Se guardiamo ai nomi che compongono la flora esogena che possiamo isolare da un secreto vaginale, possiamo pensare che la mera presenza di una specie potenzialmente patogena costituisca indice di malattia .Sebbene questi microorganismi hanno la potenzialità di determinare una malattia nell'area vagino-cervicale, non sempre è cosi'.

Invece spesso sono i batteri della flora endogena, cosidetta commensale , che possono determinare disturbi.

Fu Pasteur a introdurre il concetto di malattia infettiva a eziologia monomicrobica:

Pasteur si riferiva al bacillo dell'antrace , che è associato a una malattia in un ospite.Ma proprio da qui parte l'errato concetto che la mera presenza di un organismo potenzialmente patogeno significhi di per sè malattia.

Smith pone l'accento sulla carica batterica e sulle difese immunitarie dell'ospite.

Robert Koch con il terzo e quarto dei suoi famosi postulati introduce la sperimentazione animale quale modello per dimostrare la causa monomicrobica di una malattia infettiva.Ma per riprodurre la malattia infettiva negli animali da esperimento, si dovette forzarne il microambiente .Questo dimostro' nel modello sperimentale animale che solo un cambiamento nel micro ambiente ricettivo riproduce l'infezione umana nell'animale.

Anche la flora endogena normale dell'ecosistema vaginale puo' causare i sintomi della malattia se l'ecosistema viene in qualche modo modificato.Di contro i microorganismi della flora esogena possono essere presenti nel tratto genitale femminile, senza causare sintomi.

I microorganismi della flora endogena possono causare disturbi quando prendono il sopravvento nell'ecosistema vaginale.In teoria se un fattore di virulenza è costitutivo, il numero dei batteri presenti (la carica) determina la quantità di virulenza che serve a promuovere l'infezione.Poichè nell'ecosistema vaginale vi sono specie batteriche antagoniste cio' normalmente non avviene.

Candida albicans:

Come detto è un componente normale della flora vaginale senza percio' che causi   sintomi.La candida è un lievito (grande almeno 3, 4 volte un batterio) che ha il suo habitat normale nell'intestino.In determinate condizioni quali la pubertà o la gravidanza c'è un aumento della colonizzazione della Candida .Il livello di estrogeni è correlato alla colonizzazione di Candida.Anche il livello dei lattobacilli è correlato agli estrogeni nel senso che la carica di Lactobacillus species aumenta durante la gravidanza assieme alla carica di Candida .

Test del tubo germinativo:è il modo piu' semplice di determinare la specie albicans.Si stemperano delle colonie del lievito in un pool di siero , si lascia incubare 2-4 ore a 37°C.La presenza dei tubi germinativi(vedi le freccie)  ci fa fare diagnosi presuntiva di specie albicans .Facile ed economico!

La vera e propria vaginite da Candida è associata con un quadro microscopico che mostra le pseudoife che è la forma invasiva del lievito.Per esperienza le pseudoife si intrecciano con le cellule epiteliali solo in alcune aree del preparato, mentre la forma tipica gemmante della Candida è piu' uniformemente distribuita nel preparato.Pertanto bisogna "leggere" il vetrino con attenzione .Nel caso di coltura su Agar Sabourad meglio  prima stemperare il tampone in 0.5 ml di brodo o soluzione fisiologica e seminare omogeneamente la superficie dell'Agar.

L'aumento della carica del lievito ,dovuta a fattori microbiologici e/o fisiologici, aumenta la probabilità che si instaurino i sintomi della infezione specie quando si manifesta la forma virulenta del lievito (le pseudoife), altrimernti la Candida è un semplice commensale.

L'uso e l'abuso di difluconazolo nella cura di una "supposta" vaginite da Candida ha selezionato quelle specie di Candide che sono naturalmente resistenti agli imidazoli quali Candida glabrata e Candida krusei (quest'ultima facilmente riconoscibile dalle cellulelievitiformi a forma di tronconcino).

Quando i lattobacilli vengono eliminati da una terapia antibiotica, la Candida prende il sopravvento.Approffitta di un vuoto nell'ecosistema vaginale.Cio' suggerisce che c'è un effetto antagonista di Lactobacillus species sul lievito.

Inoltre poiche una vaginite è sinomino di infezione- infiammazione noteremo la presenza dei leucociti.Per esperienza un vetrino a fresco, senza fissazione e colorazione è nettamente superiore al Gram per osservare sia una bassa carica di lievito (è piu' sensibile) sia la presenza dei leucociti, anzi molti microbiologi non fanno nemmeno il Gram ma si limitano ad osservare il preparato stemperato in soluzione fisologica a fresco.

Gardnerella vaginalis

La Gardnerella vaginalis  è un comune abitante della flora vaginale.Anche qui la differenza fra malattia e la semplice colonizzazione la fa la carica batterica.Studi quantitativi (molto difficili a farsi nella pratica diagnostica batteriologica di routine) hanno dimostrato che i sintomi di una Vaginosi batterica sono associati a una concentrazione >10^7 UFC per grammo di fluido vaginale.

Quando una donna ha la vaginosi batterica da G. vaginalis e si cura , la stessa puo' essere reintrodotta dal partner .Nel tampone uretrale maschile ricercheremo sempre anche G. vaginalis, ma come detto se la carica reintrodotta è bassa la   paziente tornerà asintomatica.

Che cosa determina la moltiplicazione di G. vaginalis in concentrazioni cosi' abnormi?Inanzitutto quando diciamo "sviluppo di G. vaginalis" , ossia quando osserviamo quei quadri impressionati di flora batterica Gram variabile abbondante concentrata intorno o sopra le cellule epiteliali ("clue cells"), senza l'apparente presenza e di Lattobacilli e di leucociti (da qui la distizione fra vagin-ite e vagin-osi ), non solo è presente  G. vaginalis ma anche una abbondante   flora anaerobia stretta.La cura a base di Flagyl (metronidazolo) eradica l'infezione nel 75-80% dei casi ma solo il 15-22% dei ceppi di G. vaginalis sono sensibili al metronidazolo!

Tappeto di batteri Gram variabili intorno alle cellule epiteliali desquamate:è cosi' che si presenta il quadro tipico di una BV vaginosi batterica  da G. vaginalis

Questo significa che il metronidazolo agisce soprattutto sulla flora anaerobica concomitante e che la vaginosi da G. vaginalis è in verità una vaginosi da G. vaginalis-anaerobi.

Ricordiamo che la diagnosi di vaginosi da G. vaginalis-anaerobi si fa secondo i 4 criteri classici:

Il fish test o test delle ammine  è molto semplice quantunque "nauseabondo".Stemperiamo il tampone in alcune gocce di KOH al 10%, si liberano delle ammine volatili dall'inconfondibile odore di pesce marcio (essendo volatili la "sniffata" deve essere immediata).Sul vetrino colorato al Gram quando osserviamo che il preparato è "carico" ci aspettiamo o la presenza di G. vaginalis in abbondanza o quella di una forte concentrazione lattobacillare (lattobacillosi come detto sopra).

Non sappiamo ancora cosa determina la vaginosi da G. vaginalis-anaerobi .Sicuramente c'è un calo della concentrazione dei lattobacilli H202 produttori e acido produttori , che determina la crescita degli altri costituenti della flora vaginale.Il cambiamento nel potenziale redox dell'ambiente favorisce la flora batterica anaerobica che determina la proteolisi e un ambiente che si allontana dal pH normale di 4.5.La forte produzione di ammine e il pH alacalino contribuisce al problema "odore" della vaginosi con una debole irritazione (piu' pronunciata nel caso di vaginite).Cosa determina l'inibizione della risposta leucocitaria non è noto.

Streptococco gruppo B

Non bisogna allarmarsi:sebbene lo streptococco di gruppo B è causa riconosciuta di setticemia da parto e di meningite neonatale, la proporziione è nettamente inferiore alla colonizzazione da SGB.Il 14-25% dei tamponi vaginali sono positivi per la ricerca di SGB.In assenza di misure preventive la setticemia da parto era di 1-3 casi ogni 1000 parti.Anche in questo caso maggiore la carica di SGB , maggiore la pericolosità del batterio.Gli SGB hanno l'abilità di inibire la concomitante flora gram positiva e gram variabile.Ricordiamo che SGB puo' mostarsi nelle piastre di Agar sangue anche come non emolitico.

Camp test positivo per SGB: la striscia in mezzo è una coltura di S. aureus su Agar sangue.Ai lati le due strisce ortogonali sono colture di streptococco di gruppo B. All'intersezione l'emolisi è amplificata :test +.

Lactobacillus species

I lattobacilli sono normali abitanti della flora batterica delle donne in età fertile.Vi sono piu' specie del genere Lactobacillus .Le due specie piu' comuni sono Lactobacillus acidophilus e L. fermentum.Piu' di una specie è presente .Sappiamo che i lattobacilli inibiscono la replicazione di G. vaginalis e anaerobi (Mobiluncus species, Bacteroides species, Peptostreptococcus species).L'inibizione è attribuita alla produzione di acidi organici (costituenti dei prodotti della igiene intima femminile) che mantengono un pH acido <4.5.Il loro livello è correlato al tasso di estrogeni.Anche la produzione di H202 è un meccanismo di antagonismo forse superiore alla produzione di acidi organici.Quando troviamo lattobacilli nei casi di vaginosi da G. vaginalis-anaerobi, l'89% dei ceppi è H202 negativo.Lo stesso non vale in caso di riscontro di altro tipo di flora batterica.In genere il riscontro di una flora batterica mista è comune in donne sessualmente attive, mentre nelle giovani adolescenti troviamo praticamente solo lattobacilli.Oltre a una terapia antibiotica , vi sono ceppi di streptococchi che inibiscono naturalmente la flora lattobacillare, questo lo si vede bene anche sulle comuni piastre di Agar sangue della routine.

I Lattobacilli sono un insieme di specie di bastoncelli gram positivi, catalasi negativi , immobili, vancomicina resistenti che possono essere H2O2 produttori o meno.La produzione di H2O2 è un fattore microbicida verso molte specie batteriche ma non verso Candida.

Spesso osserviamo all'esame diretto dopo colorazione di Gram una carica elevatissima di flora lattobacillare associata a cellule epiteliali squamose distrutte.Cioè osserviamo praticamente solo i nuclei di queste cellule dell'epitelio vaginale .E' un quadro che chiameremo "Lattobacillosi".

Riguardo all'uso di yoghurt o lattobacilli che si trovano in farmacia  siamo d'accordo nel dire che " I supposti benefici della flora probiotica devono ancora passare gli alti standards dello scrutinio scientifico prima di essere accettati" (Gorbach).

La flora batterica vaginale è dunque un modello eccellente di come l'ambiente microbiologico possa vincere la virulenza di una specie batterica e impedire la malattia.Affinchè la malattia avvenga , i batteri esogeni o endogeni che posseggono dei requisiti genetici di patogenicità ,devono prima raggiungere concentrazioni elevate.Sebbene la flora lattobacillare è la chiave  di questa inibizione ,quando sono dominanti in numero , la loro abilità nel governare l'ecosistema vaginale è influenzato a sua volta da fattori esterni e da altre specie batteriche del tratto genitale femminile.

Escherichia coli

La colonizzazione in alta carica dell'introito vaginale da parte delle enteroibatteriacee (E. coli, Klebsiella ecc.) nonchè di Enterooccus faecalis  è un fattore predisponente di infezione urinaria nelle donne.Una terapia a base di estrogeni allevia la ricorrenza di queste comuni infezioni.

Trichomonas vaginalis

Trichomonas alla colorazione di Giemsa

Inconfondibili quando osservati a fresco, entro mezzora dal prelievo, mantenendo il tampone a caldo in circa 0.5 ml di soluzione fisiologica.Hanno una dimensione che è piu' del doppio di un leucocita (10-14 micron).Il quadro di una trichomoniasi io lo paragono a un campo di battaglia:l'infezione provoca povertà di cellule epiteliali di desquamazione , pochi lattobacilli, molti leucociti.E' fra di essi che va ricercata la "bestia".L'occhio esperto la scova anche quando è immobile.Allora basta fare un Giemsa come si vede nell'immagine qui sopra per essere certi.

Il movimento di un Trichomonas:clicca sull'immagine!

Tratto da "UNDERSTANDING THE BACTERIAL FLORA OF THE FEMALE GENITAL TRACT" Larsen B., Monif G.R. CID 2001:32.Provare a chiedere il lavoro originale al Dr Larsen [email protected]

33 FAQ sulla microbiologia delle Infezioni genitali femminili

1) Quali sono i sottogruppi dei lattobacilli?

H202 produttori e H2O2 non produttori

2)Quale è il terreno elettivo di coltura dei lattobacilli?

L'Agar rogosa

3) I lattobacilli possono determianre delle perdite?

Si nel caso di cariche alte associate a lisi delle cellule epiteliali (lattobacillosi)

4)Esistono lattobacilli cattivi?

I lattobacilli H2O2 negativi  degradano poco il glicogeno e non costituiscono elemento di equilibrio e protezione dell'ecosistema vaginale. Si riconoscono dalla forma coccoide .

5)E' importante la carica lattobacillare?

E' importante ma difficile a determinarsi.Prendendo 0.1 mg di fluido vaginale e misurando il pH si cerco' una concentrazione ideale lattobacillare. Ma vi sono soggetti che desquamano più o meno intensamente a seconda delle fasi del ciclo e a parità di pH in soggetti sani la carica lattobacillare va  da 10 a 10^9/ml. Il pH era intorno a 3.5.

6) C'è un kit per tipizzare le varie specie di Lactobacillus?

I lattobacilli vengono speciati con l'API (Biomerieux).E' il sistema di riferimento in batteriologia.E' usato solo a scopo di ricerca.

7)E' importante l'anamnesi della paziente al momento del prelievo del tampone?

Si. Una paziente con poliabortività orienta verso la Chlamidia, una paziente diabetica verso i miceti. Sapere il giorno delle ultime mestruazioni orienta sullo stato del ciclo. In caso di poliabortività è importante un tampone endometriale. In caso di gravidanza è importante la ricerca dello streptococco di gruppo B alla 26-36° settimana di gestazione. Se anche si trova lo streptococco agalactiae a parto imminente dare ampicillina in vena . E' buona norma dare un collirio alla eritromicina per la Chlamidia al posto del collirio al nitrato di argento che si faceva come profilassi da Legge del gonococco.

8)E' importante eradicare lo SGB?

Si in caso di gravidanza.La terapia è base di ampicillina.

9)Quale rischio di infezione è associato allo IUD?

Infezione da anaerobi del genere Actinomyces

10)La pillola favorisce lo sviluppo di Candida?

La pillola estro- progestinica favorisce la infezione da Candida. La pillola non è mai un metodo di barriera e induce le micosi.

11)Quali sono i sintomi di vaginite ?

bruciore,perdite biancastre,prurito,leucorrea

12)Quando andrebbe fatto  il tampone vaginale?

Almeno 3 giorni dopo l'ultimo rapporto sessuale, 5 giorni dopo la sospensione di un trattamento antimicotico o anti protozoario e 3 giorni dopo la sospensione di un trattamento antibiotico.

13) Dove si fa il tampone?

Il tampone vaginale si fa al fornice posteriore dopo inserimento dello speculum

14) il PH metro è necessario?

Vi sono pH-metri speciali che vanno lavati sotto acqua corrente, asciugati con della carta e immersi in amuchina al 60% dopo l'uso.Nel frattempo passa un quarto d'ora per una altra anamnesi. SE UTILIZZO LE CARTINE INDICATRICI DI PH NON SONO ACCURATE COME IL PH METRO.E' necessario perchè un pH maggiore di 4.5 è indice di vaginosi da Gardnerella vaginalis.

15) Si fa un normale  tampone a livello endo cervicale?

No.L'indagine a livello endocervicale nelle tube o in utero richiede l'endo-side per lo scraping endo-uterino. Se l'infezione è vecchia la Chlamidia ha avuto il tempo di risalire e non serve trovarla a livello endocervicale!

16) E' piu' importante l'esame diretto o la coltura?

L'esame batterioscopico è la fotografia in quel momento. La coltura viene dopo non è così importante. Quando sono presenti i leucociti c'è una infezione batterica.Meglio l'esame batterioscopico a fresco che si fa immediatamente ed è piu' sensibile del Gram.Inoltre la diagnosi di vaginosi da Gardnerella è immediata. BASTA IL VETRINO.Si prescrive subito METRONIDAZOLO 500 MG PER 7 GIORNI.

17)E' corretto scrivere Sviluppo di G. vaginalis nella eventuale risposta?

La diagnosi accurata di sviluppo di G. vaginalis presuppone la semina in Agar sangue selettivo per Gardnerella.Ci vogliono almeno 48 in CO2, la tipizzazione non è semplice.Basta allora il semplice vetrino come detto. La risposta sarà : colonizzazione prevalente da G. vaginalis perchè assieme a G. vaginalis ci può essere infatti Mobiluncus e altri anaerobi.

18)Come va fatto un tampone endo cervicale?

Quando faccio un tampone endo  cervicale ,prima tolgo il muco dato che il canale cervicale è tappato dal muco ,quindi inserisco il tampone speciale  che ruoto per circa 10 sec per asportare lo strato di cellule superficiali.

19) Che test posso fare sullo   speculum usato ?

Quando tolgo lo speculum (adesso ci sono quelli usa e getta) vi butto delle gocce di KOH al 10% , se c'è la vaginosi c'è l'odore di pesce marcio che ammorba l'aria.

20) Chi produce le ammine nel caso di Vaginosi?

Non è Gardnerella vaginalis ma gli anaerobi.Sono gli anaerobi che liberano le ammine dagli amminoacidi prodotti da G. vaginalis (forte produttore di una peptidasi). Le ammine innalzano il pH che favorisce la crescita ulteriore di Gardnerella. E' un circolo vizioso. La Gardnerella si riproduce in maniera esponenziale.La cadaverina, la putrescina li apprezzo con il KOH al 10%.

21) Come riconsoco il Mobiluncus?

E' un gram negativo a forma di virgola che  riconosco perchè si mette intorno al nucleo delle clue cells.

22) E' importante ricercare i micoplasmi?

I micoplasmi nel tampone vaginale sono molto comuni.Sono importanti nel tampone endocervicale .Hanno significato in pazienti con infertilità o poliabortività ma solo se trovati a livello endocervicale.Pare che blocchino il movimento degli spermatozoi.

23)Quali terreni si usano nella diagnosi delle infezioni batteriche del tratto genitale femminile?

Terreni di coltura:
Agar Mc Conkey
Agar sangue umano per G. vaginalis 48 ore in  CO2 (opzionale)
Agar Sabouraud + CAF
Agar mannitolo per stafilococchi (opzionale)
Agar rogosa per la crescita dei lattobacilli (opzionale per la carica dei lattobacilli)
Agar cioccolato per emofili e Neisseria
Agar 5% sangue di montone

24) Si puo' coltivare Mobiluncus?

Si per ricerca!Cresce su agar sangue CNA,in anaerobiosi,37 °C,per 7 giorni,sono bastonceli gram negativi, ricurvi, mobili.

25) E' importante ricercare lo Stafilococco aureo?

Lo stafilococco aureo è importante per la sindrome da shock tossico. Nelle condizioni di microaeriofilia indotta dai tamponi interni tampax lo stafilococco aureo produce la tossina.

26 )Che cosa fare in caso di vaginiti ricorrenti?

Quando ci troviamo di fronte a una vaginite ricorrente cerchiamo il serbatoio nel retto.Bisogna sterilizzare il serbatoio.Quindi cercare la candida nelle feci nei casi di micosi ricorrente.

27)E' importante segnalare le enterobatteriacee (Escherichia coli ecc.)?

Prenderli in considerazione se mancano i lattobacilli e se si trovano in coltura pura! 10 COLONIE DI E.COLI CI POSSONO ESSERE,TRANSITANO. MAI SEGNALARLI. CI SARA' SOLTANTO ACCANIMENTO TERAPEUTICO.

28)La Chlamidia è importante per quali sintomi?

Chlamidia è un parassita endocellulare in quanto non è in grado di produrre ATP. E' IL PRINCIPALE AGENTE DELLE MST MALATTIE A TRASMISSIONE SESSUALE. E' la causa della PID o malattia pelvica che dà fastidiosi dolori al basso ventre per anni. Il 5% delle donne sono asintomatiche. Hanno l'infezione ma non la malattia. Il trattamento deve essere combinato uomo<> <=> donna. Il tampone uretrale per gli uomini si dice che riesca bene quando il paziente sviene dal dolore!

29)Si puo' ricercare la Chlamidia sul sedimento urinario?

Si può fare uno screening sul sedimento urinario.Si colora con Giemsa. I metodi devono essere affidabili e semplici. MAI TROVATE IG M ANTI CHLAMIDIA POSITIVE! DURANO 7 GIORNI .1/64, 1/128 DI IG G SONO ALTE? MA IL 60% DELLE DONNE HA TITOLI DI IG G ANTI CHLAMIDIA DI 1/16 IDENTICO A QUELLO DI PAZIENTI INFERTILI! NON SERVE LA SIEROLOGIA NELLA RICERCA DELLA STERILITA'!

Nel tracoma congiuntivale un bel Giemsa va bene. Con la immunofluorescenza diretta bastano 1 o 2 spot fluorescenti se uno è esperto. Nei tamponi uretrali il limite sono 10 spot fluorescenti. Ma anche 6 è una ottima sensibilità .

Studi sui sedimenti urinari e tamponi uretrali di donne:

Si sono utilizzate per questo studio le prime urine quelle del chimico-fisico. Si centrifugano le urine 5 cc 3 volte a 3000 rpm per 10 minuti. Si lava ogni volta.Si raccoglie il pellet e faccio 3 vetrini.

30)Quali sono i metodi per la ricerca di Chlamidia?

Immunofluorescenza diretta
EIA
Dna/Rna
PCR

Ogni metodo ha una sua sensibilità e specificità . Buona è la sensibilità superiore al 70%. Un campione idoneo per Chlamidia deve avere  una buona cellularità . Se non ci sono cellule si prega ripetere. Per il sospetto di PID vanno bene le IgG? 5-10 corpi elemenatri /campo dò diagnosi di infezione da Chlamidia. Si fissa con acetone il vetrino perchè il metanolo è tossico! Meno di 5 corpi elementari e confermo con il metodo EIA che richiede una temperatura di 95° C per l'estrazione degli antigeni. 0 corpi elemenatri ma c'è sospetto di PID faccio gli anticorpi prima di ricorrere alla laparoscopia! In USA l'infezione da Chlamidia costa 2 milioni di $  l'anno per cure, mentre le vaginiti costano 18 milioni di dollari/anno.

31) Quale è il significato dello streptococco di gruppo A nelle bambine?

La dottssa Garlaschi del Mangiagalli di Milano studia le vaginiti pediatriche da Streptococco A e H. influenzae.Ma esistono le vaginiti pediatriche? Spesso basta cambiare la dieta. Meno cioccolato!

32)E' importante il tampone rettale per la ricerca dello SGB?

Il serbatoio di streptococco di gruppo B è rettale.Ricercarlo alla 26-36 settimana di gestazione . E' più importante il tampone rettale del vaginale per la ricerca dello streptococco B! I ceppi resistenti alla ampicillina sono il 5% e con 2 cicli in genere scompare.

33)E' importante l'Enterococco?

L'Enterococco non ha importanza se non in donne in gravidanza. Ha una certa importanza in donne in menopausa.E' importante se lo troviamo in coltura pura.Nella vagina atrofica vedere l'urinocoltura. C'è una stretta corrispondenza.  

Enterococco in una piastra di Agar sangue

© Gianfranco Bruno -terminato alle ore 02.00 del 26-7-2002

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