Indice 1

Abreviaturas 1

Modificación de los genes endógenos de las plantas. 4

Introducción directa de fragmentos de DNA. 4

Estrategias para la protección de plantas mediante ingeniería genética 7

Expresión de proteínas de la cubierta y resistencia en plantas transgénicas. 7

Uso de RNAs satélites. 9

Uso de RNA antisentido. 10

Construcción y diseño de genes quiméricos codificantes de proteínas de la envuelta y su introducción en plantas. 11

Aislamiento del gen de la cubierta, limitaciones. 11

Selección de promotor apropiado. 11

Importancia de la secuencia en 3’. 12

Selección de plantas transformadas. 12

Detección de la protección mediada por proteínas de la cubierta y sus características. 14

Desarrollo de los síntomas de la enfermedad en plantas CP(+) y CP(-). 14

Factores que afectan a la resistencia a virus en plantas transgénicas. 15

Concentración viral del inóculo 15

Naturaleza de la planta hospedadora. 15

Condiciones de crecimiento y de resistencia de la planta. 16

Especificidad de la protección mediada por CP. 16

BIBLIOGRAFÍA. 17

Modificación de los genes endógenos de las plantas.

En muchos casos es necesaria la introducción de genes tomados de organismos evolutivamente distantes. Las plantas transgénicas han sido diseñadas para expresara constitutivamente estos genes. se puede utilizar la tecnología del ADN recombinante para alterar los genes endógenos de las especies. El sistema de Agrobacterium ha sido utilizado para producir casi todos los ejemplos de plantas transgénicas que mencionaremos. Esta bacteria tiene una especificidad de hospedador muy amplia y, en principio, puede infectar a muchas plantas dicotiledónias. Sin embargo, presenta algunas desventajas. En muchos casos hay gran dificultad para regenerar plantas completas a partir de células capaces de recibir el plásmido Ti. Se está investigando el uso de tejidos embrionarios (Ej: epicótilo, hipocótilo) como receptores del DNA. Tienen un potencial de regeneración muy alto.

Introducción directa de fragmentos de DNA.

Agrobacterium no infecta a plantas dicotiledónias de forma natural. Entre estas hay grupos económicamente importantes como son los cereales. Aparentemente esto es debido a la pobre respuesta que presentan estas especies frente a las heridas. Hasta hace muy poco no se ha encontrado métodos satisfactorios de introducción de DNA en ellas. Recientemente se han puesto a punto sistemas de transferencia de genes desde Agrobacterium hacia embriones de arroz. Está por verse si esta técnica se puede aplicar a otras especies. La dificultad para utilizar este sistema ha hecho que se busquen otros métodos de introducción de DNA de forma directa:

Protoplastos de tabaco.

• Incubación de   protoplastos de plantas con DNA. Los protoplastos toman DNA en   presencia de polietilénglicol (PEG). Cuando los protoplastos   se fabrican a partir de células embrionaria, a menudo es   posible regenerar plantas transgénicas.  
  Liposomas

• Fusión de DNA contenido   en liposomas con protoplastos. Pueden utilizarse en aquellas   plantas que pueden ser regeneradas a partir de los protoplastos.   Sin embargo, cuando el DNA puede ser introducido utilizando   fosfoenolpiruvato este método no tiene ventajas.

• Introducción de DNA en   protoplastos mediante electroporación. La aplicación   transitoria de una diferencia de potencial eléctrico elevada   a través de la membrana celular puede producir grandes   poros, a través de los cuales el DNA que hay en el  medio   difunde espontáneamente. Este método tampoco ofrece   grandes ventajas sobre el 1º.

Pistola de DNA

• Bombardeo de células con DNA unido a microproyectiles. Se unen fragmentos de DNA a bolitas microscópicas de algún metal que serán disparadas a las células. Estas incorporan el DNA. Este método tiene un gran potencial porque no necesita del complicado proceso de regeneración de células y tejidos a partir de protoplastos. No obstante tienen algunos inconvenientes. El más importante es la baja frecuencia de integración satisfactoria de DNA extraño Esto significa que se deben examinar un amplísimo número de células descendientes para encontrar unas pocas que hayan adquirido el nuevo gen.

Los virus pueden ser eliminados de las plantas por cultivo de meristemos. Sin embargo, es mucho más rentable prevenir la infección. No se debe olvidar que una planta curada puede volver a ser infectada por el mismo virus. Por lo general los agricultores siembran un mismo tipo de plantas en una misma zona, por lo tanto la enfermedad podría que dar residente en el suelo durante largo tiempo. Además, es inviable curar de virus a las plantas para cada siembra.

El mecanismo de resistencia a los virus sobre todo el de reconocimiento del blanco no es totalmente conocido.

Para limitar la infección de un virus puede provocarse una especie de vacunación utilizando un virus parcialmente dañado, cuyos efectos son más suaves. Las infecciones siguientes, realizadas por unidades más virulentas, tienen problemas para desarrollarse, tanto si las provoca el mismo virus como especies relacionadas. A este fenómeno se le denomina resistencia cruzada.

La protección cruzada es una respuesta compleja causada por la replicación y expresión de un genoma viral completo. La protección cruzada debida a ingeniería genética no utiliza genomas completos.

La acumulación de proteínas de la cubierta de un virus (CP) en una célula vegetal confiere resistencia frente al virus de procedencia y a la familia de virus relacionados con él. La expresión de estas proteínas en plantas se denomina “resistencia mediada por proteínas de la cubierta”

Actualmente proponen 3 estrategias para proteger a las plantas de los virus usando la ingeniería genética:

• Protección cruzada modificada.

• Uso de ácidos nucleicos satélites.

• Uso de RNA’s antisentido.

Expresión de proteínas de la cubierta y resistencia en plantas transgénicas.

Plásmidos derivados del Ti. Muestran sus regiones comunes

Se han clonado genes de la cubierta de varios virus en vectores de expresión de plantas usando el sistema de transformación mediado por Agrobacterium tumefaciens el análisis de RNA se lleva acabo por transferencia de Northern y las proteínas de la cubierta se detectan inmunológicamente por Western. El promotor más usado es el del rRNA 35S del CaMV.

  También ha sido demostrado que las plantas de tabaco  transgénicas que expresan proteínas de la cubierta del   TMV(virus del mosaico del tabaco) muestren un descenso  significativo de los síntomas desarrollados tras la  infección. Este fenómeno se ha observado con en otras  plantas y con otros virus.

En muchos casos la resistencia a los virus se entiende como un descenso en la acumulación de virus en plantas y la reducción de las lesiones locales.

Cuando el investigador pretende optimizar la protección cruzada sigue el planteamiento de identificar la función de cada proteína. De esta manera discierne entre los genes responsables del fenómeno de protección de aquellos que codifican las proteínas causantes de los síntomas de la enfermedad. En las plantas transgénicas se insertan los genes responsables de la protección. Deben ser capaces de revertir la infección con virus nativos.

Existen algunos ejemplos donde esta técnica ha tenido éxito. Veamos algunos:

• Proteínas de la cubierta del TMV fueron introducidas en plantas de tabaco bajo el control del promotor 35S del CaMV. Los síntomas de una infección posterior fueron más débiles que en las plantas normales. Además del 10-60% de las plantas recombinantes no desarrollaron la infección.

• Plantas protegidas con proteínas de la cubierta del AMV (virus del mosaico de la alfalfa) son igualmente resistentes contra las enfermedades.

Cuando inoculamos los RNA’s de los virus AMV y TMV son tan infecciosos en las platas que expresan proteínas de la cubierta como en aquellas que no lo hacen.

Proteína de la cubierta del TMV

Uso de RNAs satélites.

Se ha observado que algunas secuencias de RNA pueden mejorar los síntomas de la enfermedad causadas por virus de RNA. Son secuencias de pequeño tamaño que se replican y encapsulan normalmente, que no tienen homología con el genoma principal y que no se requieren para la propagación ni replicación del virus. Son los denominados “RNAs satélites”.

Su replicación y transmisión dependen de factores codificados en el genoma vírico. Pueden conferir algún tipo de ventaja selectiva porque no se pierden ni durante la proliferación ni por sección natural. La estrategia de protección genética consiste en introducir copias en DNA del vector RNA satélite. Parecen ser capaces de inhibir la formación de síntomas.

En uno de los experimentos que demuestran lo anteriormente dicho transformaron plantas de tabaco con RNA satélite de CMV (virus del mosaico del pepino) bajo el control del promotor 35S rRNA del CaMV, usando el sistema de Agrobacterium. Tanto las plantas transgénicas como las de control desarrollaron lesiones cloróticas en las hojas en las que se produjo la infección. Sin embargo, las plantas control desarrollaron síntomas de mosaico en todas las hojas invadidas sistemáticamente, mientras que las transgénicas muestran los síntomas en las 2 o 3 hojas invadidas sistemáticamente. En las posteriores no se producen síntomas.

Existen 3 tipos de pruebas para diagnosticar la infectividad de un virus:

• Transferencia de Northern: Se usan sondas tanto par el RNA viral como para el del RNA satélite. se pretende averiguar el efecto del satélite sobre el genoma viral.

• Inmunoensayo: para medir la abundancia de proteínas de la cubierta.

• Test de infectividad en Chenopodium amanticolor: Esta es una planta que hospeda al CMV. En ella la formación de lesiones locales es proporcional a la concentración de partícula biológicamente activas del virus.

Como resultado de estas pruebas se ha concluido que hay correlación entre la reducción de los síntomas de infección y el descenso en la replicación del virus.

Para determinar el espectro de protección de este sistema se inoculan diferentes especies de virus en las plantas transgénicas. Solamente el TAV(tomato aspermy virus) indujo la síntesis del RNA satélite del CMV y redujo los síntomas. El CMV y el AMV son virus estrechamente relacionados filogenéticamente. Sin embargo, la atenuación de los síntomas no está relacionada ni con la reducción de la replicación del RNA genómico ni con la reducción de la infectividad de los extractos de los tejidos. De manera similar se ha investigado el efecto del RNA satélite del TabRV (tobacco rinespot virus) en plantas transgénicas. Cuando el virus infecta la célula produce un incremento drástico en la transcripción del cDNA satélite. Cuando se encuentra con trímeros de este cDNA (por ejemplo: tres copias del monómero situadas en tandem) se produce la reducción de síntomas. Los trímeros son escindidos por la célula a unidades monoméricas. Sin embargo, la introducción de monómeros no reduce los síntomas significativamente. Esto indica que hay un efecto del número de copias de cDNA. La protección se relaciona con el descenso en el nivel de replicación de las partículas víricas infectivas.

Con todo esto es difícil de explicar que los síntomas del TAV pueden ser reducidos sin la inhibición completa de la replicación del virus. La explicación que se ha intentado dar dice que el RNA satélite interactúa con los estadíos tempranos de la replicación del virus y los formación de los síntomas no depende tanto de la concentración final del virus sino de su oportuna acumulación con relación al estado de desarrollo de la célula. Puede ser que el DNA satélite, o posibles proteínas codificadas por él, interactúen con el RNA en el proceso de producción de los síntomas.

El RNA satélite se introduce bajo el promotor del RNA 35S del CaMV. Es un promotor constitutivo que, sin embargo, se induce en gran manera cuando es infectado por el virus. En la protección mediada por proteínas de la cubierta un exceso de inóculo puede saturarla. Aquí, a más inóculo más se induce.

El problema que puede presentar esta estrategia es que la secuencia del gen que protege en un tipo de plantas puede ser virulenta en otras. Incluso puede producirse una mutación que la revierta al estado virulento original en la especie protegida.

Uso de RNA antisentido.

El RNA antisentido es aquel que puede hibridar con otra cadena de RNA porque es complementario a ella y de sentido opuesto.

Esta técnica se usa para prevenir la traducción y consiguientemente la replicación, empaquetamiento y transmisión sistémica del virus. Los RNAs antisentido de varios virus han sido incorporados y expresados en plantas. Los resultados no han sido todo lo espectaculares que cabría esperar: algunos proporcionan una protección débil frente a la infección vírica, otros no producen protección.

RNA  antisentido unido al gen que se pretende inactivar.

Sin embargo, existe una gran cantidad de RNA antisentido de virus que no ha sido investigado totalmente. En ellos están puestas las esperanzas de aplicación práctica de la técnica.

Virus X de la patata.

Hay plantas de tabaco transgénicas ha han sido protegidas de la infección con el virus X de la patata (CVX) mediante la expresión de RNA antisentido contra proteínas de la cubierta. El grado de protección es comparable con el que se obtiene cuando a estas plantas expresan la propia proteína de la cubierta. Con ambas técnicas se redujo el número de lesiones en la hojas inoculadas, se retrasó o desaparición la manifestación de síntomas sistémicos y disminuyó la acumulación de virus.

Se ha demostrado que algunos tipos de RNA, incluyendo el RNA satélite del TabRV son capaces de escindirse espontánea y específicamente. Parece que esta reacción autocatalítica está relacionada con la presencia de ribozimas: unas secuencias cortas de RNA particulares; Su estructura secundaria adopta forma de cabeza de martillo. Se han podido sintetizar ribozimas artificialmente que son capaces de eliminar las secuencias blanco que deseemos y, por tanto, prevenir la expresión del producto codificado por ese gen. Las ribozimas tiene dos regiones de 8 nucleótidos que son complementarias a las secuencias que flanquean al punto de ruptura de la secuencia blanco.

El potencial de esta técnica parece ser enorme, tanto en virología como en el estudio de otros aspectos relacionados con la regulación genética del metabolismo y el desarrollo.

Construcción y diseño de genes quiméricos codificantes de proteínas de la envuelta y su introducción en plantas.

Aislamiento del gen de la cubierta, limitaciones.

El primer paso en la construcción de un gen CP es el aislamiento del ORF (marco de lectura abierto) deseado en la genoteca de cDNA. Esto es relativamente sencillo para virus cuyas proteínas de la cubierta son codificadas por RNAs subgenómicos. Sin embargo, para virus como los del grupo de los poxvirus, cuya proteína de la cubierta es parte de una gran poliproteína el aislamiento del cDNA de las proteínas de la cubierta es muy difícil. En tales casos puede ser necesaria la mutagénesis de sitio específico para asegurar, con la mayor certeza posible, que el DNA codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cubierta.

Antes de que se produzca el aislamiento de la secuencia de la proteína de la cubierta en la genoteca de cDNA, puede ser importante eliminar o alterar secuencias nucleotídicas que sean capaces de afectar a la estabilidad traducción del transcrito. Por ejemplo, puede ser importante localizar el codón AUG (iniciación) en el contexto de una secuencia consenso para asegurar una iniciación de la transcripción eficiente. Las secuencia ATXXAUGXC es usada frecuentemente para la construcción de genes en plantas. Esta incrementa la expresión de un gen que codifica la proteína de la cubierta del SMV (virus del mosaico de la soja). El uso del contexto adecuado para cada secuencia puede ser menos importante cuando se construyen genes proteínas de la cubierta derivados de mRNA’s subgenómicos que contienen un codón de iniciación favorable.

Algunas proteínas de la cubierta de virus de plantas tienen grandes regiones no traducidas a ambos lados, 3’ y 5’, de la región codificante que so clonadas a menudo a lo largo de las secuencias proteínas de la cubierta. Existe la posibilidad de que se produzca apareamiento intramoleculares de bases dentro de estas secuencias que puedan afectar a la traducción o estabilidad de estas secuencias. Para evitar la posibilidad de que se produzcan estos apareamientos es recomendable hacer que estas secuencias sean cortas y que su contenido en pares G:C

sea lo más bajo posible.

Selección de promotor apropiado.

El segundo paso en la construcción de un gen quimérico es la selección de un promotor transcripcional apropiado, sobre todo porque hay genes de virus de plantas que no contienen promotores capaces de transcribir en cromosomas de plantas. De entre los promotores que han sido usados para controlar los genes CP en plantas el más efectivo es el p53S. Este deriva del CaMV donde dirige la síntesis de RNA-35S durante la infección. Se han construido e introducido el gen CP del geminivirusvius del mosaico dorado del tomate (TGMV) en plantas de Nicotiana benthamina en las cuales el ORF AL1 fue transcrito bajo el control del promotor 35 S del CaMV. Las plantas transgénicas expresan la proteína AL1 funcional y muestran replicación de la doble hebra del DNA del TGMV en presencia de proteínas del hospedador.

Los promotores débiles, como el promotor P19S del CaMV, pueden ser utilizados cuando se incorporan varias copias del gen quimérico durante la transformación. Un gen CP quimérico del virus del mosaico de la alfalfa (A1MV) dirigido por el P19S confiere resistencia frente a la infección de A1MV cuando 2 loci son expresados en plantas, pero no cuando sólo se expresa uno. Además, plantas de tabaco conteniendo el ORF de la proteína de la cubierta del TMV bajo el control del P19S acumulan poca cantidad de proteínas de la cubierta y no son resistentes a la infección. Por todo esto la adquisición de un promotor de la transcripción adecuado es especialmente importante para conseguir la resistencia mediada por proteínas de la cubierta.

Importancia de la secuencia en 3’.

El tercer componente en la  construcción genética es la región de la  secuencia de poliadenilación. Para la construcción de  genes quiméricos han sido usadas secuencias a partir de CaMV,  de genes de proteínas de almacenamiento, de genes regulados  por la luz y el de la región del T-DNA del plásmido Ti  de Agrobacteriumtumefaciens.

Planta  de tabaco

Selección de plantas transformadas.

Probablemente uno de las tareas más difíciles de realizar en la obtención de plantas resistentes a virus es la selección y modificación de plantas transformadas con el gen correcto. Por ejemplo, muchas de las plantas resistentes son producidas por el sistema de Agrobacterium; una de las razones principales para ello es que muchas veces las plantas responden bien a este sistema de transformación. Generalmente, las plantas transgénicas son seleccionadas basándose en la presencia de la resistencia a nopalina. Sirva como ejemplo un fragmento de cDNA que codifica par la inclusión citoplásmica del virus de las venas moteadas del tabaco. Fue insertado en un cassette de expresión en plantas de un vector basado en el plásmido Ti. El vector fue transferido a Agrobacterium tumefaciens, el cual fue usado para producir plantas transgénicas. Posteriormente se hizo un confirmación de que las plantas estaban realmente transformadas utilizando test bioquímicos. El análisis del RNA Poli A de las plantas transcritas revela que un nuevo RNA de aproximadamente 2100 nucleótidos que posee la secuencia del virus. También la inmunoprecipitación de los extractos de proteínas revelan el correspondiente polipéptido. Sin embargo, en ciertas situaciones es difícil de transformar la planta, especialmente en cereales, donde las plantas diana son difíciles de transformar y/o regenerar. Para estos estudios es necesario utilizar un sistema modelo como el del tabaco.

Detección de la protección mediada por proteínas de la cubierta y sus características.

Ejemplo de planta de tabaco transformada con el gen de la luciferasa. Puede observarse que la expresión del gen no es igual en todos los tejidos.

La evaluación de la resistencia a la enfermedad implica la inoculación con virus de plantas que expresaran el gen [CP(+)] y aquellas que no o hacen[CP(-)] y la comparación del número de lugares de infección y el desarrollo de síntomas de la infección.

Se estudia la resistencia tanto en las plantas transformadas como en su progenie. Por lo general se prefiere que las plantas estudiadas sean lo más similares posible tanto en edad, estado de desarrollo como los demás parámetros físicos. La segregación de los genes introducidos puede ser seguida mediante anticuerpos contra las proteínas de la cubierta o siguiendo la expresión de un gen testigo en las sucesivas generaciones de plantas transformadas.

Se usan anticuerpos para la determinación cuantitativa o semicuantitativa de partículas víricas tanto en extractos crudos como purificados. Los anticuerpos se realizan contra las proteínas de la cubierta. Por lo general se unen a compuestos fluorescentes para su localización, por ejemplo el isocianato de fluoresceina (FITC). También se pueden unir a enzimas, como la fosfatasa alcalina (ELISA: inmunoensayo unido a enzima).

Sin embargo, los viroides son diferentes a los virus, aunque pueden causar enfermedades parecidas a las de estos. Solamente son moléculas de RNA simple, normalmente de un tamaño de 200-400 nucleótidos, que no poseen proteínas de la cubierta. Los viroides no pueden ser localizados por técnicas inmunológicas, además, su genoma no se traduce, por lo tanto no podemos buscar productos antigénicos. Solamente se pueden utilizar las técnicas de hibridación de ADN. Se utiliza el genoma como sonda, marcado tanto radioactiva como no radioactivamente. La técnica es muy específica y sensible. Los filtros de nitrocelulosa o nylon, en los que se extrae el DNA, pueden ser lavados y reutilizados o ensayados para detectar la presencia de diferentes viroides o virus.

ELISA: A) indirecto. B)Birecto. El marcador el una enzima detectable.

Desarrollo de los síntomas de la enfermedad en plantas CP(+) y CP(-).

En varias de los ejemplos de resistencia mediada por proteínas de la cubierta se manifiestan diversas características. En primer lugar, hay pocos sitios donde ocurra la infección en las hojas inoculadas. Pueden llegar a producirse el 95-98% menos lesiones necróticas locales que en las plantas CP(-). La expresión de proteínas de la cubierta del virus causan la reducción de los sitios donde la infección puede llegar a ocurrir tras la infección.

Una segunda manifestación de resistencia es la reducción del grado se infecciones sistémicas que se producen en las plantas CP(+). Como desarrollan menores síntomas de la enfermedad tienen menos probabilidades de que esta se extiendo por toda la planta.

Una tercera manifestación es la menor acumulación de virus en las plantas CP(+) comparadas con las CP(-). La cantidad de virus acumulados se identifica mediante ELISA o inmunoblots. En plantas inoculadas con proteínas de la cubierta del TMV se han encontrado menos del 30% de los virus en comparación con las plantas CP(-) infectadas. Además, la incorporación de virus a las hojas jóvenes está inhibida en gran medida. Las plantas transgénicas que expresan proteínas de la cubierta de los virus CMV, PVX y PVY(virus Y de la patata) acumulan muchos menos virus, o incluso ninguno, tras la infección correspondiente. La pérdida de síntomas visuales de la infección generalmente se relaciona con la reducción de la acumulación de virus. En los casos en los que no hay acumulación de virus tras la inoculación las plantas pueden considerarse resistentes a la inoculación en las condiciones del test.

Factores que afectan a la resistencia a virus en plantas transgénicas.

Concentración viral del inóculo

Normalmente todas las manifestaciones de resistencia pueden ser superadas mediante la inoculación de concentraciones crecientes de virus. Las plantas CP(-) producen los síntomas de la enfermedad cuando se inoculan con 0.01mg/ml de TMV En plantas transformadas CP(+) se retrasa10 días la expresión de los síntomas tras la inoculación de 0.4mg/ml de TMV con respecto alas plantas CP(-). Sin embargo, sólo hay 1 o 2 días de retraso cuando las plantas se inoculan con 2.0mg/ml de TMV. A medida que se aumenta la concentración del inóculo se reduce la proporción de plantas CP(+) que escapan a la infección. En contraste, la resistencia mediada por proteínas de la cápside produce inmunidad contra los virus A1MV, PVX, PVY y TEV (Tobacco etch virus) incluso con concentraciones de inóculo de 50mg/ml.

Naturaleza de la planta hospedadora.

El número de plantas en las que se ha desarrollado protección mediada por proteínas de la cubierta es muy limitado. Se han usado el tabaco como organismo modelo en muchas ocasiones. Se ha preferido transformar aquellas plantas que son susceptibles a infección por A. tumefaciens y su regeneración posterior es razonablemente fácil.

Raíz infectada por Agrobacterium

Resulta difícil extrapolar los resultados de la protección mediada por proteínas de la cubierta de una planta a otra de diferente especie porque entre ambas puede haber desigual sensibilidad a la infección por el virus.

No hay estudios específicos sobre el efecto que puede tener la variación en el huésped sobre la protección. Los resultados obtenidos hasta la fecha parecen este podría ser un factor importante. Por ejemplo, plantones jóvenes de tabaco que expresan la proteína de la cubierta del TMV tienen protección durante 3-5 días contra la inoculación de 1mg/ml, sin embargo, las plantas de tomate resisten 20 o más días de inoculación con 20mg/ml de TMV. Las plantas transgénicas de tomate y tabaco responden de manera diferente concentraciones elevadas. Sin embargo, la expresión de un gen CP del A1MV en tabaco o en tomate confiere niveles comparables de resistencia contra A1MV en ambos tipo de plantas.

También debe haber diferencias entre el grado de protección alcanzado por la misma CP en 2 cultivares distintos.

Condiciones de crecimiento y de resistencia de la planta.

Las condiciones de cultivo (luz, humedad, temperatura, riego, nutrición) antes, durante y después de la infección pueden tener profundos efectos en la susceptibilidad de las plantas el desarrollo de la infección. Muchos de los ensayos que han tenido lugar hasta ahora han sido realizados en invernadero o bajo condiciones de crecimiento controladas. Sin embargo, cuando las plantas transgénicas son cultivadas en el campo están expuestas acondiciones ambientales cambiantes. Es importante evaluar los efectos de los factores ambientales, unidos a la eficiencia de la protección por proteínas de la cubierta.

Las plantas de tomate que expresan el gen CP retienen su resistencia al TMV en las condiciones de cultivo de campo aunque el nivel de proteínas de la cubierta descendió ligeramente, comparado con los resultados de invernadero.

Otros investigadores demostraron que la resistencia de plantas de tabaco, poro no las de tomate, expresando el gen CP del TMV es dependiente de la temperatura. Bajo condiciones de elevada temperatura (30-35ºC) hubo una reducción en los niveles de CP y en la protección por proteínas de la cubierta contra el TMV. Sin embargo, las plantas de tomate retiene gran resistencia al virus a pesar de que los niveles estas proteínas también disminuyen al aumentar la temperatura. Las plantas transgénicas cuya temperatura de crecimiento es desplazada de los 55ºC a los 22ºC acumulan niveles normales de proteínas de la cubierta en varias horas. Plantas transgénicas de tabaco inoculadas y mantenidas en ciclos día/noche de 35/25º retienen la resistencia a la infección por el TMV.

Par explicar la baja concentración de proteínas de la cubierta a elevada temperatura se argumenta la poca estabilidad de la CP del TMV. En contraste, no hay cambios en la concentración de la del SMV de plantas transgénicas bajo condiciones de alta temperatura. Se necesitan más estudios para evaluar el efecto de las condiciones de crecimiento en la eficiencia de la protección mediada por proteínas de la cápside. Es más, como las condiciones fisiológicas de las plantas cambian continuamente durante el ciclo de desarrollo, la susceptibilidad a la infección también puede cambiar.

Especificidad de la protección mediada por CP.

La expresión de proteínas de la cubierta de un grupo de virus no confiere protección efectiva contra las de otro grupo. Por ejemplo, la expresión de las proteínas de cubierta del virus del mosaico de la alfalfa protege contra el A1MV (protección homóloga) pero no contra el TMV (virus no relacionado). Las proteínas de la cubierta del TMV producen una protección muy limitada contra los virus no relacionados PVX, PVY y CMV. Hay indicaciones de que la protección contra los virus puede ocurrir entre cepas relacionadas y entre virus relacionados (del mismo grupo).

Además, la homología de la secuencia de las cadenas polipeptídicas puede determinar, en parte, el grado de protección obtenido entre varios grupos de virus por la expresión de un único gen CP. Se ha demostrado que la cepa normal (U1) del TMV protege frente a la infección de otra cepa de TMV mucho más severa: la denominada cepa amarilla (PU230).

La expresión de proteínas de la cubierta del SMV en tabaco confiere una significativa protección contra la infección de otros 2 polivirus: TEV y PVY incluso aunque el SMV no es patógeno para el tabaco. El TEV muestra un 62% y el PVY un 58% de homología con la secuencia del SMV.

Como resultado de algunos experimentos se conoce que el gen para proteínas de la cubierta confiere resistencia contra 4 tobamovirus que muestran diferentes grados de homología en su secuencia de aminoácidos. Esta homología varía entre el 62% y el 80% con el TMV. Produce una débil protección contra el RMV (ribgras mosaic virus), el cual muestra sólo el 45% de homología en la secuencia de aminoácidos de su proteína de la cápside. Por tanto, es posible algún tipo de protección heterogénea mediada por proteínas de la cubierta entre miembros de un mismo grupo, siempre y cuando exista algún grado de homología de la secuencia de aminoácidos(quizás el 60%). Esta característica puede ser de gran valor para la utilización de la protección mediada por proteínas de la cubierta en agricultura. La expresión de la proteína de la cubierta adecuada podría producir protección contra múltiples virus del mismo grupo.

No está claro si es más importante que la secuencia tenga uno homología elevada con la de la proteína expresada por la planta o si es preferible que adopte una conformación tridimensional similar.

BIBLIOGRAFÍA.

Rup Lal & Sukanya Lal. (1993)Genetic engineer of plants for crop improvement. Editorial CPC Press Inc. Capítulo 4. Pag 117-163.

Glazer, Alexander N. & Nikaido, Hiroshi. Microbial Biotecnology. (1995). Editorial Freeman.

Madigan; Martinko; Parker. (1997). Brock Biología de los microorganismos. 8ª edición. Editorial Pentice-Hall.

Alberts, Bruce; Bray, Dennis; Lewis, Julian; Raff, Martin; roberts, Keith & Watson, James D. (1992). Bilogía molecular de la célula. 2ª edición. Editorial Omega.

Rawn, J. David. (1989). Bioquímica. Editorial McGraw-Hill. Vol I y II.

Mathews & van Holde. (1998). Bioquímica.2ª edición. Editorial McGraw-Hill·Interamericana.

Lewin, Benjamin. (1994) Genes.2ª Edición. Editorial Reverté.