¡Ú Protoplast preparation

1. Coprinus cinereus Fis^c

1.1. äûô÷ÛÆò¢ ïÈðú (1998. 12. 21)

1.1.1. ØþжÐïÎý & ÛÆò¢ ñÞÝá ¡Ø çíîñ ñé ñÞÝá, çíý­ äûô÷ÛÆò¢ ïÈðú

1.1.1.1. ØþжÐïÎý

ÛãûÜ	ÐïÎýÙ£	Ó¤êÈ(é»Õá)	â¦Õá	ÝáÍÅ
1	Komagome(ÏËçÊ) pipette	10§¢	2	autoclave - 160¡É
2	Silicon cap(pipetteéÄ)	10§¢éÄ	2	autoclave
3	Filtering mesh	108¡­120§­	3	autoclave on funnel

1.1.1.2. ÛÆò¢ - MYG medium

ÛãûÜ	ãËå·Ù£	é»Õá/100§¢	ð²íÂ(100§¢)	ÝáÍÅ
1	Distilled water	100§¢	100§¢	1ó­ ñú׶â©
2	Malt extract	1g	1g	ð¶ã¥Ñ¦Ò® ÜÁη
3	Yeast extract	0.4g	0.4g	ð¶ã¥Ñ¦Ò® ÜÁη
4	Glucose	0.4g	0.4g

¢Ñ 20§¢/100§¢ ¡â-flask

1.1.1.3. ñÞÝá : Øþжô¥×âµÈ ÐïÎý¿Í ÛÆò¢¸¦ ÙíжßÉ¿¡ ³Ö°í í¹èâàÊ lamp¸¦ ÄÑ ³õ¾ÆµÒ

1.1.2. äûô÷ÛÆò¢ ïÈðú - ÙíжßÉ¿¡¼­ íÂåö

1.1.2.1. slant media¿¡¼­ ÛÆå×, ÕÒíúÜÁη ñéÀ̾ú´ø Coprinus cinereus Fis^c culture ÞÅéÄ

1.1.2.2. ïÈðúê« handling

¢Ñ ØþжÇÏ¿© ñÞÝáµÈ MYG liquid media°¡ µé¾îÀÖ´Â ÇÑ ¡â-flask¿¡¼­ ÛÆå×äû 10§¢¸¦ komagome pipetteÀ» ÞÅéÄÇÏ¿© õÎõóÇÏ¿© slant media¿¡ ºÎ¾î ³ÖÀ½

¢Ñ ´Ù¸¥ äûô÷ÛÆò¢¿¡¼­ komagome pipetteÀ» ÞÅéÄÇÏ¿© ÛÆå×äû 5§¢¸¦ õÎõóÇÏ¿© ¾Õ¼­ 10§¢¸¦ »© ³»¾ú´ø ¡â-flask¿¡ ´Ù½Ã ³Ö¾îÁÜ

¡Ø 2ËÁÀÇ ÚãÜÝÀ» êÓÇÏ¿© ô¥×âÇÑ °ÍÀ¸·Î¼­, ãùòõîÜÀ¸·Î´Â ÀÌ·¯ÇÑ Î¦ïïÀÌ ÝÕù±é©Çѵ¥, ÛÆå×äû 10§¢ ±×³É slant¿¡ ³Ö¾îÁØ ý­ îêïáÇÑ Ð¶ô÷¸¦ ¶¼¾î îïÕá äûô÷ÛÆò¢¿¡ ºÎ¾î ³Ö´Â Û°ÛöÀ» ÞÅéÄÇÏ¿©µµ µÊ

¢Ñ `¤¡`ÀÚ·Î ³¡ÀÌ ÈÖ¾îÁø ÛÜÐÝ켸¦ ì¦éÄÇÏ¿© slant mediaÀÇ Ð¶ÞêöµÀ» ºÎµå·´°Ô ±Ü¾î¼­ ËíˬÇÑ Ð¶Þ곪 øàí­ ÔõÀÌ ºÎ¾î³ÖÀº äûô÷ÛÆò¢¿¡ ³ì¾Æµé ¼ö ÀÖµµ·Ï ÇÔ

¡Ø ÀÌ ¶§, ³Ê¹« ±íÀÌ ±ÜÀ» ù±é©´Â ¾øÀ¸¸ç À­ Ý»ÝÂÀ» ºÎµå·´°Ô scanningÇ쵂 ³Ê¹« å°ÇÏ°Ô Çϸé жô÷°¡ ÀüÇô µé¾î¿ÀÁö ¾ÊÀ» ¼ö ÀÖÀ¸¹Ç·Î ׺ëòÇÏ¿©¾ß ÇÔ

¢Ñ komagome pipetteÀ» ì¦éÄÇÏ¿© 5§¢ÀÇ Ð¶ô÷°¡ ³ì¾ÆÀÖ´Â éÁäûÀ» filtering mesh¸¦ ÷×Φ½ÃÅ°¸é¼­ äûô÷ÛÆò¢¿¡ ¿Å°Ü ïÈðúÇÏ°í, ³²Àº 5§¢ÀÇ Ð¶ô÷°¡ ³ì¾ÆÀÖ´Â éÁäûÀ» ¸¶Âù°¡Áö·Î filtering mesh¸¦ Åë°ú½ÃÄÑ ´Ù¸¥ äûô÷ÛÆò¢¿¡ ïÈðúÇÔ

¡Ø 1ËÁÀÇ slant medium¿¡¼­ 2ËÁÀÇ äûô÷ÛÆò¢¿¡ ÛÆå×À» ÇÏ´Â ïÈðúê«À» ¸¸µç °ÍÀÓ

1.1.2.3. äûô÷ÛÆò¢ ß¾¿¡¼­ÀÇ ïÚô÷ÛÆå×(ÛÆå×è®Óø : 30¡É, 231筃 ÛÆå×ãø) - 3ìíÊà ÛÆå×

¡Ø ׳ê«Ë° ÚÏÞÍ°¡ 2ËÁ¸¦ ïÈðúÇÏ°í, ÜâìÑÀÌ 2ËÁ¸¦ ïÈðúÇÏ¿© õÅ äûô÷ÛÆò¢´Â 4ËÁ

1.2. Protoplast preparation ñÞÝá

1.2.1. ØþжÐïÎý ñÞÝá (1998. 12. 22)

1.2.1.1. ØþжÐïÎý ¡Ø Protoplast preparation îñìí¿¡ ¹Ì¸® ñÞÝá

ÛãûÜ	ÐïÎýÙ£	Ó¤êÈ(é»Õá)	â¦Õá	ÝáÍÅ
1	á³û¡ ãËúÐη(ÐÞîû)	íþ : 10cm	3	ËëæðØþж, 1ËÁ´Â çãÝáéÄ
2	á³û¡ ãËúÐη(morton îû)	íþ : 10cm	15	ËëæðØþж, ýüà· íÂåöéÄ
3	Pasteur pipette		5	ËëæðØþж,
4	Spreader		5	ËëæðØþж,
5	Mini spatula		3	ËëæðØþж, 1ËÁ´Â çãÝáéÄ
6	Pipetman tip(á³, üÜßä)	0.1§¢	5	autoclave, ýüà· ¹× ïÈðúéÄ
7	Pipetman tip(ñé, ôìßä)	1.0§¢	3	autoclave, ýüà·äû ñÞÝáéÄ
8	Pipetman tip(ÓÞ, ÛÜßä)	5.0§¢	3	autoclave, plate ñÞÝáéÄ
9	Silicon cap(pipetteéÄ)	5.0§¢	3	autoclave
10	Filtering mesh	59¡­60§­	2	autoclave on funnel
11	Membrane filter set	25§®, 0.4§­	2	autoclave in cap

1.2.1.2. ñÞÝá : Øþжô¥×âµÈ ÐïÎý¸¦ ÙíжßÉÀ¸·Î ¿Å°Ü³õ°í í¹èâàÊ lamp¸¦ ÄÑ ³õ¾ÆµÒ

1.2.2. Regeneration medium ñÞÝá (1998. 12. 24) ¡Ø Protoplast preparation Ó×ìí ñÞÝá

1.2.2.1. ÛÆò¢ - MYG medium + sucrose for osmotic buffering

ÛãûÜ	ãËå·Ù£	é»Õá/100§¢	ð²íÂ(50+50§¢)	ÝáÍÅ
1	Distilled water	100§¢	100§¢	1ó­ ñú׶â©
2	Malt extract	1g	1g
3	Yeast extract	0.4g	0.4g
4	Glucose	0.4g	0.4g
5	Sucrose	17.1g	0g+8.6g	(50§¢¾¿ ÝÂÛÕ)
6	Agar	100§¢	0.4g/40§¢	(10+40§¢·Î ÝÂÛÕ)

¢Ñ + øöãÆ : sucrose, agar øÐùß 40§¢/100§¢ ¡â-flask ¡æ regeneration medium

sucrose øÐùß 10§¢/ÐÞîû 30§¢ test tube ¡æ dilutionéÄ

¢Ñ - øöãÆ : agar øÐùß 40§¢/100§¢ ¡â-flask ¡æ regeneration medium for control

sucrose Ú±øÐùß 10§¢/ÐÞîû 30§¢ test tube ¡æ dilutionéÄ

1.2.2.2. Regeneration medium ñÞÝá(pouring)

¢Ñ 60¡¿15§® sterilized petri-dish ÞÅéÄ 9ËÁ¾¿ ñÞÝá

¢Ñ Pipetman°ú ÓÞúþ tip(5§¢¿ë)À» ì¦éÄÇÏ¿© 4§¢¾¿ petri-dish¿¡ ÝÂñ»ÇÏ´Â °ÍÀÌ ê«öÎÀ̳ª ½ÇÁ¦·Î ¶ß°Å¿ï ¶§ ãùã¿ÇÏ´Â °ÍÀ̹ǷΠ3.7§¢ ïïÓø¿¡ ¸ÂÃß¾î ãùã¿ÇÔ

¢Ñ ÝÂñ»°¡ ³¡³­ ý­ ½Ä¾î¼­ ͳïÒÀÌ µÇ¸é ¶Ñ²±¿¡ ýüà·ÛÃ×Ë°ú buffer ôÕÊ¥æ¨Üú øöãÆ

¡Ø + øöãÆ : sucrose, agar øÐùß 40§¢/100§¢ ¡â-flask ¡æ regeneration medium

- øöãÆ : agar øÐùß 40§¢/100§¢ ¡â-flask ¡æ ÓßðÎÏ¡

¢Ñ ýüà·ÛÃ×ËÀº ʦÒöÇϸé 10¹¡­10⁴±îÁö ãùã¿ÇÏÁö¸¸, ÓÞô÷·Î 10²ºÎÅÍ ãùã¿ÇÔ

1.2.2.3. ÕÒÔÐÜÁηÇÏ°í ÀÖ´ø enzyme solutionÀ» ²¨³»¾î ãùúÐãø¿¡ ³õ¾ÆµÎ¾î ßÈ访¡¼­ ³ìÀÓ

1.2.2.4. Water bath¿¡ ¹°À» ä¿ì°í ï³ê¹À» ÄѼ­ è®Óø¸¦ 30¡É·Î settingÇÔ

1.2.2.5. 3ìí îñ¿¡ ïÈðúÇÏ¿© ÛÆå×ÇÏ´ø Coprinus cinereus äûô÷ÛÆå×äûÀ» °¡Á®¿Í ñÞÝá

1.3. Protoplast preparation (1998. 12. 24)

1.3.1. Protoplast extraction

1.3.1.1. жÞê µ¢¾î¸® ñÞÝá

¢Ñ ѨñéжÞ긦 ¸¹ÀÌ °®Áö ¾ÊÀº ÛÆå×äû ÞÅéÄ : ¸Å¿ì ºÎµå·´°í Á¶½É½º·´°Ô slant ÛÆò¢¿¡¼­ °È¾î ³¿. ïÈðúê«ÀÌ Àû¾ú´ø ÌÑéç¿¡´Â 3ìíÀÌ Òýá´ Áö³­ ÌÑéç, ïÈðúê«ÀÌ Òýá´ ¸¹¾Ò´ø ÌÑéç¿¡´Â 3ìíÀÌ Ã¤ ³ÑÁö ¾ÊÀº ßÒ÷¾¿¡¼­ üÀéÄÇÏ´Â °ÍÀÌ ¹Ù¶÷Á÷ÇÔ

¢Ñ ØþжµÈ mini spatula¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© жÞ긦 Àß ¸ðÀ¸¸é¼­ ѨñéжÞê´Â ´Ù¸¥ ÂÊÀ¸·Î ¿Å°Ü¼­ ÛÆå×äû°ú ´õºÒ¾î Pasteur pipetteÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© ð¶ËÛÇÔ

¢Ñ ÛÆå×äû Үݻ¿¡ ÀÖ´ø жÞ길 ³²À¸¸é spatula¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© ¾à°£¾¿ ´­·¯¼­ жÞê¿¡ µé¾îÀÖ´Â ÛÆå×äûÀÌ °ÅÀÇ ´Ù ÝÂÝôµÉ ¼ö ÀÖµµ·Ï ÇÏ°í, ÝÂÝôµÈ ÛÆå×äûÀº ´Ù½Ã Pasteur pipetteÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© ð¶ËÛÇÔ

1.3.1.2. жÞêÕá ö´ïÒ

¢Ñ ÐÞîûÀ¸·Î ¸·Èù ãËúÐη Çϳª¸¦ àÔ÷ÉÇÏ¿© ñìÕá ö´ïÒ

¢Ñ ÛÆå×äûÀÌ °ÅÀÇ ð¶ËÛµÈ Ð¶Þê µ¢¾î¸®¸¦ ÐÞîûÀ¸·Î ¸·Èù ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³ÖÀ½

¢Ñ ÐÞîûÀ» ´Ù½Ã ¸·Àº ý­ ñìÕáÀ» ö´ïÒÇÏ¿© ÛÆå×äûÀÌ Òýá´ ¼¯ÀΠжô÷ÀÇ ñìÕá ÷êäÄ

1.3.2. Enzyme reaction

1.3.2.1. ý£áÈØþж

¢Ñ ßÈ访¡¼­ ³ìÀÎ ý£áȸ¦ membrane filter¸¦ ÷×Φ½ÃÄÑ ÐÞîû ãËúÐη¿¡ ¿Å°Ü ³ÖÀ½

1.3.2.2. ý£áÈô¥×â ¹× Úãëëë¯Óô

¢Ñ 150¡­200§·ÀÇ Ð¶ô÷Õá¿¡ 1§¢ÀÇ ý£áȸ¦ ñéúþ(1§¢éÄ) pipette tipÀ» ³¢¿ö PipetmanÀ¸·Î жô÷°¡ µé¾îÀÖ´Â ãËúÐη¿¡ ³ÖÀ½(ý£áÈ 1§¢¸¦ ³Ö´Â °ÍÀÌ õÏý­ ͪߩ¿¡ êó××)

¢Ñ жô÷¸¦ spatula¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© Àß Ç®¾î ÁÜ

¢Ñ shaking water bath(30¡É)¿¡ ³ÖÀº ý­ 80rpm áÜÓø·Î shakingÇϸç Úãëë ë¯Óô

¢Ñ Øß 20ݸ¶´Ù ²¨³»¾î ãËúÐηÀÇ ¾Æ·¡ Ý»ÝÂÀ» ¼ÕÀ¸·Î ÀâÀº ä 1¡­2õ© µ¿¾È vortex mixingÇÏ¿© ´Ù½Ã shaking water bath¿¡ ³ÖÀ½

¢Ñ 2ãÁÊà µ¿¾È ý£áÈÚãëë ô¥×â

1.3.3. Protoplast counting

1.3.3.1. úéÚ°Ìð°ú Haemacytometer¸¦ ì¦éÄÇÑ protoplast count

¢Ñ Improved NeubauerÀÇ µÎ grid°¡ Àִ ݻݿ¡ ÇÑ ¹æ¿ï¾¿ protoplast éÁäû ß¾öÇ

¢Ñ úéÚ°Ìð 100ÛÃ×Ë¿¡¼­ ã·íÂÇÏ¿© 400¹è â©ñÞ¿¡¼­ ËþÌð

1.3.3.2. Haemacytometer¸¦ ì¦éÄÇÑ protoplast count

¢Ñ gridÀÇ depth´Â 0.1§®, ÊÀ grid Ü«ÀÇ ±æÀÌ´Â 1/20§®·Î¼­ ØüîÝÀº 1/400§±¸¦ ³ªÅ¸³»¹Ç·Î 1ËÁÀÇ grid é»îÝÀº 1/4000§§ÀÌ µÇ¸ç, µû¶ó¼­, 4ËÁÀÇ grid¸¦ ÞÅéÄÇÒ ÌÑéç, ±× é»îÝÀº 10^-3(1/1000)§§ÀÌ µÊ. ¶ÇÇÑ, 1§¢=1§¨=10³§§À̹ǷÎ, ßæߧµÈ protoplastÀÇ åÖÀº 4ËÁ grid Ò®¿¡ ÀÖ´Â protoplast ËÁ⦡¿10⁶/§¢°¡ µÊ.

¢Ñ 4ËÁÀÇ grid Ò®¿¡ ÀÖ´Â protoplastÀÇ â¦¸¦ countingÇÔ (5ÚãÜÝ øÁг ͪߩ; 180ËÁ ¡æ 1.8¡¿10⁸/§¢)

1.3.3.3. dilution of protoplast

¢Ñ óÀ½ éÁäû Ò®¿¡ ÀÖ´Â protoplastÀÇ åÖ âÙò±

¢Ñ original solutionÀÇ 10⁸¿¡¼­ ã·íÂÇÏ¿© ïÂó­ ýüà·½Ãų ¼ö ÀÖµµ·Ï ô¥×â

¢Ñ osmotic stabilizer êóÙí¿¡ µû¶ó Ï¡ÝÂÇÑ 10§¢ÀÇ äûô÷ÛÆò¢¸¦ ÊÀÊÀ 0.9§¢¾¿ 6ËÁÀÇ á³û¡ ãËúÐη(mortonîû)¿¡ 1§¢ tipÀ» ì¦éÄÇÏ¿© ¹Ì¸® ÝÂñ»ÇØ ³õÀº ÈÄ, ÛÃ×Ë ¹× osmotic stabilizer êóÙí øúãÆ

¢Ñ ÀÌ ¶§, osmotic stabilizer°¡ ¾ø´Â °ÍÀ» ¸ÕÀú ÝÂñ»Çϸé, ÇϳªÀÇ tipÀ¸·Î Í©áÙ ÞÅéÄ Ê¦ÒöÇϸç, ÊÀÊÀ 10⁶¡­10¹±îÁö 6ËÁÀÇ series¸¦ ñÞÝáÇÏ´Â °ÍÀÌ ¹Ù¶÷Á÷ÇÔ

¢Ñ 0.1§¢ tipÀ» ì¦éÄÇÏ¿© ý£áÈÚãëëäû¿¡¼­ 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10⁶ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ¿©±â¿¡¼­ ´Ù½Ã 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10⁵ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ¿©±â¿¡¼­ ´Ù½Ã 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10⁴ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ¿©±â¿¡¼­ ´Ù½Ã 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10³ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ¿©±â¿¡¼­ ´Ù½Ã 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10²ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ¿©±â¿¡¼­ ´Ù½Ã 0.1§¢À» õÎõóÇÑ ý­ 10¹ÀÌ ¾²¿©Áø ãËúÐηÀ¸·Î ¿Å°Ü ³Ö°í ´Ù½Ã Çѹø ±× ýüà·äûÀ¸·Î tipÀ» Çó±¸¾î ³¿. ñí, ÊÀ ãËúÐη¿¡¼­ 0.1§¢À» õÎõóÇϸé, ÀÌ éÁäû Ò®¿¡ ðíî¤ÇÏ´Â protoplastÀÇ åÖÀº ÊÀ ãËúÐη¿¡ ¾²¿©Áø ¼ýÀÚ ¸¸Å­ÀÓÀ» ëòÚ«ÇÔ(Ó©, óÀ½¿¡ 1.0¡¿10⁸À̾ú´ø ÌÑéç).

1.3.3.4. ïÈðú

¢Ñ 10¹¡­10³ÀÇ ãËúÐη¿¡¼­ 0.1§¢ÀÇ ÚãëëäûÀ» õÎõóÇÑ ý­, ñÞÝáµÈ ÊÀ ýüà·ÛÃ×Ëܬ·Î 3ËÁÀÇ regeneration plates¿¡ ïÈðúÇÔ. Ó©, protoplastÀÇ åÖÀÌ Àû¾ú´ø ÌÑéç¿¡´Â 10¹ÀÇ ýüà·äû¿¡¼­´Â 0.2§¢ÀÇ ÚãëëäûÀ» õÎõó, ïÈðúÇÏ´Â °ÍÀÌ ´õ ÁÁÀ½.

¢Ñ ÊÀ ýüà·ÛÃ×Ëܬ·Î 3ËÁÀÇ plates¿¡ ïÈðú ý­ spreader¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© plates À§¿¡ ïÈðúäûÀÌ °ñ°í·ç ÆÛÁú ¼ö ÀÖµµ·Ï ÝÂߤ½ÃÅ´

¢Ñ °°Àº Û°ÛöÀ¸·Î 10²¿Í 10³ÀÇ ýüà·äû¿¡¼­ ÊÀÊÀ 0.1§¢ÀÇ ÚãëëäûÀ» õÎõó, ïÈðúÇÏ°í spreader¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© ÝÂߤ½ÃÅ´

1.3.3.5. Osmotic stabilizer°¡ ¾ø´Â ÛÆò¢¿¡ÀÇ ïÈðúÀ» ¸¶Ä£ ý­, °°Àº Û°ÛöÀ¸·Î osmotic stabilizer°¡ ÀÖ´Â ÛÆò¢·Î ýüà· ¹× ïÈðúÀ» ãùã¿ÇÏ°í plates¿¡ ïÈðúìí, ÛÆò¢Ù£ ÑÀÖâ.

1.3.3.6. ÛÆå×(ÛÆå×è®Óø : 30¡É, 231筃 ÛÆå×ãø) - 3ìíÊà ÛÆå×

1.3.4. ËÖãæ×Ë ðàÞÛ (1998. 12. 28)

1.3.4.1. Colony counting

¢Ñ 100ËÁ Ò®èâÀÇ colony°¡ û¡à÷µÈ ÛÃ×ËÀÇ plates¸¦ ì¦éÄÇÏ¿© colony ⦸¦ ¼¾ ý­, øÁг ͪߩ(¡Ø ÓÞô÷·Î, 10² ¶Ç´Â 10¹ plate¿¡¼­ ͪߩÇÏ´Â °ÍÀÌ ¹Ù¶÷Á÷ÇÔ)

1.3.4.2. Regeneration rate ͪߩ

¢Ñ ËÖãæ×Ë = colony ËÁ⦠/ 1.x ¡¿ 10¹ (¶Ç´Â 10²)

(Ì¿Íý) 34.7/1.8¡¿10²pps = 19.3%