Manual Práctico
Judith Verónica Toledo Espinoza
2006
INDICE
1. Diseño de laboratorios
2. Equipos y Materiales
3. Preparación de medios de cultivo
4. Esterilización de medios de cultivo
5. Preparación de soluciones: hormonas y vitaminas
6. Técnicas de propagación
a. Introducción in Vitro
b. Propagación in Vitro: Clonación
7. Reducción de costos
8. Lista de materiales, equipos y reactivos, presupuestos (Perú, 2006)
9. Formulaciones de medios de cultivo:
a. Rosa, Rosa híbrida
b. Anturios, Anthurium sp
c. Clavel, Dianthus caryophyllus L.
d. Papa, Solanum tuberosum
e. Camote, Ipomoea batata
f. Alcachofa, Cynara sculenta
g. Caña de azucar, Sacharum oficinalis
h. Banano, Musa sp
i. Fresa, fragaria sp
j. Orquideas
k. Stevia, Stevia rebaudiana
l. Frijol, Phaseolus vulgaris
m. Azucena, Lilium japonicum
n. Duraznero, Prumus persica
o. Lirio, Iris xiphium
p. Helecho, Pteridium aquilinum
q. Espárrago, Asparagus racemosus
r. Apio, Apios americana
s. Bambú, Dendrocalamos strictum
t. Caña de azucar silvestre, Saccharum sp
u. Eucalipto spp, Eucalyptus ficifolia
v. Fresia, Fressia spp
w. Gerbera, Gerbera aurantiaca
x. Granado, Punica granatum
y. Hortensia, Hydrangea macrophylla
z. Manzano, Malus spp
aa. Narciso, Narcissus tazetta
bb. Baunia, Bauhinia purpurea
cc. Guanábana, Anona muricata
dd. Pino, Pinus sylvestrias
ee. Begonia, Begonia rex
ff. Castaña, Castanea sativa
gg. Cerezo, Prunas avium, Prunas cerasus
hh. Caoba, Swietenia macrophylla
PRIMERA PRÁCTICA
DISEÑOS DE LABORATORIO
Los laboratorios de biotecnología son diseñados en base a la capacidad de producción, es decir, por el número de plantas que se pueden mantener en el cuarto de cultivo.
En general las habitaciones que se destinan en los laboratorios son los siguientes:
1. Oficina
2. Cuarto de lavado
3. Cuarto de preparación de medios
4. Cuarto de Transferencia
5. Cuarto de cultivo
Estos tienen un orden de menor a mayor consideración de asepsia y restricción de ingreso para evitar la contaminación de las plantas.
Estas habitaciones tienen como base el diseño siguiente:
El diseño indica la asepsia y restricciones de ingreso de menor a mayor, desde el ingreso hasta el último cuarto que es el área de cultivo.
Estas restricciones permiten evitar el ingreso de polvo, y principalmente los ácaros que producen mucho daño en los cultivos in Vitro.
Tener presente que las plantas in Vitro crecen en medios de cultivo con azúcar y sustancias fáciles de contaminar. Cuando los frascos tienen una abertura o por efecto del intercambio gaseoso de las plantas se puede producir ingreso de aire exterior al interior de la botella. Este ingreso de aire puede ser limpio y aséptico, sin embargo si hay descuido en la limpieza puede haber polvo o contaminación que ingresa a los frascos contaminándolos. La contaminación generalmente es producida por hongos, pero también pueden ingresar ácaros produciendo enormes daños a los cultivos. Las plantas contaminadas no pueden crecer y finalmente mueren.
Otros diseños en base a este diseño básico se presentan a continuación:
DISEÑO DE LABORATORIO PREPARADO PARA EL INSTITUTO VALLE GRANDE, CAÑETE – PERÚ
Este diseño ha sido desarrollado en una extensión de 70 m2. El ingreso se desarrolla por el área de recepción de muestras, hacia donde llegan las plántulas que deberán ingresar al laboratorio para su introducción in Vitro, en esta área se encuentran escritorios o sillas para la atención al personal de invernadero, así como atender a los productores que desean comprar plántulas. En esta área se encuentra un Biotrón o cámara de cultivo, que se puede utilizar como área de cuarentena, cuando llega material de importación, este es un requisito de Senasa, cuando se desea importar material.
El siguiente área es la de preparación de medios y lavado, ahí se encuentran los equipos principales como la autoclave, refrigeradora, balanza, pHmetro, y todos los materiales de vidrio necesarias para la preparación de medios.
A continuación se encuentra el área de transferencia, donde se encuentran las cámaras de flujo laminar, que son los equipos que sirven para propagar las plántulas en esterilidad. El cuarto final del circuito es el cuarto de cultivos, ahí se encuentran estantes de ángulos iluminados para acondicionar el ambiente de crecimiento de las plántulas. En este caso el cuarto de cultivo tiene una vista al pasadizo por medio de unas ventanas herméticas, esto permite que los visitantes puedan ver las plántulas en crecimiento desde el corredor.
DISEÑO DE UNIDAD IN VITRO, CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA, LIMA - PERÚ
En este modelo correspondiente a un Centro de conservación de germoplasma, la capacidad obliga a la utilización de ambientes amplios y varios cuartos de cultivo. En este caso el ingreso se dirige a la recepción desde donde la secretaria comunica al personal de los ambientes internos. La recepción se conecta a una sala de exhibición desde donde se conectan ventanas de los cuartos de cultivo de papa (Potato), permite de esta manera la observación de las actividades y plántulas por los visitantes desde el exterior. Además hay un área de reuniones donde se reúne el personal de todos los ambientes.
El ingreso hacia los ambientes del laboratorio da lugar a un pasadizo que divide el laboratorio en dos, hacia un lado los cuartos de transferencia y cultivo, y al otro lado los cuartos de lavado y preparación de medios.
En este caso hay dos cuartos de cultivo para cada especie, por ejemplo en el caso de papa hay un cuarto de propagación que mantiene las plántulas a condiciones normales de crecimiento: 18 ºC y 3000 lux de iluminación ( 18 horas de luz), y otro cuarto de conservación, en donde las plántulas crecen a condiciones de estrés con la finalidad de retardar el crecimiento: 5 ºC y 1000 lux de iluminación (18 horas de luz).
En el ingreso principal al laboratorio hay una cortina de flujo de aire para eliminar el polvo de las ropas por efecto de la fuerza del aire, al ingresar a los ambientes se debe utilizar mandil. En otros laboratorios se obliga a usar botas de tela y gorros.
DISEÑO DE LABORATORIO DE CIP, SAN RAMÓN
Este laboratorio se encuentra en un área rural muy cercano a los campos de cultivo, las condiciones de asepsia es mucho mayor. El ingreso es por la puerta del lado izquierdo que tiene una segunda puerta a los dos metros del pasadizo. En este pequeño cubículo se encuentran un tapiz en el suelo para limpiar los zapatos, y mandiles colgados para el ingreso. Hacia un lado se encuentran las habitaciones de transferencia y el cuarto de cultivo, y al otro lado el cuarto de lavado y preparación de medios.
En el área de transferencia (transference room) se encuentran tres cámaras de flujo laminar y una computadora. En este caso las plántulas son propagadas y etiquetadas por medio de una base de datos. Las ventanas son herméticas por lo que es necesario un extractor de aire en la puerta para eliminar los vapores tóxicos durante la propagación. Antes de ingresar al cuarto de cultivo (Culture room), se encuentra una antesala con un caño para el lavado de las manos antes del ingreso.
En el cuarto de Preparación de medios ( Media preparation lab) se encuentra la autoclave y el destilador. En el área de lavado (Washing area) se encuentran caños amplios para el lavado de los tubos y frascos así como un área de almacén.
Otro diseño:
El diseño muestra los ambientes en dos habitaciones, con las mismas condiciones de asepsia y restricción en el ingreso, para impedir el ingreso directo de polvo o contaminantes es importante la dirección de la apertura de las puertas, las cuales deben ser opuestas.
Este mismo diseño puede ser realizado usando solo tabiques como separación, pero incrementando la limpieza y restringiendo más el ingreso de personal.
EQUIPOS
Los equipos utilizados en el laboratorio de Biotecnología dependerán de la capacidad de inversión en la implementación. Existen muchos modelos para cada equipo, se recomienda en el caso de laboratorios comerciales iniciar con la compra de equipos básicos e ir implementando poco a poco con mayor número o sofisticación.
Entre los equipos básicos tenemos: la autoclave, el pHmetro o potenciómetro, la balanza, el destilador, y la cámara de flujo laminar o biocámara.
Otros equipos pueden adquirirse para mejorar el trabajo como: el dispensador de líquidos, la microondas, la balanza analítica, el microscopio estereoscópico, el microscopio óptico, cámara digital, el horno, incubadora, el biotrón o cámara de crecimiento o termoterapia, incinerador de instrumentos, computadora e impresora, lavador de pipetas, agitador magnético , aire acondicionado, luz ultravioleta, extractores de aire, cortina de viento y bioreactores.
AUTOCLAVE
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Autoclave vertical Autoclave horizontal
Es un equipo indispensable para esterilizar los medios de cultivo, también se conoce como ollas a presión, pero tener cuidado que es necesario que posea una válvula de seguridad y un lector de la presión interna. Existen diferentes modelos de autoclave, por ejemplo en la figura se observa una autoclave vertical porque la apertura de la tapa esta en la parte superior. En otros casos se encuentran autoclaves horizontales, en donde la apertura se encuentra en la parte frontal del equipo. Son mucho más cómodas y seguras.
Los precios generalmente tienen relación con el volumen y la digitalización del funcionamiento, estos varían desde 18 litros hasta 100 litros, y el costo es desde 300 hasta 5,000 dólares respectivamente.
El autoclavado o esterilización de los medios de cultivo recomiendan 121ºC y 1 a 1.5 libras de presión por 15 a 25 minutos.
El sistema funciona agregando agua en la base de la autoclave, que estará en contacto con la resistencia de la autoclave. Se colocan los medios de cultivo en el interior y se cierra herméticamente. Después de varios minutos, el agua empieza a hervir y genera vapor que se concentra en el interior, por una válvula abierta sale el vapor de aire y se deja salir hasta que el aire frío interior haya salido completamente. Se cierra la válvula de salida y empieza a subir la presión. Para que la presión empiece a subir, se coloca el control de temperatura al máximo, tan pronto llega a 1 libra de presión se baja la manija de temperatura manteniéndola a una temperatura adecuada para mantenerla en una libra de presión interna por 15 minutos. Luego de este tiempo se apaga el control de temperatura y se espera a que enfríe. Cuando se encuentra completamente frío se abre la válvula de presión lentamente para que salga el vapor de aire. Cuando todo el aire se ha eliminado, se procede a abrir la autoclave y extraer los medios estériles. Estos medios son guardados en la refrigeradora hasta su uso o en el cuarto de cultivo en estantes alejadas de las plantas in vitro.
Existen otros métodos de esterilización pero solo retardan o arriesgan el proceso de desinfección.
POTENCIÓMETRO
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El potenciómetro o pHmetro sirve para medir el pH del medio de cultivo, generalmente el pH varía de 5.3 a 6 , dependiendo del cultivo, y es muy importante la exactitud porque variaciones puede evitar la gelificación del medio de cultivo, o la muerte de la planta. Existen muchos modelos y precios, estos varían entre 20 dolares a más de mil dólares.
BALANZA
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Balanza 0.1 a 200 g Balanza analítica 0.001g hasta 100g
La balanza es muy importante para determinar la exactitud de los medios de cultivo. Existen dos tipos de balanza la balanza normal y la analítica. Ambas son importantes en el laboratorio, sin embargo si las soluciones son realizadas a partir de Stocks es posible solo necesitar la balanza normal. Los medios de cultivo que utilizamos en el laboratorio se prepara en base a Stocks que tienen como valor mínimo 0.1g por lo que no es aun necesaria la balanza analítica.
Las balanzas normales varían desde 50 hasta 300 dólares, y las balanzas analíticas son mucho mas costosas desde 500 hasta 3000 dólares.
DESTILADOR
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El agua destilada es la base para la preparación de los medios de cultivo, y la calidad de ésta depende del destilador. Existen diferentes de modelos en el mercado, y son muy parecidos, la inversión para este equipo es desde 1000 hasta 3000 dólares. En Lima, Perú existen empresas que venden agua destilada, y es una gran alternativa para la compra de agua ($ 0.1/litro). Tener en cuenta que el uso del destilador significa gasto de energía y de agua que se elimina para enfriar el condensador.
CÁMARA DE FLUJO LAMINAR
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Cámara rústica Cámara de Flujo laminar
Es importante para el cultivo aséptico de las plantas, este equipo funciona con filtros de 0.2μm de apertura, lo cual le permite filtrar el aire y no dejar pasar ningún tipo de partícula incluyendo bacterias ni hongos.
La cámara tiene un motor que deja pasar aire a través de los filtro y salir hacia el área de trabajo. La mesa de trabajo mantiene todo el tiempo el aire filtrado horizontal funcionando, de tal manera que ninguna partícula del exterior ingrese a la cámara impidiendo la contaminación de las plántulas durante la propagación.
En los inicios de la biotecnología no se contaban con cámaras de flujo laminar en este caso se inició trabajando con pequeñas cámaras cerradas que evitaban el ingreso de aire. En muchos laboratorios no se cuentan con cámaras de flujo laminar y solo se trabaja con biocámaras o cámaras rústicas.
Los costos de las cámaras de flujo laminar varían de 3000 dólares hasta 5000 dólares, en el caso de las biocámaras o cámaras rústicas, pueden adquirirse o construirse desde 100 dólares hasta 400 dólares.
