas en Genética. J.Oliver y M. Rejón

                        Editorial Rueda.

 

- Genética y enfermedad. Alfred G. Knudson, Jr.

                        Ed. Omega.