(Trucchi e suggerimenti)

E' sicuro che c'entri la parete. Colture vecchie di batteri Gram + risultano Gram - .Vi sono anche i batteri Gram variabili (esempio la Gardnerella vaginalis) o anche batteri Gram positivi che tendono a decolorarsi troppo rapidamente ,e quindi a essere classificati erroneamente come gram positivi (esempio pratico i lattobacilli del tampone vaginale risentono molto dei tempi e modi di decolorazione).Esistono batteri Gram negativi quali le Neisserie, Acinetobacter, Moraxelle che appaiono non propriamente Gram negative.L'occhio esperto le riconosce pero' come tali.

Ma molte sono le varianti della colorazione di Gram.

Prima di tutto l'acetone è un forte decolorante, non va mai usato puro. Alcuni usano 1 parte di acetone e 4 parti di metanolo cioè 100 mL di acetone e 400 mL di metanolo.Altri  1 parte di acetone e 3 parti di alcool etilico o alcool isopropilico.

Una altra questione è il fissaggio del vetrino. E' preferibile fissare con metanolo o alcool denaturato invece che alla fiamma. Va bene anche lo stesso decolorante! La settima edizione del manuale ASM parla di fissare con metanolo e quindi di colorare per un minuto con i tre passaggi.Il decolorante consigliato si prepara con 25 parti di acetone e 75 parti di etanolo puro o al 95% (1:3).

Il Lugol deve essere stabile, altrimenti si formano facilmente dei precipitati.E' consigliabile   prolungare lo step della soluzione Lugol stabilizzata per 2 minuti.

Un metodo più elaborato prevede i seguenti passaggi:

Si può' usare anche una serie di vaschette da 150 mL riempite di cristal violetto, lugol,  alcool per decolorare e fucsina . I vetrini sono posti in un porta -vetrini da 20 slides, e immerse in sequenza  nelle vaschette. Ogni mattino le vaschette vanno rinnovate e il nuovo lotto di Cristal violetto tamponato. Usando l'etanolo puro come decolorante c'è poco rischio di decolorare troppo rapidamente quando ci si  dimentica questo passaggio. Noteremo pero' che Acinetobacter, Moraxelle e Neisserie spesso le vediamo gram positive. Non è un problema: il difetto è parziale e un'altra parte del preparato mostra i batteri gram negativi.

Poi c'è il problema dello spessore del vetrino. Se preferite 50% acetone e 50% etanolo, si può' decolorare rapidamente mentre  l'acqua del rubinetto che scorre è pronta per lavare. Quando il colore porpora se ne sta andando allora subito si risciacqua sotto acqua. Pero' materiali come l'espettorato, sono quasi sempre spessi sullo striscio. Ma a noi basta decolorare solo le parti più rappresentative, non il vetrino intero. Si può usare anche 1 o 2 gocce di bicarbonato al 5% quando si mette il cristal violetto. Questo aiuta a fissare il cristal violetto e mantenere la gram positività. Non versare mai il decolorante su un rack porta vetrini , immergetelo dentro la vaschetta e risciacquate altrimenti si decolora troppo. Si può usare il decolorante all'inizio come fissativo per 1 o 2 minuti prima di mettere il Cristal violetto.E' meglio che fissare alla fiamma.

Un trucco per distinguere i batteri Gram negativi dai Gram positivi è usare una soluzione al 3% di KOH. La soluzione di KOH 3% rompe le pareti cellulari dei batteri Gram negativi e rilascia cosi' le catene di DNA rendendo la sospensione batterica molto vischiosa. Il metodo è stato descritto in dettaglio in: Halebian s. et al., J.Clin. Microbiol. 12: 444-448, 1981.Dunque la parete dei batteri Gram negativi è facilmente rotta dalla soluzione alcalina.Si può benissimo usare una piastra del tipo micro-titer a svariati pozzetti.Si prende una bella ansata e si mette nella soluzione di potassa al 3% sospendendo con movimento circolare.Ogni tanto si solleva l'ansa.La sospensione batterica diventa molto vischiosa con i batteri gram negativi anaerobi, enterobatteri, batteri non fermentanti del tipo Pseudomonas , mentre con le Neisserie e altri anaerobi Gram -  non funziona bene, probabilmente la parete batterica è più resistente, ci vuole piu' tempo .Dopo alcuni secondi un filo tiene dietro l'ansa quando è sollevata . 

I batteri Gram positivi anaerobi stretti spesso si decolorano facilmente e appaiono Gram negativi o gram variabili.

Vi sono procedure oltre la colorazione che aiutano a distinguere fra un batterio Gram positivo e uno Gram negativo? Certamente, eccone un elenco:

Tutte queste caratteristiche vanno prese nel complesso e non singolarmente.

1) Perché non bisogna eccedere nella fissazione alla fiamma?

Perché ciò provoca la formazione di artefatti e rompe inoltre la normale morfologia dei batteri.

2) La colorazione di Gram è un metodo sensibile?

Non è un metodo sensibile.Infatti affinché i batteri siano visibili nel vetrino devono essere presenti nel campione a una concentrazione di 10^4-10^5 UFC/ml in un campione non concentrato.Sotto questa concentrazione solo la coltura è positiva.

3) A che serve la fissazione?

Come dice il nome a fissare i batteri al vetrino , perché altrimenti sarebbero lavati via durante le varie fasi delle colorazioni e lavaggi.

4) Quale è il metodo migliore per  osservare un campione ricco di sangue, come per esempio un liquido pleurico ematico?

Dopo aver fissato il campione è consigliabile coprirlo con acqua distillata, aspettare 5 minuti, e togliere via l'acqua.Cio' causa la lisi delle emazie e il campo microscopico è più' chiaro.

5) Quale è la fase più critica della colorazione di Gram?

E' la decolorazione , che varia di più nei diversi metodi sia come tempi sia come reagenti.

6) Quando si osserva un vetrino al Gram ci sono dei segni che fanno pensare a una buona colorazione?

Si, quando si osservano batteri Gram + assieme a leucociti PMN o cellule epiteliali che sono Gram -.Se il vetrino contiene solo batteri e cellule Gram – , ciò fa pensare a una eccessiva decolorazione,  come nello striscio da tampone vaginale quando si osservano lattobacilli in rosa e cellule e leucociti in rosa.E' dunque più facile accorgersi se il Gram è stato fatto bene quando ci aspettiamo dei batteri Gram + , che  quando il campo è tutto rosa.

7) Che cosa dobbiamo fare quando lo striscio è spesso?

Non bisogna insistere con la decolorazione perché ci interessa solo una parte del vetrino, quella parte più sottile.

8) Come possiamo esercitarci a fare la colorazione di Gram?

Si può' prendere del materiale dalla propria bocca o dalla materia alba dei denti.Ci troveremo sia batteri G+ sia G- e cellule epiteliali G-.

9) Possiamo recuperare un Gram fatto male?

Si può recuperare il vetrino togliendo l'olio da immersione con lo xilolo.A questo punto se il vetrino è sopra decolorato , lo decoloriamo e ricominciamo con la decolorazione.Se il vetrino è sotto decolorato, continuiamo con la decolorazione.

10) I batteri Gram + possono colorarsi Gram -?

Si.Batteri Gram + vecchi, danneggiati o trattati con antibiotici possono apparire Gram negativi.Il contrario non avviene:batteri Gram negativi non appariranno mai Gram + con l'età o il danno di parete.