Aplicada a la Producción Agrícola BIOTECNOLOGÍA

Judith Verónica Toledo Espinoza

2006

INDICE

I. Introducción

II. Historia de los Cultivos de Tejidos

III. Concepto de Clonación

IV. Medios de Cultivo

V. Hormonas Vegetales

VI. Estructura Básica del Laboratorio

VII. Condiciones de asepsia en el Laboratorio

VIII. Métodos de Propagación in vitro

1. Introducción in vitro

2. Micropropagacion in vitro

3. Métodos de conservación in vitro

4. Erradicación de virus por cultivo de meristema y termoterapia

IX. Otros Métodos Biotecnológicos

1. Variación Somaclonal

2. Mutación inducida

3. Producción de Plantas homocigóticas

4. Producción de Protoplastos

5. Hibridación somática

6. Introducción de genes foráneos por Ingeniería genética

X. Reducción de Costos en el Manejo de Laboratorio

I. Introducción

En 1861 Gregorio Mendel descubrió que las plantas al hibridizarse daban lugar a una progenie con características seleccionables y cuantificables, pero es hasta 1900, cuando los investigadores redescubrieron la teoría y dieron inicio a lo que seria el mejoramiento genético de las plantas, es decir la producción de nuevas variedades por la combinación de sus genes.

La ciencia se desarrolló en sus inicios con el objeto de conocer la naturaleza y sus fenómenos, pero luego de este descubrimiento, los científicos pudieron concebir la posibilidad de cambiar el orden natural de la materia viva y manipularla de acuerdo a sus necesidades. La posibilidad de producir plantas resistentes a enfermedades, con mayores rendimientos, precoses, y resistentes a sequías se hacia evidente por la manipulación de las cruzas de la plantas.

La biotecnología Vegetal nace a partir de esta concepción, el desarrollo de nuevas variedades, manipulando el medio ambiente que las rodean y su fisiología. Aunque el concepto de biotecnología también se ha extendido en áreas aplicadas a la Salud Humana, procesamiento de alimentos, animales, industria y medio ambiente, este tuvo su origen en las plantas.

En 1919 una publicación con el titulo de “Biotechnologie”, describe la concepción inicial de esta manera:

“Es necesario reorganizar la producción de alimentos......en el ámbito de las ciencias naturales.....Si el productor, el fisiólogo, y el bioquímico toman control de la producción de alimentos, y si ellos son capaces de abrir los tesoros de la naturaleza, entontes, esto podría promover la prosperidad de crear en inconcebibles dimensiones, lo cual podría llamarse en la prosperidad el inicio de una nueva era de abundancia. Para crear esta edad de la bioquímica (biotecnología) .......solo es cuestión de decisión.” Ereky 1919

En estos términos, la biotecnología se iniciaba bajo el concepto de mejorar e incrementar los alimentos ya existentes.

Transfiriéndonos mentalmente hacia esos años, podemos visualizar los problemas grandes de alimentación que existían, en las ciudades cosmopolitas no llegaban los alimentos como en sus lugares de producción, los medios de transportes existentes eran lentos, por lo que se deseaba producir todo tipo de alimentos cerca de las áreas de consumo. Esto era muy difícil, no era posible producir trigo o papa en zonas tropicales o en épocas de calor, y viceversa con los cultivos tropicales. Además de los problemas de adaptación se presentaban con pérdidas por enfermedades y plagas. Ante esto eran necesaria acciones inmediatas para mejorar los cultivos.

El mejoramiento genético convencional o producido por medio de cruzas entre dos plantas o parentales se desarrolló con mucho éxito pudiendo obtener plantas con grandes rendimientos, sin embargo, para se exitoso es necesario hacer varias cruzas y pruebas que toman bajo las condiciones de cada cultivo 12 años como mínimo.

Con la biotecnología se pensaba mejorar las plantas adaptarlas, combinarlas y hacerlas mas rendidoras para hacerlas disponibles a los productores en menor tiempo.

Muchos trabajos de investigación han sido desarrollados desde esos tiempos hasta la actualidad y resumiéndolos podemos decir, que se ha hecho casi todo, pero aun no podemos contar con una superpapa con las proteínas necesarias como para alimentar suficientemente a un niño o a un adulto. En nuestro país y en muchos otros pueblos subdesarrollados, es conocido que la papa es el único alimento que no falta en la mesa del más humilde. Por lo tanto, hacia donde se dirigió esta revolución biotecnológica?.

Hemos visto que millonarios esfuerzos han sido desarrollados con el fin de doblegar a patógenos tales como los insectos o herbicidas de tal manera que se ha recurrido hasta la Ingeniería genética para lograr este objetivo. Pero el problema de herbicidas es prioritario para todos?,o es prioridad de los grandes productores de alimentos. Esta es la misma consecuencia de la investigación en el mapeo genético humano, de gran importancia para las empresas farmacéuticas, y se ha involucrado a los investigadores de todo el mundo en una inversión millonaria para terminar con el mapa genético de las enfermedades del hombre, que da información sobre los genes defectuosos involucrados en las enfermedades; en contraste, estas empresas no quieren soltar las patentes que encarecen las medicinas mas necesarias para enfermedades como el Sida y la tuberculosis, indicando claramente que la terapia genética tendrá el mismo rumbo de patentes que las medicinas.

Existen instituciones internacionales, Institutos, Universidades encargados de hacer la ciencia básica que generalmente implica una gran inversión accesible a ellos. La asociación de estas instituciones con sus pares nacionales permitiría un ahorro de inversión en técnicas muy costosas, haciendo posible solo la implementación de los resultados de las investigaciones. Sin embargo esto no es asi, de pronto vemos que se esta desarrollando técnicas muy sofisticadas en casi todas las instituciones nacionales, o es uno de sus objetivos, dejando de lado las necesidades inmediatas de la producción, que es la obtención de semilla resistente, de alto rendimiento, y libre de virus; actividades que fácilmente y con poco costo es posible desarrollar en los laboratorios nacionales.

De todo lo expuesto podemos concluir que la dirección que debería tomar la biotecnología en nuestra realidad es aquella similar a los inicios de su historia que considera el proveer de cultivos mejorados a los productores, haciendo eficiente la agricultura y mejorando la alimentación del hombre.

II. Historia de los cultivos de Tejidos

1756	Henri Louis Duhamel du Monceau, Agrónomo y Enciclopedista	Realizó estudios sobre la circulación de la savia, injertos y cicatrización de las heridas en árboles. Luego de remover un pequeño anillo de la corteza de un olmo, se produjo la formación de una hinchazón en el área de corte que dio lugar a la producción de yemas, este proceso fue el primer indicio de regeneración de tejidos.
1838	Schleiden ( en plantas ) y Schwann (1839 en animales)	Consideraron que las células son capaces de autonomía y son totipotentes (Teoría Celular) Sin embargo, la teoría fue incapaz de ser probada como seria al multiplicar una simple célula y regenerar una planta completa.
1853	Trécul	Con ayuda del microscopio realizo observaciones de sus experimentos en callos producidos en las cicatrices de árboles, estos callos provenían del cambium, del floema y de los rayos medulares del xilema.
1878	Vöchting	Encontró que la porción superior en explantes de Brassica se producía yemas mientras que en la porción inferior del explante se producían callos y raíces, manifestando cierta polaridad en le desarrollo de los fragmentos. Además haciendo injertos entre varios fragmentos determino que el comportamiento de un tejido no era alterado por la presencia de otro.
1880 y 1882		Se considero la existencia de sustancias que regulaban la formación de órganos y se encontraban polarmente distribuidos.
1885	Salkowsdi	Aisló el 3 indolacetic acid, pero sus propiedades no fueron conocidas.
1893	Rechinger	Determinó el mínimo tamaño del explante capaz de multiplicarse, usando pequeñas piezas de tejidos de plantas leñosas y herbáceos colocándolas en mezcla de suelo. Encontró que piezas de 20 mm podrían producir yemas y regenera plantas, pero n o las piezas de 1.5 mm correspondiente a 21 capas de células. Sin embargo, no se considero que en esta porción debía de tener tejido vascular.
1902	Haberlant (botánico aleman)	Determinó la asepsia en cultivo de células en un medio artificial, pudiendo mantener grupos de células por varias semanas, que se alongaban y que sintetizaban almidón (células diferenciadas) pero que no dividían.
1904 hasta 1907	( Hanning, 1904; Stingl, 1907; Buckner y Kastle, 1917; Andronescu (1919); y Dietrich, 1924),	En fueron años de mayor producción científica con relación al crecimiento in vitro de embriones (extraídos de semillas) desde sus estadios iniciales de formación. Posteriormente, los investigadores mejoraron los procedimiento establecidos.
1908	Simon	Estudió el fenómeno de polaridad y siguiendo con los experimentos de Vöchting, invirtió los segmentos de posición, provocando una alteración de la expresión de la polaridad pero no tuvo resultados contundentes.
1907 Harrison, Burrows (1910) y Carrel (1912)		Se inicio con éxito en el cultivo de células animales creciendo en soluciones conteniendo sangre, plasma o jugo de embriones y equivalentes químicos. Muchos investigadores continuaron sus intentos en células vegetales sin éxito por ausencia de división celular.
1917	Bobiliof-Preisser	Realizaron experimentos en plantas de Viola, Thunbergia y otras plantas.
1918	Lamprecht	Colocó pedazos de hojas en heridas producidas en la misma planta y las células se dividieron.
1919	Knudson	Trabajó en células de raíz.
1922	Kotte	En Alemania y Robbins en Estados Unidos postularon simultáneamente que el cultivo de tejidos era más viable si el explante inicial eran ápices de raíces o de yemas. Kotte cultivo puntas de raíz de Arvejas y Maíz en soluciones desarrolladas por Knop. Estas soluciones contenían sales, glucosa , compuestos nitrogenados como: Asparagina, alanina y extracto de carne.
1922	Robbins	Obtuvo las primeras plantulas a partir de crecimientos de yemas de algodón y alverja
Chamber, Mayer en 1923; Dauphiné (1929) y Scheitterer (1931)		trataron de cultivar raíces pequeñas sin éxito
1924	Thielman	Estudió a las células estomáticas
1926	Börger	En dicotiledóneas, y pteridofitas
1926	Went	Descubrió la acción de la auxina como promotor de la división celular.
1926	Czech	Disoció las células con cloruro de magnesio y la transferían a medios con extractos de tejidos vegetales, pero estos no se dividieron
1928	Kemmer	Trabajó en hojas de epidermis de Rheo discolor.
1928	Ulehla	trabajo en Cactus observando algunas divisiones celulares, creciendo en un gel como soporte, en lugar medios líquidos
1929	Schmucker	reporto la división de células de mesófilo de Bocona en un medio con extractos de hojas, sin embargo, estos experimentos no pudieron ser repetidos durante 30 años y fueron bastante discutidos por los investigadores incluyendo a White (1942) mientras se reportaba la toxicidad de los extractos de tejidos, jugos de savia, exudados de floema, etc.
1931	Pheiffer	usó células de frutos frescos
1933	White	Realizó experimentos en meristemo de Stellaria media sin mucho éxito.
1934	White	Publicó sus resultados al obtener subcultivos de células de raíces de tomate los cuales crecían indefinidamente. En sus estudios encontró que raíces de tomates infectados con virus mantenían las porciones meristematicas libres de virus.
1934	Gautheret	Obtuvo el crecimiento de células a partir de explantes de cambium y floema de árboles, produciendo callos en la superficie de los explantes que crecieron durante 6 meses luego del cual ceso la actividad, aparentemente por deficiencia de los minerales contenidos en el medio.
1934	Kögl	Estableció que AIA era la sustancia de crecimiento previamente descubierta por Went.
1934	White	Observo que las plántulas iniciadas a partir de meristemo no contenían los virus de la planta original
1937	Robbins y Bartley, White	Estudiaron la función de los componentes de los medios de cultivo como: extracto de levadura, reconocido posteriormente como principal fuente de tiamina
1938	Giolli	verifico los resultados obtenidos por Gautheret
1939	White	anuncio la posibilidad de cultivar células vegetales por periodos ilimitados, al regenerar yemas a partir de callos de tabaco
1939	Nobécourt	en tejidos de híbridos de Nicotiana y Gamborg (1939) en tejidos de zanahoria
1940	Blakeslee	Trató de obtener híbridos de Datura, pero el embrión moría después de un breve desarrollo, suponían que era debido a sustancias toxicas que rodeaban el óvulo por lo que debía ser cultivado fuera de su ambiente natural.
1940	Conklin y Van Overbeek	Sugirieron que el liquido de endospermo conocido como leche de coco seria un buen medio de cultivo para embriones, obteniendo buenos resultados con el crecimiento de embriones de Datura
1942 Gautheret, 1937 Nobécourt		Fue propuesta la Solución de Knop, primer medio de cultivo
1943	White	Propuso un medio conteniendo glicina,ácido nicotínico, tiamina y piridoxina, en cultivo de callos. El medio base fue el medio de knop
1945	Loo	Obtuvo excelentes cultivos de yemas de espárrago
1946	Ball	Publicó un articulo indicando que la porción del meristema de la yema que era capaz de orinar una planta completa y la porción de la planta que generaba callos.
1946	Hildebrant	Propuso un medio con altas concentraciones de Sulfato de Sodio
1948	Caplin y Steward	Trabajaron con explantes de zanahoria en cultivos con leche de coco; Encontraron un crecimiento mas activo que lo observado con auxina.
1948 al 1952 Caplin y Steward		Encontraron efectos similares a la leche de coco en extracto de albúmina de maíz , trigo, avena y centeno.
1949	Limasset y Cornuet	Verificaron los resultados de White en la erradicación de virus a partir de cultivo de meristemo de tomate extraídos de plantas infectadas de virus
1951	Riker y Hildebrant	Consideraron importante el uso de derivados del carbón, compuestos nitrogenados y reguladores de crecimiento como nutrientes necesarios en el crecimiento de callos
1950	Morel	Usando un medio enriquecido con leche de coco produjo el crecimiento indefinido de varias monocotiledóneas y helechos.
1951	Duhamet	reporto que la leche de coco mejoraba el desarrollo de callos y estos no eran estimulados normalmente por la auxina.
1951	Wetmore y Wardlaw	regeneraron plantas a partir de yemas apicales que median de 100 a 250 um de longitud con 1 o 2 primordios foliares.
1952	Street	Determinó la importancia de los agentes quelantes
1953 Bürstom, 1954 Hannay y Street, 1941 Boll y Street		Determinaron la importancia de las sales minerales en medios completamente sintéticos, entre las cuales eran imprescindibles la presencia de Cobre, Manganeso e Iodo
Ball, Henderson 1952, Nickel, La Rue 1953, Reinert y White 1956		Luego del descubrimiento de la importancia de las auxinas en el cultivo de callos, se lograron muchos cultivos con buenos resultados.
1953	Heller	Dirigió un estudio muy profundo en nutrición mineral en tejidos de zanahoria, incrementando las concentraciones de sales, dos veces mas a las propuestas por White y Gautheret
1953	Muir	Desarrollo la técnica de células aisladas colocadas en pequeños cuadrados de papel sobre cultivos ya establecidos, estos cultivos les proporcionaban nutrientes y reguladores para su crecimiento
1957	Skoog y Miller	En estudios con extractos encontraron un derivado de adenina, la 6-furfuril aminopurina conocida como kinetina, que en presencia de AIA producía proliferación de células y la formación de yemas. Este es un trabajo considerado como clásico porque clarifica la interrelación entre las auxinas y las citoquininas en el control del enraizamiento y regeneración de yemas.
1958	Thiman	Estudio el efecto de las hormonas y contribuyó mucho en el progreso de los cultivos de tejidos.
1959	Sheat	Obtuvo la información sobre los efectos de los iones amonio y los aminoácidos
Torrey (1957), Jones (1960)		Suspendieron células aisladas en una gota de solución en una microcamara.
1959	Bergmann	Inicio cultivo de células en suspensión de tabaco y soya partiendo de células que se dividían activamente, pudiendo mantener un 20% de su división celular.
1960	Bergmann	Separó simples células por filtración y los mezclo luego con agar disuelto, plaqueando las células en una placa petri, Obtuvo una capa delgada de células que se dividían profusamente.
1960	Cocking	Removió la pared celular con preparaciones purificadas de celulasa y pectinasa, regulando, además, la expansión celular con osmosis externa
1961	Miller	Encontró una sustancia con propiedades similares a la kinetina en Maíz, lo llamó Zeatina.
1961	Quack	Indujo el enraizamiento de yemas obtenidas a partir de meristemo libres de virus
1962	Murashige y Skoog	Estudiaron los requerimientos de tejido de tabaco y propusieron una solución mas concentrada a las clásicas formulas, incrementando cinco veces mas el crecimiento en contraste con otros medios. El medio MS se caracteriza por la presencia de grandes cantidades de Nitratos e iones Amonio.
1964	Morel	Propagó orquídeas a partir de cultivo de yemas.
1965	Vasil y Hildebrant	Demostraron que una simple célula puede dividirse y dar lugar a una planta completa (Totipotencia)
1967	Margara	Incremento las concentraciones de nitratos en 50% a los de MS para inducir la floración.
1969	Rossini	Usando células de hojas de calystegia sepium logro producir la multiplicación de células en suspensión con la ayuda de la adición de 2,4-D y Benzyladenina

Primera Reunión IAPTC internacional

Fig1. Dr. Folke K. Skoog, contribuyente a los descubrimientos en la formulación de medios de cultivo (izquierda), y (derecha) la primera reunión de la Asociación Internacional de Cultivadores de Tejidos (IAPTC)

III. CLONACIÓN

Durante la mitosis una célula duplica su ADN y organelas, se divide y forma dos células idénticas. Si cada una de estas células se separan y regeneran a una planta, las dos plantas obtenidas serán denominadas clones, porque todas sus características genotípicas y fenotípicas serán exactamente iguales.

Cada célula de una planta es capaz de regenerar a una planta completa (Teoría de la Totipotencia), es posible obtener plantas a partir de células de raíz, tallos, hojas, y aquellas plantas obtenidas a partir de estas partes serán denominadas clones. No solo las células al regenerar producen clones, también porciones de tejido como meristemo, yemas, nudos, esquejes, estacas, etc.

Cuando una planta es cortada en pedazos y de cada uno de esto regenera una planta, todos ellos serán denominados clones. Estas plantas obtenidas tendrán las mismas características en forma de flor, hojas, tallos, crecimiento, etc.

La clonación es importante porque se pueden obtener plantas idénticas en grandes cantidades, y es necesaria en la agricultura para la obtención de productos de igual calidad agrícola.

Es posible clonar plantas en invernaderos a partir de esquejes, o en laboratorio a partir de yemas o nudos.

La clonación en laboratorio o in vitro proporciona las siguientes ventajas:

v Es posible multiplicar miles de plantas en un espacio pequeño (laboratorio)

v La propagación in vitro implica el mantenimiento en condiciones asépticas

v Las condiciones ambientales son monitoreadas, y es posible propagar durante todo el año, sin importar el clima exterior.

v Es posible de ser distribuidas en pequeños paquetes a lugares distantes.

v Es considerado un material de buena calidad sanitaria y es fácilmente transportado de país a país sin restricciones.

v La erradicación de virus solo es posible por medio de procedimientos in vitro,

v Es posible conservar in vitro muchas plantas o variedades concentrados en Bancos de Germoplasma

v Las plántulas pueden ser transferidas a invernadero, donde recuperan su tamaño y crecimiento normal.

Estructura de una Planta:

Las plantas se diferencias entre Monocotiledóneas y Dicotiledóneas. La descripción que se presenta se refiere a una dicotiledónea, la papa, Solanum tuberosum.

Entre las partes mas resaltantes, tenemos a las flores en forma de inflorescencia, los foliolos de la hojas compuestas, el fruto, el tallo, los tubérculos, los estolones, el brote de tubérculo.

En una planta las partes vegetativas, es decir, a partir del cual se podrá propagar una planta son aquellas que contienen al menos un nudo. Dependiendo de su capacidad para enraizar, se cortan porciones de tallo conteniendo más de dos nudos, estas porciones de tallo se conocen como esquejes, y estos dan lugar a una planta.

La propagación a partir de un esqueje es considerada un clon y a esta forma de multiplicación se le conoce como propagación vegetativa. No todas las plantas pueden propagarse por esquejes.

Figura 2. Estructura básica de una planta

Estructuras vegetativas, las yemas y meristemo

Las yemas de una planta son aquellas que al crecer da lugar a una rama, o si es una yema apical produce el crecimiento en altura de la planta. Estas yemas también llamadas EXPLANTE tienen la característica que al ser sembradas en un medio de cultivo van a dar lugar a una planta completa con mayor rapidez que otro tipo de tejido.

La Introducción de la yema o meristemo al medio de cultivo estéril es realizado por medio de la desinfección del explante con cloro activo, en forma de hipoclorito de sodio (lejía) o hipoclorito de Calcio. Este procedimiento es conocido como Introducción in vitro y es desarrollado en el interior de un ambiente desinfectado: la cámara de flujo laminar.

Figura 3. Esqueje con una yema

Los nudos, yemas o meristema desinfectadas son colocadas en medios de cultivo estériles y mantenidos en un ambiente adecuado de crecimiento.

En el interior de esta yema se encuentran varios foliolos y en el interior de ellos una porción que es conocida como el meristemo.

El meristemo es una porción de la yema que no se encuentra vascularizado, sin embargo, contiene numerosas células en continua multiplicación, las cuales si son extraídas y colocadas en un medio de cultivo adecuado, producirán una planta.

Figura 4. Foto y figura de un meristemo

Al no ser vascularizado, es posible de que algunos patógenos como virus y bacterias no puedan llegar a este tejido por medio de los vasos conductores. Por lo cual al regenerar la plántula a partir de este tejido se puede obtener una planta libre de virus.

Los virus infectan a las plantas produciendo muchos daños que van desde pequeñas manchas en las hojas hasta la producción de sintomatología sistémica con al consecuente reducción de crecimiento y muerte en algunos casos. No existe ningún compuesto que pueda eliminar a los virus que infectan las planta. La única forma de obtener una planta libre de virus es a través del cultivo del meristema y su regeneración a una planta completa.

El meristema tiene una dimensión de pocos milímetros, y su extracción no es fácil, sin embargo con el apoyo del microscopio estereoscópico que provee una ampliación de imagen y la práctica es posible su extracción.

Algunos métodos como la quimioterapia (el uso de compuestos químicos que reducen la multiplicación de los virus) y la termoterapia (el uso de altas temperaturas que impiden la reproducción de los virus en el interior de la célula) son utilizados previamente al corte del meristema. Estos procedimientos reducen la concentración de virus altamente infectivos y favorecen la efectividad en la limpieza de virus.

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Figura 4. Foto y figura de un meristemo