I – INTRODUZIONE 

II – CLASSIFICAZIONE BATTERICA

 III – BATTERI ANAEROBI RESIDENTI NELLA FLORA NORMALE

 IV – MALATTIE CAUSATE DA ANAEROBI

 V – RACCOLTA DEL CAMPIONE CLINICO

 VI – TEMPO PER IL RISULTATO

 VII – ESAME DIRETTO DEL CAMPIONE CLINICO

 VIII – SEMINA DEL MATERIALE

 IX – INCUBAZIONE DELLE COLTURE

 X-TEST DI AEROTOLLERANZA

 XI – ROUTINE DI SEMINA DELLE COLTURE

 XII – SAGGI DI IDENTIFICAZIONE

 XIII – BATTERI ANAEROBI GRAM NEGATIVI NON SPORULANTI

 XIV – COCCHI ANAEROBI

 XV – BASTONCELLI GRAM POSITIVI NON SPORULANTI

 XVI – BASTONCELLI GRAM POSITIVI ANAEROBI SPORULANTI

 XVII – PROFILO DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI

 I – INTRODUZIONE

La Coltura degli anaerobi è vista, dalla maggior parte dei laboratori, come un procedimento difficile, indaginoso , poco fattibile e pertanto non eseguibile facilmente. Conseguentemente non c’è molta esperienza  sull’argomento nè scambio di idee al riguardo. Per questo motivo troviamo pochi  laboratori di Microbiologia ben attrezzati che  hanno raccolto questa sfida.

Come si vedrà in questo documento , la frequenza di isolamento di anaerobi quali agenti di infezione è maggiore di quella di  agenti aerobi.

            Ricordiamo molte situazioni in cui abbiamo certezza di una possibile infezione batterica anaerobia : conosciuto l’aspetto clinico , il distretto anatomico, l’aspetto macroscopico e microscopico del materiale inviato ma nessuna crescita microbica.Allora sentiamo la necessità di saperne di piu’ sui batteri anaerobi (“Non esiste pus sterile” è una regola della Batteriologia N.d.T)

            Allora dobbiamo affrontare questa sfida :iniziare la coltura, l’identificazione  e l’antibiogramma dei batteri anaerobi.

            Il nostro obiettivo è valido per tutti i laboratori con poche risorse e che ancora non fanno nulla riguardo agli anaerobi.

            Questa introduzione  è stata fatta con informazioni ottenute da professori dell’ICB [Istituto di Scienze Biologiche dell’UFMG (Università Federale del Mato Grosso) , dell’ultima edizione del Koneman e  da informazioni di alcuni colleghi che già lavorano in questo campo.

Nel seguito proponiamo alcune identificazioni accessibili subito e altre meno, cosi’ che la messa a punto della identificazione batterica , dovrà essere un processo graduale e ogni volta piu’ completo come tutto nella vita deve essere!

II – CLASSIFICAZIONE BATTERICA

            All’inizio della vita terrestre , esistevano solo esseri anaerobi, poichè il meccanismo respiratorio fermentativo , in quanto non utilizzante l’ossigeno, è meno complesso di quello ossidativo.Come il prodotto secondario di vari processi metabolici diventa l’ossigeno , ogni volta esso si accumulava nell’ambiente.Come forma di adattamento all’ossigeno e suoi derivati , poco alla volta, alcuni microorganismi creano nuovi enzimi; principalmente superossido dismutasi, catalasi e perossidasi , che neutralizzano l’azione tossica dei radicali liberi , prodotti dall’azione dell’ossigeno. A seconda della quantità e tipo di questi enzimi , che ogni batterio possiede,  si va a determinare la sua minore o maggiore capacità di sopravvivere in presenza di ossigeno.Questi erano i primi esseri aerobi.

I batteri anaerobi sono presenti nel terreno,fanno parte della flora normale nell’uomo e di tutti gli altri animali, nonchè di tutti gli insetti esaminati fino adesso.Molti anaerobi sopravvivono bene in presenza di ossigeno gassoso, ma sono incapaci di iniziare la crescita, a meno che il potenziale di ossido-riduzione (Eh) nell’ambiente  sia fortemente ridotto.Possiamo allora classificare i microorganismi, quanto alla capacità respiratoria , nei seguenti gruppi:

• [Aerobi stretti]: sono un esempio i micrococchi e Pseudomonas.Tuttavia dato che li incontriamo anche in ambienti anaerobi, possiamo pensare  all’uso di nitrato del mezzo al posto dell’ossigeno come accettare finale di elettroni.

• [Anaerobi ]: si dividono in due gruppi:

1) Primo gruppo: anaerobi obbligati che sono ancora suddivisi in 1a) strettamente obbligati e 2a) anaerobi moderatamente obbligati.

2) Secondo gruppo : aerotolleranti.

Gli anaerobi obbligati sono suddivisi d’accordo con la capacità di crescere in presenza o di tollerare l’ossigeno in:

-         anaerobi strettamente obbligati non sono capaci di crescere sulla superficie di Agar esposti a livelli di ossigeno  maggiori dell’0.5% , l’ossigeno è estremamente tossico  per questi microorganismi .Un tempo di esposizione di 10 minuti all’aria è sufficiente alla loro morte.

-         Anaerobi moderatamente obbligati sono batteri che crescono quando esposti a livelli di ossigeno fra 2-8%.

-         Anaerobi aerotolleranti sono quei batteri a limitata o scarsa crescita in ambiente o nel mezzo con 5-10% di ossigeno , ma mostrano eccellente crescita in ambiente anaerobico.

Per fortuna , la maggior parte dei batteri anaerobi di importanza clinica sono classificati come anaerobi moderatamente obbligati.Questi organismi sono piu’ tolleranti agli effetti tossici dell’ossigeno di quegli anaerobi strettamente obbligati, ma vengono uccisi tuttavia dall’ossigeno, percio’ le condizioni anaerobie devono essere mantenute, durante la raccolta del campione, durante il trasporto, il  processamento, l’isolamento e identificazione.

      Gli anaerobi strettamente obbligati raramente causano infezioni negli esseri umani, ma entrambi gli anaerobi , i moderati o gli anaerobi stretti possono incontrarsi come parte della flora normale senza causare malattia.

•[anaerobi facoltativi ]: crescono in condizioni di anaerobiosi o aerobiosi (è il caso degli enterobatteri per esempio N.d.T) .

•[microaerofili]: richiedono ossigeno in superficie, pero’ non crescono sulla superficie di mezzi solidi in una incubazione normale di aerobiosi (21% di ossigeno dell’aria) e crescono scarsamente in ambienti anaerobi (vedi il caso del Campylobacter N.d.T.)

In conclusione possiamo riassumere i batteri in accordo con la loro capacità respiratoria come segue:

III – BATTERI ANAEROBI RESIDENTI NELLA FLORA UMANA

                        I batteri anaerobi sono diffusi nel suolo, pozze, laghi, fiumi. oceani, fogne, alimenti e animali.Negli uomini gli anaerobi normalmente risiedono nella cavità orale sotto il coletto  dei denti, nel tratto gastrointestinale, principalmente il Colon, dove stanno in numero 1000 volte maggiore dei coliformi , nell’apparato genitourinario, nella pelle.

*Cavità orale e tratto respiratorio superiore:

Pigmentati: specie del genere Prevotela,  Porphyromonas spp.

Non pigmentati : Prevotela spp. (specialmente  Prevotela oratis).

Bacteroides spp. (per esempio Bacteroides  ureolyticus).

Fusobacterium spp. (specialmente F. nucleaticum)

Peptostreptococcus spp. (streptococchi anaerobi)

Veillonella spp.

Actinomyces e  Propionibacterium spp.

*Stomaco

Lactobacillus

* Intestino tenue:

Streptococcus

Lactobacillus

* Intestino grosso:

Bacteroides fragilis group

Porphyromonas spp

Fusobacterium spp

Cochi anaerobi

Clostridum spp

Eubacterium spp

Bifidobacterum spp

Propionibacterium spp.

* Tratto genitourinario

Pigmentate: Prevotella spp, Porphyromonas spp.

Non pigmentate Prevotella

Bacteroides spp

Peptostreptococcus spp.

Clostridium spp

Veillonella spp

Lactobacillus spp.

Eubacterium spp

Propionibacterium spp

Mobiluncus spp.

* Uretra

Propionibacterium spp.

Peptostreptococcus spp

Bacteroides (Prevotella) spp

Fusobacterium spp

*  Pelle

Propionibacterium acnes

Peptostreptococcus spp.

IV  - MALATTIE CAUSATE DA ANAEROBI

            Fattori da prendere in considerazione:

• Il distretto anatomico:

Gli anaerobi devono essere presi in considerazione quando la regione infetta sia sensibile alla contaminazione da parte della flora normale del paziente.Per esempio il tratto gastro intestinale ha una flora anaerobia residente prolifica e qualunque processo intra addominale che parte dall’intestino deve essere considerato di origine anaerobia probabile.Le infezioni del tratto genitale femminile , specialmente ascessi profondi e processi infiammatori associati con gli annessi , sono frequentemente causati da microorganismi anaerobi. Al di sopra del diaframma , l’aspirazione della flora orofaringea è la base comune delle infezioni anaerobie pleuropolmonari.La flora orale è altresi’ implicata negli ascessi cerebrali , nella  sinusite cronica e otite, e processi suppurativi della testa e del collo.

  •  Gli aspetti clinici:

            Le infezioni da anaerobi tendono a comportarsi clinicamente in maniera  facilmente riconoscibile. Nell’addome, pelvi e cervello, questi microorganismi sono propensi a formare ascessi caratteristici.Nel polmone, essi o producono ascessi o iniziano processi suppurativi cronici, che frequentemente si estendono allo spazio pleurico (empiema pleurico N.d.T.).D’altro canto , nei tessuti molli, questi batteri tendono  a causare processi ulcerativi nascosti che si estendono lungo le superfici.Il riconoscimento del comportamento caratteristico dei batteri anaerobi in questi distretti anatomici , puo’ aiutare nella formulazione precoce dei giudizi clinici.

• L’odore:

Un senso dell’olfatto ben allenato è una guida utile per il medico. L’odore fetido allerta per la presenza di anaerobi putrefattivi.Ma deve essere enfatizzato che non tutte le infezioni anaerobie sono associate con un odore offensivo , nella esperienza clinica reale, solamente il 50% dei processi anaerobi settici emettono un odore fetido.

• La terapia antimicrobica precedente:

            Un indizio importante della presenza dei batteri anaerobi è il fallimento nelle risposta alla somministrazione precedente di antibiotici inappropriati per questi microorganismi.Uno scenario comune è l’infezione addominale con Bacteroides fragilis che abbia fallito nella risposta con terapia con le cefalosporine o penicilline associate con un amminoglicoside.

*Incidenza delle infezioni anaerobie:

Polmonite aspirativa, ascessi polmonari, polmonite necrotizzante:62-93%

Batteriemia  5-10%

Ascessi cerebrali :60-89%

Infezioni dentarie, sinusiti croniche:52-100%

Empiema toracico: 76%

Sepsi pelvica e intra addominale :60-100%

Osteomielite :40%

Miscellanea di infezioni dei tessuti molli:

            Ascessi mammari :53%-83%

          Ascessi peri rettali :77%

            Ascessi cutanei 60-62%

            Gangrena gassosa 100%

            Piede diabetico ulcerato , o gangrena 85-95%

            Infezioni urinarie inferiore all’1%.

Normalmente le infezioni anaerobie, includono anche  batteri aerobi obbligati, anaerobi facoltativi o microaerofili.Questi microorganismi non anaerobi agiscono assieme diminuendo la tensione di ossigeno e il potenziale redox dei tessuti favorendo la crescita dei microorganismi anaerobi.E’ di interesse clinico che i campioni delle lesioni intraddominali siano  generalmente misti, mentre i campioni di emocolture in soggetti con queste lesioni diano  colture miste solo nel 25-30% dei casi .

            Ovviamente , la diagnosi corretta di infezione da anaerobi dipende dalla concordanza adeguata fra il clinico e il laboratorio e che il clinico sappia valutare bene i segni, sintomi e le condizioni fondamentali associate alle infezioni anaerobie.La presenza del pus con odore fetido è certamente una indicazione principale di infezioni anaerobie.Si deve avere un forte sospetto di infezione da anaerobi in paziente con infezione grave dopo chirurgia intestinale , specialmente chirurgia del colon (principalmente dopo chirurgia per tumore maligno).

            Alcuni esempi delle infezioni che coinvolgono anaerobi di origine endogena:

            Attualmente gli anaerobi piu’ comuni sono Bacteroides, Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium,, Peptostreptococcus, CON RARE ECCEZIONI, TUTTI I MATERIALI RACCOLTI QUALI  FLUIDI CORPOREI, ESSUDATI DA ASCESSI, ASPIRATI TRACHEALI, BIOPSIE, DEVONO ESSERE COLTIVATI ANCHE IN ANAEROBIOSI.

IV.1 INFEZIONI DEL SISTEMA NERVOSO CENTRALE:

            Il focolaio iniziale della infezione è frequentemente nel distretto adiacente alla  apofisi mastoide, orecchio medio o seni paranasali, quando questi siano infettati dai batteri anaerobi.La diffusione   intracranica è facilitata per la tendenza degli anaerobi di invadere i vasi tissutali e sanguigni. Dall’altro canto, la  moltiplicazione degli anaerobi è tenuta uniformemennte bassa fra pazienti con ascesso cerebrale dopo neurochirurgia o trauma della testa. Gli isolati piu’ comuni  in ordine, sono:Peptostreptococchi, specie di Bacteroides, Fusobacteria e Actinomyces. In contrasto , la infezione cerebrale che segue a otite media acuta o sinusite paranasale è dovuta principalmente a microorganismi facoltativi.La meningite purulenta è causata raramente da anaerobi.Pertanto , il recupero di microorganismi anaerobi nel fluido cerebro spinale (liquor) di un paziente con meningite deve allertare il medico della possibilità di una lesione sottostante , come un ascesso cerebrale comunicante.

IV.2 – INFEZIONI DEL TRATTO RESPIRATORIO:

            La infezione piu’ comune del tratto respiratorio superiore nel quale gli anaerobi sono patogeni riconosciuti, è la infezione periodontica (infezione di Vincent).Cosi’ gli isolati piu’ dominanti sono peptostreptococchi, Fusobatteri e P.melaninogenicus .Questo ultimo microorganismo puo’ avere una importanza speciale , poichè è un componente indispensabile nella infezione gengivale.

            Benchè gli anaerobi sono stati isolati da pazienti con sinusite cronica, ascesso peri amigdaliano, otite cronica e mastoidite , la prova della loro importanza clinica è difficile da stabilire perchè, quasi invariabilmente , essi sono incontrati in colture miste con microorganismi facoltativi potenzialmente patogeni.

Infezioni piu’ importanti:

            Angina di Vincent ;una infezione delle amigdale caratterizzata dalla presenza di ulcere coperte da un essudato grigio-scuro di odore fetido.Se non viene prontamente riconosciuta e trattata , la lesione puo’ produrre distruzione estesa dei tessuti nella regione interessata e , in casi rari, puo’ condurre a erosione  e perforazione della arteria carotidea interna e morte per emorragia. Benchè la prova microbiologica del coinvolgimento nella Angina di Vincent di Fusobacterium spp. sia frequentemente difficile , in parte dovuto alla rarità della batteriemia , l’apparenza clinica della lesione , assieme al caratteristico odore dell’alito, è diagnostico evidente di Angina di Vincent.

            Angina di Ludwing :Si tratta di una cellulite batterica acuta che coinvolge gli spazi sub linguali e sottomandibolari.La infezione si estende rapidamente lungo i piani tissutali, senza formazione dell’ascesso o coinvolgimento dei noduli linfatici ,a volte con la concomitante ostruzione acuta del tratto respiratorio , necessitando di tracheostomia , o intubazione.Spesso si richiede il drenaggio.In questi casi, la tracheostomia deve essere effettuata per prima, per evitare l’instaurarsi di problemi respiratori acuti durante o dopo il procedimento.

            Attinomicosi cervicofacciale: è una infezione dei tessuti connettivi duri, frequentemente associata con seni o fistole suppuranti. I batteri responsabili possono essere una delle diverse specie di Actinomyces che sono componente normale della flora orale.Nella maggior parte dei casi , i microorganismi penetrano nel tessuto molle come risultato di manovre odontoiatriche , trauma o malignità precedente.

IV.3 INFEZIONI POLMONARI:

I batteri anaerobi sono patogeni polmonari importanti nelle sindromi cliniche specifiche, includendo alcuni casi di ascessi polmonari, polmonite necrotizzante e empiema.

            Il denominatore comune nella grande maggioranza dei casi è l’aspirazione spontanea di secrezione orofaringea.     

            La batteriologia delle complicazioni infettive per aspirazione , riflette la flora naturale del tratto respiratorio superiore.Nella maggior parte dei casi, vi sono molte specie di anaerobi, dato che i microorganismi dominanti sono Peptostreptococcus, Fusobacterium nucleatum e Bacteroides  melaninogenicus. Nei pazienti che aspirano durante la degenza , la flora infettante consiste di molti anaerobi in associazione con Staphylococcus aureus o bacilli aerobi gram negativi

Polmonite necrotizzante , quando è dovuta a anaerobi è caratterizzata da caverne multiple piccole dentro un segmento polmonare o lobulo.Il decorso è spesso fulminante , coinvolge segmenti multipli e gli indici di mortalità sono alti.Questa è la forma piu’ grave di infezione anaerobia polmoare.Le immagini radiografiche tipiche devono condurre a una rapida somministrazione di terapia antimicrobica parenterale ad alto dosaggio.

            Empiema: le infezioni polmonari anaerobie si possono estendere fino allo spazio pleurico, come risultato della tendenza a causare necrosi tissutale (esempio fistola bronco pleurica) , o per propagazione continua.Dato che queste infezioni hanno la tendenza di essere indolenti, i pazienti spesso si presentano negli stadi avanzati della malattia, quando l’empiema già si è formato.Meno comune, l’empiema anaerobio puo’ seguire una propagazione trans diaframmatica o una infezione sub frenica.La maggior parte degli empiemi anaerobi coinvolge molte specie batteriche , gli isolati principali sono streptococchi anaerobi (o microaerofili come Streptococcus intermedius N.d.T.), Fusobatteri e  Bacteroides melaninogenicus.

IV.4 – ENDOCARDITI:

I batteri anaerobi stretti sono raramente isolati come agenti eziologici nei casi di endocardite.Gli aspetti clinici dei casi di endocardite che coinvolgono questi microorganismi sono generalmente analoghi a quelli causati da Streptococcus viridans .Il decorso è in genere sub acuto , la maggior parte dei pazienti ha un difetto valvolare predisponente, e generalmente si sospetta per una porta di ingresso orale Bacteroides fragilis, Propionibacterium acnes  e anche le specie di clostridi sono quasi sempre implicate.

IV.5 -  INFEZIONI INTRA ADDOMINALI:

            Le concentrazioni piu’ elevate di anaerobi sono normalmente incontrate nell’intestino grosso.Le feci sono una sospensione di 25% di batteri anaerobi vitali.Cosi che , non sorprendemente, lo svuotamento del contenuto del colon, sia dovuto a trauma accidentale o violento, diverticolite o appendicite , malattia infiammatoria dell’intestino, carcinoma o chirurgia , è associato con una alta incidenza di infezioni anaerobie intra addominali.

            La grande maggioranza delle infezioni intra addominali , presto o tardi, è associata con uno o piu’ anaerobi e diversi aerobi ed è difficile decidere quale è il patogeno primario o chiave.

            Tutte le aree sospette devono essere aperte e drenate.Se si trova del materiale purulento, si deve prestare attenzione all’odore del materiale.Se il campione è francamente putrido, di odore fetido si sospetta la prevalenza di infezione anaerobia.Ricordiamo pero’ che non tutte le infezioni da anaerobi hanno questo odore nauseabondo (come detto piu’ sopra).

            IV.6 – BATTEREMIA

            Sul totale, gli anaerobi rispondono per il 5-10% di tutti gli isolati da colture sanguigne clinicamente significative.La chirurgia intra addominale o pelvica, le manovre ginecologiche, il trauma, la malignità o altre cause di apertura della superficie di una mucosa del tratto intestinale o del tratto genitale femminile sono fattori di rischio di batteriemia.Gli aspetti clinici della batteriemia causata da batteri anaerobi gram negativi sono indistinguibili da quelle associate agli aerobi.Febbre alta, tossicità sistemica e leucocitosi sono generalmente presenti.Gli anaerobi gram negativi posseggono la endotossina e la sindrome da shock settico è stata notata nel 20-35% dei pazienti con batteriemia.Fra gli aspetti caratteristici della batteriemia anaerobia troviamo: le porte di ingresso prima menzionate, una incidenza eccessiva di itterizia e una tendenza alla tromboflebite settica con embolizzazione settica a distanza.La istituzione precoce del trattamento anti microbico appropriato altresi’ è stata associata con un risultato generalmente favorevole.

            Di interesse speciale è la batteriemia da clostridi, principalmente C. perfrigens, norvy  e septicum,che viene associata a un decorso devastante caratterizzato dalla necrosi tissutale estesa, anemia emolitica e insufficienza renale.La batteriemia da C. Septicum è associata con il carcinoma del Colon (come per Streptoccocus bovis N.d.T.).

IV. 7 INFEZIONI DELLE FERITE POST CHIRURGICHE:

            Il rischio potenziale di sepsi da ferite è molto alto nella chirurgia di piu’ lunga durata.Le ferite nell’addome inferiore restano infette con maggiore frequenza di quelle dell’addome superiore., probabilmente queste sono con piu’ frequenza prodotte durante il corso della chirurgia intestinale.E’ per questa ragione che la ferita soggiacente a una colostomia è soggetta a un indice di infezione maggiore.La Gangrena gassosa della parete addominale puo’ risultare da una situazione simile ed è una complicazione ancora piu’ allarmante e potenzialmente letale.E’ da rimarcare come la semplice presenza di batteri in una incisione operatoria non è un sinonimo di infezione clinica.La differenza classica fra contaminazione batterica e infezione della ferita è una decisione clinica. I referti di laboratorio indicano soltanto la eziologia microbica di una infezione.

            Una valutazione clinica attenta include i segni locali di sepsi (arrossamento, calore moderato, dolore alla palpazione o essudazione) o l’evidenza della infezione sistemica (brividi, tremori, tossicità).Deve essere enfatizzato che una coltura positiva senza segni clinici non è una malattia infettiva. Clostridium perfrigens (il bacillo della gangrena gassosa) , è piu’ frequentemente un contaminante superficiale oltre che la causa di una infezione gassosa clinica.

            Evidenze cliniche della sepsi della ferita locale raramente sono presenti prima del quinto giorno post operatorio.Le infezioni delle ferite comuni causate da microorganismi aerobi , per la maggior parte coliformi, sviluppano segni clinici intorno al quinto giorno post operatorio.I segni di sepsi della ferita  includono la sensibilità della ferita, che aumenta progressivamente di gravità e la febbre.La cellulite dovuta a microorganismi anaerobi avviene piu’ tardi nel periodo post operatorio, frequentemente fra il sesto e l’ottavo giorno.Un ascesso della ferita che avviene dopo varie settimane o mesi dopo la chirurgia è quasi sempre dovuto a batteri anaerobi, spesso assieme a batteri facoltativi.

            Le infezioni post operatorie delle ferite, dopo chirurgia gastrointestinale sono generalmente dovute a contaminazione della ferita chirurgica da microorganismi endogeni , che hanno accesso alla ferita sempre che l’intestino sia aperto per trauma, malattia o manipolazione chirurgica .Anche quando  avviene lo svuotamento del contenuto intestinale, la incidenza di sepsi in ferite “pulite” è per lo meno tre volte maggiore  di quella di sepsi in ferite nelle quali la carica batterica ha solamente una origine ambientale.Anche se subito siano stati presi tutti i mezzi di sterilizzazione ,  il paziente corre sempre il rischio di contrarre una infezione post chirurgica.

            Un indice di infezione di 5-10% puo’ avvenire dopo una operazione che interessa il tratto biliare , l’intestino tenue, o l’utero-vagina.La incidenza di infezione dopo chirurgia gastrica o duodenale è di poco inferiore. L’indice piu’ basso di infezione 2-5% segue operazioni chirurgiche che coinvolgono solo tessuti molli , stafilococchi  e streptococchi sono i piu’ comuni.Si deve sottolineare che in chirurgia di emergenza , come l’appendicite perforata, ferite traumatiche dell’intestino, l’indice di infezione puo’ raggiungere approssimativamente il 40% dei casi.

IV.8 – INFEZIONI GINECOLOGICHE:

            Le infezioni pelviche costituiscono uno dei principali problemi incontrati nella pratica ostetrica e ginecologica, dovuto alla frequenza con la quale occorrono e al suo potenziale  di severità e compromissione vitale.Le infezioni pelviche hanno un largo spettro clinico riguardo la gravità e comprendono la salpingite fino allo choc settico risultante da un ascesso pelvico che si rompe.

            L’ascesso pelvico, che include anche gli annessi , è associato con gli anaerobi nell’80-100% dei casi.

            Le infezioni dopo la chirurgia ginecologica possono risultare in una invasione dei tessuti devitalizzati con microorganismi normalmente presenti nella vagina o possono conseguire a infezioni degli annessi precedentemente acquisiti.Ascessi ovarici e tubo-ovarici occorrono specialmente dopo isterectomia trans vaginale.

            La sepsi post parto dovuta ad anaerobi puo’ seguire diversi corsi clinici. Benchè l’utero sia frequentemente contaminato con anaerobi della flora vaginale durante parti normali, l’infezione significativa è rara.

            La sepsi post aborto puo’ occorrere fino al 14% delle donne ospedalizzate per aborti incompleti , tuttavia il numero di infezioni severe e che minacciano la vita è decisamente inferiore.In definitiva  , le infezioni da anaerobi rispondono ancora per una porzione significativa delle fatalità associate all’aborto.

            Molte infezioni del canale vaginale sono clinicamente insignificanti e si risolvono spontaneamente con i meccanismi di difesa del paziente. Pero’, in una piccola percentaule  dei pazienti, le infezioni pelviche piu’ gravi che includono gli ascessi, potrebbero sviluppare una infezione del canale. Cosi che, anche una infezione del canale non deve essere ignorata.          

IV.9 INFEZIONE DEL TRATTO URINARIO:

E’ noto che raramente le infezioni del tratto urinario sono causate da batteri anaerobi.Normalmente gli anaerobi non vengono ricercati dall’urina.Gli anaerobi che isoleremo in una urinocoltura normalmente rappresentano una contaminazione uretrale.

            L’unico campione accettabile per la coltura degli anaerobi pertanto sarà la raccolta con la puntura sovrapubica. Anche qui la percentuale di isolamento degli anaerobi è molto bassa.

V  - RACCOLTA DEL CAMPIONE CLINICO

            La Raccolta del materiale adeguato, il trasporto dello stesso al Laboratorio, e altresi’ il corretto  processamento del campione sono i pre requisiti basici perchè si ottengano risultati batteriologici in microbiologia anaerobia.

            Il concetto che il materiale deve essere adeguato, per la coltura degli anaerobi significa  “quel campione non contaminato dalla flora normale di qualunque superficie cutaneo mucosa”.

            Il risultato di un materiale contaminato è assolutamente non interpretabile.

            Sottolineiamo che è responsabilità del medico del reparto la determinazione del materiale da inviare al laboratorio.

            Il materiale deve essere raccolto per puntura con SIRINGA E AGO , NON USARE TAMPONI (vi sono tuttavia tamponi con terreno di trasporto che sono indicati anche per la coltura anaerobia quali il Copan Amies agar gel della Oxoid trattati in atmosfera di N2 per eliminare l’ossigeno atmosferico  N.d.T.).          

            Come regola generale, si fa una adeguata decontaminazione della pelle con sapone chirurgico, alcool iodato, si aspettano 2 minuti e si rimuove nuovamente lo iodio con alcool a 70%.

            Dopo che sia stata realizzata la puntura , nel caso esistano bolle d’aria, le stesse vanno eliminate su una compressa di garza sterile.

            Il materiale deve essere inoculato nel mezzo di trasporto (per esempio Portagerm della Biomerieux N.d.T.) , fornito dal laboratorio, attraverso la perforazione del tappo di gomma del mezzo, dopo la decontaminazione della superficie del tappo con alcool iodato, 2 minuti e rimozione dello iodio con alcool a 70%.

            Il mezzo di trasporto, MANTENUTO A TEMPERATURA AMBIENTE, dovrà essere inviato in Laboratorio nel termine di 2-3 ore , dalla raccolta.

            Nel caso  il medico  non disponga al momento del mezzo specifico, deve eliminare le bolle dalla siringa, chiudere l’ago con un tappo di gomma e inviarlo immediatamente in Laboratorio.Studi recenti e importanti, hanno dimostrato che gli aspirati posti in recipienti anaerobi per il trasporto immediato al laboratorio, nella realtà,  rendono almeno tre volte piu’ colture positive per anaerobi e quasi sei volte piu’ isolati anaerobi dei campioni raccolti con siringhe o trasportati in aerobiosi.

            Nel nostro caso adotteremo il mezzo di trasporto Transbac della Probac (ditta brasiliana di prodotti per batteriologia vedi il sito www.probac.com.br N.D.T.) , molto economico e con buone referenze.

            Riguardo alla emocoltura per anaerobi , si consiglia una prima raccolta solamente per aerobi, una seconda raccolta per aerobi/ anaerobi e finalmente una terza per anaerobi .Pertanto saranno state fatte quattro raccolte per l’emocoltura (nella nostra esperienza vanno bene 2 prelievi con un  set di bottiglie  aerobi+ anaerobi al giorno.Le bottiglie per anaerobi hanno un terreno piu’ ricco di quelle degli aerobi e recuperano meglio  anaerobi facoltativi quali gli enterobatteri delle corrispondenti bottiglie per aerobi N.d.T.)

• Campioni adeguati e tecniche specifiche di raccolta

• Campioni inaccettabili:

Tamponi della gola, tamponi del nasofaringe, tamponi gengivali, espettorato o espettorato ottenuto per suzione oro o nasotracheale, contenuto gastrico, contenuto dell’intestino tenue o grosso, feci, tampone rettale, urina per minzione spontanea o ottenuta con cateterizzazione, tampone vaginale, tampone cervicale, materiale da fistola colo cutanea, materiale superficiale da ulcera da decubito e escare, qualunque materiale ottenuto  SENZA PREVIA DECONTAMINAZIONE DELLA PELLE O MUCOSA.

QUALUNQUE MATERIALE RACCOLTO DA TAMPONE E’ INADEGUATO PER LA COLTURA DEGLI ANAEROBI  ( vedi nota sopra pero’).

VI – TEMPO DI REFERTAZIONE:

            Date le caratteristiche di crescita dei batteri anaerobi e la necessità di un maggior numero di repliche qualche risultato presuntivo potrà essere dato soltanto  dopo 48 ore almeno dall’arrivo del campione nel Settore di Batteriologia , eccetto il Gram .Il tempo per il risultato definitivo è, in media 7 giorni utili , dipendendo dalle caratteristiche dei microorganismi incontrati.

            Troviamo importante menzionare il fatto che la maggioranza delle infezioni da anaerobi SONO INFEZIONI MISTE , sempre sarà necessario realizzare in parallelo la coltura convenzionale da aerobi, ragione per la quale sollecitiamo che  ci siano inviate due richieste :una per la coltura da anaerobi, l’altra per la coltura per aerobi            .

                     VII – ESAME DIRETTO DEL CAMPIONE :

            Il Gram del materiale è molto importante , principalmente per quei campioni che non posseggono odore, ma hanno aspetto purulento, e/o presentano un tessuto necrotico , gas e/o granuli solforici.

            La preparazione dei vetrini per il Gram con   la fissazione con metanolo , è consigliabile rispetto alla tradizionale fissazione con il  calore.

            Il Gram tipico in presenza di anaerobi , mostra neutrofili molto degenerati, un fondo molto sporco , pleiomorfismo accentuato, con una miscela di bastoncelli gram negativi di differente grandezza e forma e , normalmente associati con batteri aerobi, principlamente cocchi gram positivi a grappoli, in coppie e in catene corte , con morfologia di anaerobi o aerobi.

            Le specie  Prevotella-Porphyromonas sono coccobacilli corti mentre bacilli pleomorfi suggeriscono  Bacteroides  fragilis group. (una caratteristica dei batteri anaerobi gram negativi è la scarsa assunzione del controcolorante safranina, pertanto è consigliabile controcolorare con la fucsina dello Ziehl Neelsen ma diluita 1:10 N.d.T.)

VIII – SEMINA DEL MATERIALE:

Mezzi disponibili per l’isolamento primario:

• CDC Agar sangue anaerobi -è un mezzo non selettivo, contiene 5% di sangue di montone , supplementato con estratto di lievito, emina, vitamina K, L cistina per gli anaerobi che richiedono questi supplemneti ( come Prevotella melaninogenica, Fusobacterium necrophorum, ecc.) .L’aggiunta di questi composti a un mezzo base che include Brucella, infuso cuore-cervello , Schaedler e Columbia agar –sangue è un eccellente supporto per la maggior parte degli anaerobi.
• PEA Anaerobio feniletil agar sangue (PEA) .Contiene i medesimi ingredienti  del CDC e in aggiunta il feniletil alcool (2.5 g/L) al fine di inibire la crescita di altri batteri gram negativi facoltativi, principalmente enterobatteri.Siccome il PEA è volatile , le piastre devono essere sigillate con un film plastico e stoccate a 4°C .Il PEA inibisce i Gram negativi , ma non i gram positivi come per esempio stafilo, streptococchi, Bacillus e corinebatteri.
• Anaerobi Kanamicina-Vancomicina Agar: contiene gli stessi ingredienti del CDC Agar e in aggiunta la kanamicina 100 mg/L e la Vancomicina 7.5 mg/L .La kanamicina inibisce la maggioranza dei cocchi gram negativi e la vancomicina inibisce i gram positivi anaerobi o aerobi.La vancomicina a questa concentrazione inibisce anche il Porphyromonas spp.Questo mezzo viene impiegato nell’isolamento della maggior parte dei ceppi di Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, e Veillonella da campioni clinici che contengono una mistura di aerobi e anaerobi.
• Tioglicolato: arricchito con supplemento BBL –0135 C nella formula del Tioglicolato senza indicatore ma con emina e vitamina K.

In vivo, la necessità della vitamina K, è frequentemente ottenuta dalla coesistenza con microorganismi che sono capaci di supplire la necessità del P. Melaninogenicus. Per la coltura , in laboratorio , si aggiungono menadione e emina nel  mezzo di coltura.Dato  che il menadione e l’emina non sono inibitori di altri batteri e l’emina è di fatto uno stimolante per molti , il menadione e l’emina devono essere aggiunti routinariamente a tutti i mezzi usati per la coltura degli anaerobi.

La Nostra proposta è seminare il materiale nel mezzo AnaBAC della Probac (si trova solo in Brasile N.d.T.) e in tioglicolato.

            Il Tioglicolato sarà lo stesso usato dai batteri aerobi , pero’ il materiale,sarà inoculato attentamente , con una siringa, al fondo di una provetta sterile, e in seguito il tioglicolato sarà collocato in questa provetta, sopra il materiale.Queste cure vengono prese per essere sicuri che il materiale  sia al fondo del tubo , dove la anaerobiosi è maggiore.

L’ossigeno dissolto nel brodo, deve essere eliminato, bollendo per lo meno 10 minuti prima dell’inoculo.Anche quando sia adeguatamente ridotto, il tioglicolato deve essere supplementato con 10% di fluido ascitico o siero sterile di coniglio per migliorare la crescita degli anaerobi (si consiglia il tioglicolato brodo con resazurina della Biomerieux per esempio .Il tioglicolato viene universalmente utilizzato soprattutto per la crescita dei germi anaerobi , ma permette anche la ricerca di batteri aerobi N.d.T.).

IX -  INCUBAZIONE DELLE COLTURE:

 Le piastre vanno incubate per 48 ore e reincubate per altri 2-4 giorni , nel caso non vi sia stata crescita, come nel caso per esempio di colonie di  Actinomyces e Eubacterium  .L’inconveniente  è giustamente l’ossigeno che è presente  nel mezzo quando si apre la piastra dopo le 48 ore. Questo puo’ essere di pregiudizio per batteri a crescita piu’ lenta.Una alternativa allora è fare due piastre, 1 viene aperta dopo le 48 ore e l’altra viene aperta dopo massimo 5 giorni.

Sempre l’esposizione delle colonie nell’ambiente , devono essere evitata (l’ideale sarebbe  disporre di cappe specifiche per anaerobiosi! N.d.T.) . Peptostreptococcus anaerobius , specie molto comune incontrata nei campioni clinici, puo’ avere la sua crescita ritardata se rimane esposta nell’ambiente anche meno di 2 ore.

Il tioglicolato non è necessario che sia incubato in anaerobiosi , pero’ il tubo dovrà essere con tappo filettato.Il brodo tioglicolato dovrà essere osservato tutti i giorni e altresi’ osserveremo il tipo di crescita se  aerofila, microaerofila o anaerobia d’accordo con il pattern di crescita dei batteri lungo la provetta.

Finito il termine di 48 ore o 5 giorni, si aprono le giare e il tioglicolato per fare subito un Gram.

Si osserva l’aspetto delle colonie , si osserva il tipo di crescita nel brodo tioglicolato.

            Osservare il tipo di colonie predominanti differenti.

            Fare un Gram di ogni colonia e quindi anche un Gram dal brodo tioglicolato.

            X – TEST DI AERO-TOLLERANZA:

            Isolare ogni colonia ottenuta in anaerobiosi presunta , in sottocolture e incubare in aerobiosi, microaerofilia e anaerobiosi stretta.

Per la coltura in anaerobiosi seminare in AnaBac S ( da noi  per esempio Agar Schaedler 5% di sangue di montone  N.d.T.), per aerobiosi e microaerofilia in agar sangue.

            Incubare lo stesso tempo  della semina primaria .

            Terminata la incubazione , aprire tutte le piastre e, d’accordo con la atmosfera di crescita , classificare i batteri secondo il seguente schema:

+ crescita                                                         - assenza di crescita

            Dopo che si è testata la aerotolleranza del microorganismo , riportare le caratteristiche della colonia e del microorganismo:

• Test di aerotolleranza
• Caratteristica delle colonie
• Pigmenti
• Emolisi
• Pigmento del mezzo
• Gram dei batteri
• Spore
• Crescita in tioglicolato
• Catalasi
• Lecitinasi
• Lipasi
• Reazione in mezzo contenente latte

Con i pannelli per la identificazione degli anaerobi i test biochimici piu’ comuni sono:

• Produzione di Indolo, idrolisi della esculina, riduzione del nitrato, fermentazione degli zuccheri (glucosio, mannitolo, lattosio, ramnosio) crescita in presenza di bile
• Penicillina, Rifampicina, Kanamicina
• Inibizione da parte del polianetol solfato

XI – COLTURA DEGLI ANAEROBI –ROUTINE DI SEMINA E COLTURA:

XII  – PROVE DI IDENTIFICAZIONE:

Mezzi differenziali disponibili:

Il terreno CDC (o l’Agar Schaedler 5% sangue di montone N.d.T.) e il brodo tiogliocolato possono darci colture pure con caratteristiche importanti.I dischetti (disponibili da BD) addizionati ai terreni su colture fresche ci forniscono alcune caratteristiche: Penicillina 2 U, Kanamicina 100 µg e Rifampicina 15µg e disco di nitrato per dimostrare la riduzione del nitrato e altresi’ un disco sterile per il test dell’indolo.

Per testare la riduzione del nitrato si aggiunge al disco, dopo incubazione, 1 goccia di reagente A ( acido sulfanilico) 1 goccia di reagente B , la produzione di colore rosa o vermiglia, indica la riduzione del nitrato.

Dowell sviluppo’ un insieme di 3 piastre ognuna divisa in 4 parti che conteneva un totale di 12 mezzi differenziali capaci di identificare fino a 20 caratteristiche differenti al minore costo.Queste caratteristiche in aggiunta con quelle ottenute nell’agar sangue per anaerobi , brodo tioglicolato  e ai metaboliti identificati usando la cromatografia gas o liquida permette di identificare la maggior parte degli anaerobi incontrati in laboratorio.

Il mezzo base di tutti i quadranti è il mezzo LD (Lombard-Dowell) questo mezzo fu sviluppato per dare supporto alla crescita degli anaerobi fino a quelli piu’ difficili, è lo stesso mezzo usato nella automazione dalla BD e API.

Inoculo e lettura delle piastre:

Fare una soluzione (Mc farland 03), in brodo LD della coltura degli anaerobi isolati.

Inoculare con un tampone sterile ogni quadrante.

Collocare il disco sterile bianco nell’LD agar , questo disco sarà usato per testare l’indolo dopo la incubazione..

Collocare i dischi di antibiotici in Agar sangue x anaerobi :Penicillina 2U, Rifampicina 15 mg, Kanamicina 100 mg. Attenzione a disporre i tre dischetti sulla superficie e calcolare l’alone di inibizone di ognuno:

Penicillina 2U: Sensibile diametro di 12 mm o superiore.Resistente < 12 mm

Rifampicina 15 mg: Sensibile diamtero di 15 mm o superiore.Resistente < 15 mm

Kanamicina 100mg: sensibile diametro di 12 mm o superiore.Resistente < 12 mm.

Osservazione e interpretazione dei risultati:

Mezzi:

Agar sangue : Fare il test di aerotolleranza, caratteristiche della colonia, tipo di emolisi , presenza di pigmento, fluorescenza con UV, pigmento prodotto, morfologia cellulare, Gram , spore, inibizione con Penicillina, Kanamicina e Rifampicina.

Tioglicolato:tempo di crescita, produzione di gas, odore, morfologia cellulare.

• Piastra 01 LD Agar:

1° quadrante: si osserva la produzione di indolo, si aggiungono 2 gocce di p-dimetil amino cinamaldeide.La formazione del colore blu , indica reazione positiva , una formazione di colore rosa vermiglio o violetto o anche l’assenza di colore indica reazione negativa.Osservare la crescita lieve, moderata , alta.

2° quadrante LD esculina Agar:idrolisi dell’esculina, H2S, catalasi (indicato in questo mezzo).

La formazione di colore marrone nero , dopo esposizione per almeno 15 minuti  è indice di idrolisi dell’esculina.Un anello nero dentro la colonia indica produzione di H2S.

Per il test della catalasi  esporre la piastra per 30 minuti , almeno , all’ambiente , aggiungere alcune gocce di H2O2 al 3% , nel caso di reazione positiva le bolle si formano dopo 30-60 secondi.

      3° quadrante: Agar tuorlo d’uovo :lipasi, lecitinasi e proteolisi.

La formazione di una zona di precipitato sotto la colonia indica produzione di lecitinasi, presenza di iridescenza indica produzione di lipasi.

      4° quadrante Agar bile: crescita in bile a 20%, che è paragonato con il tipo di crecita in LD agar.

• Piastra 02

1° quadrante LD Agar glucosio:fermentazione del glucosio ;produzione di acido con formazione di colore giallo.

2° quadrante LD amido: idrolisi dell’amido:

mettere lo iodio (lo stesso usato nel Gram) , lo schiarimento sotto la colonia indica reazione positiva, la formazione di colore marrone reazione negativa.

3° quadrante LD latte:idrolisi della caseina. L’area intorno alla colonia rimanendo chiara indica reazione positiva, restando lattiginosa reazione negativa.

4° quadrante LD DNA attività della DNA asi.La formazione di colore rosa o vermiglia intorno alla colonia indica degradazione del DNA.

• Piastra 03:

1° quadrante LD mannitolo Agar: fermentazione del mannitolo

2° quadrante LD Agar lattosio:fermentazione del lattosio

3° quadrante LD ramnosio:fermentazione del ramnosio

4° quadrante LD gelatina:idrolisi.Una reazione positiva indicata dalla formazione di una zona chiara intorno alla colonia è ottenuta con l’addizione di alcune gocce di cloruro di mercurio.

Identificazione in provette:

Agar base: PRAS , piu’ usato come test di fermentazione dei carboidrati.

Secondo la letteratura la produzione in casa dei mezzi come l’identificazione è molto dispendiosa.

Difco e BBL svilupparono un mezzo per identificare i batteri dalla riduzione del nitrato e dal test dell’indolo.Non sappiamo se è stato usato per i batteri anaerobi.

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Mezzo: Indol nitrato codice 7139

Nome (Difco); Triptic nitrato medium codice 0367

            (BBL): Indol Nitrate medium codice: 11200

* Fermentazione degli anaerobi:

Nome: mezzo tioglicolato senza destrosio o indicatore di Eh :codice 7284

Difco:codice 0432                BBL: 11727

            Anaero-Kit Probac: Kit di identificazione dei bastoncelli gram negativi non formanti spore.

            Un discreto laboratorio per la ricerca degli anaerobi deve riconoscere i generi piu’ frequenti ;sono essi: Bacteroides fragilis group, Prevotella-Porphyromonas group, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus magnus, P. anaerobius, P. assaccharolyticus, P. prevotii, Propionibacterium acnes, Eubacterium lentum, Clostridium perfrigens, C. ramosun e Veillonela ssp.

            Altri non sono tanto comuni , ma data la importanza clinica e l’alta patogenicità è fondamentale il suo riconoscimento: Fusobacterium necrophorum, Actinomyces israelii, Propionibacterium, Clostrydium septicum, C. difficile, C. botulinum, C. tetani.

XIII – BATTERI GRAM NEGATIVI NON FORMANTI SPORE:

            Sono principalmente formati dai gruppi :

Bacteroides fragillis, Prevotella-Porphyromonas e Fusobacterium

Identificazione preliminare dei batteri Gram negativi anaerobio obbligati :

  E: crescita in bile uguale o superiore alla crescita in agar LD

          I: crescita inibita

• Bacteroides fragilis:

E’ il piu’ comune batterio anaerobio causa di infezione. Immobile, bastoncelli gram negativi, colonia di 1-4 mm, non emolitica, colonia color cenere, semi opaca.La migliore caratteristica di questo gruppo è la crescita aumentata in presenza di bile.E’ resistente alla Penicillina e Kanamicina, sensibile alla Rifampicina.Tutte le specie del gruppo sono saccarolitiche e idrolizzano la bile esculina.

            * Prevotela e Porphyromonas:

   Prevotela sono moderatamente saccarolitici, pigmentati.

               Porphiromonas: specie asaccarolitica , pigmentati:

            Le specie pigmentate incontrate nelle infezioni umane sono:

Prevotella melaninogenica, P. corporis, P. denticola, P. intermedia, P. nigrens, P. loescheil, P. tannerae.

 Porphyromonas asaccarolitiche:

P gengivalis, P. Endodontes

Molte di queste specie sono comunemente isolate dalla cavità orale da infezioni che coinvolgono la testa e il collo e il tratto respiratorio inferiore, o tratto urogenitale.La maggior parte dei Porphyromonas isolati dalla cavità orale sono probabilmente P. Gengivalis , i Porfiromonas non orali isolati in altre regioni sono probabilmente  P. assacharolytica o P. Endodontalis nella cavità dentale , questa ultima.

La maggior parte delle colonie sono marrone scuro (da bronzee a color cuoio) che emettono fluorescenza alla luce ultravioletta (365 nm).

La loro crescita è inibita dalla Vancomicina, dalla bile, dalla Penicillina e Rifampicina, ma sono resistenti alla Kanamicina, formano indolo.La maggior parte di esse non fermentano gli zuccheri (=asaccarolitici).

Le Prevotela fermentano il glucosio , le specie possono impiegare da 2 giorni a 3 settimane per dare pigmento.Certe specie principalmente Prevotela intermedis e possibilmente  P. Nigrescrens hanno un interesse speciale dovuto alla produzione di  b-lattamasi e in vitro possono essere resistenti alla Penicillina e altri antibiotici.

Al Gram possono essere bastoncelli o coccoidi , inibiti dalla bile.Sono sensibili, ma non sempre a Pencillina e Rifampicina e resistenti a Kanamicina.

• Fusobacterium ssp:

Il prodotto metabolico è soprattutto l’acido butirrico, l’odore di questa sostanza è caratteristica .Fusobacterium è comunemente coinvolto in infezioni serie della cavità corporea.Normalmente provengono  dal tratto gastro -intestinale , genito- urinario, e tratto respiratorio superiore.Assieme a Prevotela-Porphyromonas sono batteri coinvolti piu’ frequentemente in infezioni pleuriche causate da anaerobi (come per esempio nella polmonite da aspirazione, ascessi polmonari, polmonite necrotizzante e empiema toracico).Fusobacterium è altresi’ comune negli ascessi cerebrali,sinusite cronica, metastasi della osteomielite, artrite settica e altre infezioni intra addominali. Fusobacterium nucleatum è la specie piu’ comune.Recentemente è stata posta attenzione per infezioni sistemiche con alta mortalità , in pazienti con neutropenia  causate da Fusobacterium nucleatum .Per tale motivo il suo riconoscimento nel materiale diretto attarverso il Gram è molto importante (si raccomanda di usare come contro colorante fucsina diluita 1:10 N.d.T).La sua morfologia al Gram è quella di batteri lunghi, a spirale e filamentosi.Le colonie sono di 1 o 2 mm.

            Fusobacterium necrophorum puo’ causare altresi’ serie infezioni e  normalmente non è isolato da solo.Al Gram rassomiglia a

Fusobacterium nucleatum , pero’ mostra  pleomorfismo piu’ accentuato.

F. mortipherum e F. Varium , isolati sono frequentemente resistenti alla clindamicina e possono produrre b-lattamasi ,possono presentare un alto pleomorfismo (cocchi e filamenti).Essi sono resistenti alla Rifampicina che aiuta a distinguerli da altri Fusobacterium, Bacteroides, Porphiromonas e Prevotela.

XIV – IDENTIFICAZIONE DEI COCCHI ANAEROBI :

* Cocchi gram positivi:

 Famiglia  Peptococcaceae:

 Peptostreptococcus, Peptococcus, Ruminococcus, Sarcina

Cocchi anaerobi obbligati, inequivocabilmente gram positivi, che sono presenti in catene o a grappoli , sono stati oggetto di vari studi sin dall’inizio del secolo scorso.La loro presenza è stata documentata in una varietà di sindromi, che includono la endocardite, ascessi cerebrali , sepsi puerperale , ferite traumatiche e fascite necrotizzante post operatoria.Fanno parte della flora normale della bocca, tratto respiratorio superiore, tratto intestinale, vaginale e pelle.In passato la reazione di Gram e la produzione di catalasi erano usate per differenziare fra i cocchi anaerobi.Ma tutti questi criteri sono insoddisfacenti.Alcuni degli streptococchi anaerobi come alcuni streptococchi aerobi , si discolorano molto facilmente e appaiono Gram negativi.Molte colture hanno catene corte e basandosi sulla disposizione cellulare , possono essere classificati come Peptococcus o Petstostreptococcus .Finalmente , la produzione di catalasi è variabile fra i ceppi di una unica specie. I cocchi anaerobi pertanto sono adesso separati in generi , tenendo presente principalmente i loro prodotti metabolici. I cocchi anaerobi che hanno la piu’ alta reazione , fermentano vari carboidrati e producono acido lattico come unico prodotto principale della fermentazione, sono anaerobi ma possono essere  fino ad aerotolleranti, somiglianti agli streptococchi.

            I ceppi di alcuni di questi streptococchi anaerobi possono essere certamente anaerobi all’isolamento iniziale ma, dopo un adattamento alle condizioni di laboratorio, essi crescono ragionevolmente bene, o anche molto bene, in concentrazioni crescenti di ossigeno.Altri ceppi, benchè apparentemente appartenenti alla stessa specie , sono incapaci di adattarsi alle condizioni del laboratorio e rimangono anaerobi.

S intermedius (trovato in alcuni casi di empiema pleurico nel nostro laboratorio N.d.T) , parte della flora normale della bocca , vagina e feci, è frequentemente presente in campioni clinici.Idrolizza la esculina, fermenta il cellobiosio, fruttosio, glucosio, lattosio, maltosio , salicina  e saccarosio. Indolo non è prodotto e nitrato non è ridotto.

            I peptococchi e peptostreptococchi sono, generalmente , cocchi anaerobi gram positivi non reattivi e le specie sono differenziate principalmente  con base nella produzione degli acidi dalla fermentazione.La produzione di catalasi, benchè sia un utile segnale, non puo’ essere usata come l’unico mezzo di differenziamento fra le specie di peptococchi e peptostreptococchi.Le quattro specie piu’ comunemente isolate sono Peptococcus magnus, P. assacharolyticus, P. prevotii e Peptostreptococcus anaerobicus.. P. magnus non è fermentante , generalmente digerisce la gelatina e non produce acido butirrico.La crescita viene aumentata se Tween 80 è incorporato al mezzo. P. assacharolyticus e P.prevotii non sono fermentanti e producono acido butirrico.La produzione di indolo da parte di P. assacharolyticus si differenzia da  P. prevotii. Peptostreptococcus anaerobicus fermenta francamente il glucosio e , frequentemente , il maltosio , non produce indolo e produce piccole quantità di acido acetico, isovalerico e/o isocaproico, frequentemente con tracce di altri acidi volatili.Di questi, tutti, meno  P. magnus producono gas da peptone o carboidrati.La produzione di gas è di importanza speciale perchè essi causano la miosite “pepto streptococcica” e la cellulite crepitante , che possono simulare la gangrena gassosa del tipo clostridio.La diagnosi differenziale viene fatta dall’esame diretto del campione colorato al Gram, dell’essudato purulento delle aree coinvolte che presentano crepitazione.Nel primo caso, il tratto predominante sarà quello di catene di cocchi gram positivi , in quanto nell’ultimo caso, troviamo grandi bacilli gram positivi.

 * Cocchi gram negativi.

 Famiglia  Veillonellaceae:

Veillonella, Acidaminococcus, Megasphaera.

La veillonella e gli acidaminococchi sono piccoli cocchi sferici che , caratteristicamente, occorrono in masse irregolari. Benchè siano descritti come gram negativi , colture giovani (meno di 12 ore ) , possono colorarsi come Gram positivi..Le veillonelle producono acido propionico, acetico, isovalerico e idrogeno.Non hanno glicochinasi e non possono metabolizzare glucosio , ma possono usare lattato o acido piruvico come fonte di energia.Le veillonelle possono essere selettivamente isolate nel laboratorio dalla coltura in mezzo contenente acido piruvico o lattato come unica fonte di carbonio, vancomicina o streptomicina  possono essere aggiunti  come agenti inibitori.

            Le colonie in superficie sono piccole rotonde e lisce. Veillonella riduce il nitrato ma non produce indolo.La sua azione sopra il perossido di idrogeno è variabile ed è utilizzata per separare le due specie: V. Alcalescens produce gas dal perossido di idrogeno e V. Partulai non lo produce.Le Veillonelle fanno parte della flora normale della bocca, vagina e , in alcune persone , dell’intestino tenue.Sono raramente isolate dalle infezioni cliniche e qualunque  segnalazione come patogeno è dubbia.

Acidominococcus fermantans è un componente della flora isolato per prima e descritto nel rumine , ma , in seguito, fu isolato dalla flora normale della vagina e feci di esseri umani e molto raramente, da campioni clinici.

XV – BASTONCELLI GRAM POSITIVI NON FORMANTI SPORE:

Formati da:

Actinomyces, Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus, Propionibacterium.

*Actinomyces:

Actinomyces israelii e A.naeslundii,sono gli attinomiceti patogeni piu’ comunemente isolati.

            La morfologia al Gram di Actinomyces è ben caratteristica (intreccio di filamenti) .Quando trapiantati in agar e incubati in anaerobiosi durante la notte, microcolonie di ceppi tipici di A. Israelii paiono essere composti da un intreccio di filamenti delicati ramificati che si irradiano da un unico punto mal definito.Questo tipo di crescita  è stato chiamato “ a tela di ragno” o crescita tipo A. Israelii, dopo 7-14 giorni di incubazione a 35°C , apparenza di “dente molare” .Colonie di A.naeslundii piu’ vecchie sono generalmente lisce e non hanno l’apparenza a “ dente molare”  .Purtroppo non tutti i ceppi sono tipici e i ceppi con proprietà intermedie tra quelle descritte delle due specie, sono state isolate.Al Gram , molte volte appaiono come cocchi.Altre volte , possono presentare , in tioglicolato, lunghe catene.E’ importante ricordare che con l’invecchiamento , possono trasformarsi in gram negativo.

Actinomyces fermentano male, non producono indolo, la maggioranza dei ceppi riducono il nitrato.

            Il tipo di crescita in tioglicolato, l’apparenza delle microcolonie aiuta a differenziare le due specie. In generale , i ceppi di A. Israelii , sono piu’ filamentosi e crescono con minore rapidità dei ceppi di A. Naeslundii . Di conseguenza le colture nel brodo di tioglicolato di A. Naeslundii mostrano tipicamente un massa fioccosa con alcuni granuli morbidi , mentre i ceppi di A, israelii formano, tipicamente , piccole colonie discrete “tipo mollica di pane” . Quando una di questa mollica è schiacciata e colorata al Gram , sono osservate masse intrecciate di filamenti che si ramificano e forme frammentate “tipo difteroide”.

*Propionibacterium:

Le due specie piu’ comuni , P. acnes e P. granulosum possono essere isolate con relativa frequenza da emocolture ma raramente sono associate a endocardite o ascessi polmonari .Dato che questi propionibatteri sono parte normale della pelle, essi sono dei contaminanti di laboratorio comuni o possono crescere in emocolture da contaminazione della pelle al momento del prelievo se la superficie è stata non correttamente  decontaminata prima del prelievo del campione di sangue.Per questa ragione, la interpretazione del significato di un isolato deve essere presa con cautela.Il dilemma è lo stesso se isoliamo Staphylococcus epidermidis  da una coltura sanguigna. Pero’ esistono vari casi ben documentati di infezione.

            Le specie del genere Propionibacterium sono altresi’ bacilli pleomorfi , gram positivi che assomigliano morfologicamente ad Actinomyces , fino ad un certo punto con i bifido batteri.Le cellule sono frequentemente claviformi in una estremità e a punta nell’altra e si dispongono a forma di V e Y. I filamenti sono comuni in alcuni ceppi.In generale, le cellule di propionibatteri non sono grandi come bifidobatteri .Le colonie in superficie sono piccole, opache e convesse, somiglianti a una perla. Benchè la produzione di catalasi è stata utilizzata per differenziare i ceppi di Propionibatteri dai ceppi di Actinomyces , questo test non è molto utile come era considerato. Approssimativamente 1/3 dei ceppi di P. acnes sono catalasi negativi e una specie di Actinomyces  (A. viscosus) è catalasi positiva.P. acnes digerisce la gelatina e generalmente produce l’indolo , che la differenzia da Actinomyces . P.granulosum , non produce indolo, nè riduce nitrato ma generalmente produce catalasi.

*Eubacterium:

Fra i bastoncelli gram-positivi che non formano spore, il genere Eubacterium è metabolicamente, il piu’ eterogeneo. Benchè la maggioranza delle specie sia fermentante , la specie isolata con maggiore frequenza dai campioni clinici, cioè E. Lentum, non è fermentante.Le specie fermentanti di Eubacterium metabolizzano carboidrati o con la produzione di acido butirrico e altri, o con varie combinazioni di acidi acetici, formico, succinico e lattico. L’acido propionico non è utilizzato.

            Benchè gli eubatteri siano parte della flora intestinale normale umana,le specie che sono fra le piu’ numerose nel tratto intestinale , sono raramente isolate in un laboratorio clinico. Le specie di Eubacterium isolate con piu’ frequenza dai campioni clinici sono :E. Lentum, E. Limosum e E. Alactolyticum .E. lentum si incontra con una certa frequenza, fra gli anaerobi, in emocolture (frequente quanto B. Fragilis ) e occasionalmente in ascessi.E’ un bastoncello corto gram-positivo , che si dispone in coppia, assomiglia spesso ai diplococchi.Bastoncelli gram positivi sono generalmente osservati in strisci. E. limosum  è stato isolato da colture sanguigne di diversi ascessi.E’ un bastoncello di colorazione abbastanza evidente che puo’ avere alcune forme bifide. E. Alactolyticum  assomiglia ai propionibatteri rispetto alla forma e alla coltura,, ma ha un quadro diverso di fermentazione..La maggior parte dei ceppi sono isolati da ascessi pleurici, ma altri ceppi sono stati isolati da altri tipi di ascessi.Dato che  gli eubatteri raramente sono isolati in colture pure, non sono frequentemente considerati come patogeni primari.

*Bifdobacterium:

I bifidobatteri sono bastoncelli pleomorfi anaerobi gram positivi, che frequentemente hanno biforcazioni a forma di Y, le forme clavate come le forme filamentose sono comuni. Pero’ non tutto cio’ che si mostra bifido è un bifidobatterio.

I bifidobatteri sono isolati occasionalmente da campioni clinici e , anche cosi’, quasi sempre in combinazione con altri microorganismi, e il significato patogeno di questi ceppi nelle infezioni umane ancora non è stato chiarito. Pero’, i batteri intestinali paiono esercitare un effetto protettore contro la colonizzazione di specie di Shigella in neonati e bambini in allattamento.

            Benchè la tumescenza frequentemente ritiene la colorazione per le spore, non c’è nessuna evidenzia di resistenza al calore in questo gruppo di anaerobi.Le colonie di superficie sono piccole, rotonde , opache e convesse , delle volte con un bordo piatto, translucido.Sebbene la maggior parte dei ceppi siano anaerobi obbligati , alcuni cresceranno in piastre incubate in atmosfera di CO2.I bifidobatteri sono parte della flora normale intestinale (specialmente fecale), boccale e vaginale. I carboidrati sono attivamente fermentati e la presenza di un carboidrato fermentabile intensifica molto la crescita.Le specie del genere sono differenziate in base ai carboidrati fermentati.Prodotti finali della fermentazione sono acido acetico, lattico e , frequentemente, formico, con piu’ acido acetico che lattico. L’idrogeno non è prodotto.

            Data la sua ramificazione bifida e la presenza di filamenti in alcune colture , la specie adesso riconosciuta come B. Eriksonii, fu primariamente descritta come un attinomicete. B. Eriksonii è stata isolata in ascessi polmonari, addominali e cutanei nell’uomo.Essa è sierologicamente distinta, da studi con anticorpi fluorescenti , dagli attinomiceti.

            Per la identificazione completa, è necessario disporre della cromatografia gas-liquido.

            * Prova della catalasi:

Catalasi positiva: Propionibacterium sp

                             Propionibacterium acnes è anche indolo positivo.

Catalasi negativa: Eubacterium sp, Actinomyces sp, Bidifobacterium.

Osservazione: notare che il test della catalasi funziona, quando la colonia cresce nel mezzo esculina, e prima di fare il test, lasciare la colonia 30 minuti, almeno, esposta all’ambiente.

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XVI -  BASTONCELLI GRAM POSITIVI CHE FORMANO SPORE:

*Test dell’alcool:

 1) Batteri: da brodo tioglicolato è 24 ore

 2) Prendere una provetta sterile: 1 mL di tioglicolato + 1 mL di alcool assoluto.

 3) incubare 1 ora a temperatura ambiente.

 4) Seminare in Agar sangue per anaerobi e incubare in anaerobiosi per 48 ore.

Interpretazione: se crescono bastoncelli gram positivi sporulanti: Clostridium spp.

Clostridium species

C. perfrigens è la specie piu’ isolata, tuttavia fra gli anaerobi il genere Clostridium  è isolato nel 10-20% dei casi.

            Il genere Clostridium , fa parte della normale flora del tratto gastro-intestinale, ma puo’ alcune volte risiedere nella pelle, dove molti Clostridium, isolati nel sangue , hanno il significato di contaminazione accidentale, non avendo, pertanto significato clinico.Tuttavia la patogenicità di Clostridium, si puo’ manifestare solamente in alcune circostanze , per questo il grande valore dello scambio di idee fra Microbiologo e il Medico.

C. difficile:è stato stimato causare il 60-70% dei casi di colite associata all’antibiotico terapia.

Molte specie variano secondo la aerotolleranza.Alcune volte sorgono problemi di isolamento, nonchè identificazione , in quanto la aerotolleranza del Clostridium si sovrappone all’anaerobiosi facoltativa di alcune specie di Bacillus.Clostridium aerotollerante raramente forma spore quando cresce aerobicamente ed è catalasi negativo mentre le specie di Bacillus raramente formano spore quando crescono in anaerobiosi e producono catalasi.

Morfologicamente, i clostridi sono altamente pleomorfi, variando da bacilli corti e spessi, a forme allungate, filamentose che sono dritte o leggermente curve.Quando le colture giovani si colorano al Gram, sono generalmente gram positive, pero’ questa caratteristica è rapidamente perduta in vetrini preparati da colture piu’ vecchie.Esistono alcune specie di Clostridium che sempre si colorano di Gram negativo , e che, sono realmente bacilli anaerobi gram negativi formanti spore! Oltremodo , i vacuoli comuni in alcune specie di Bacteroides possono confondersi con spore.

In Clostridium perfrigens la dimostrazione delle spore è frequentemente difficile.

La dimostrazione delle spore e la colorazione di Gram sono molto importanti, nonostante cio’, molte volte la dimostrazione della presenza di spore resta molto difficile.E’ utile osservare le cellule batteriche con il microscopio a contrasto di fase e per aumentare la produzione di spore inoculare in Agar inclinato di carne cotta  e incubare in anaerobiosi per 5-7 giorni a 30°C, osservare in contrasto di fase.

Dopo una incubazione overnight le colonie presentano da 1 a 3 mm di diametro.

In Agar sangue per anaerobi  , dopo 24 ore di incubazione a 37°C , si nota una zona di doppia emolisi.

Gram della colonia in tioglicolato:Bastoncelli gram positivi con poco pleomorfismo, rari filamenti.

Il gram dal materiale si puo’ mostrare come bastoncelli Gram negativi e Gram positivi di lunghezza variabile, frequentemente circondate da una capsula.Questa ultima puo’ essere maggiormente visualizzata con l’aggiunta di una goccia di negrosina a una goccia di essudato.Dato le numerose tossine extracellulari necrotizzanti prodotte dai clostridi , esiste molto tessuto necrotico di fondo senza cellule infiammatorie intatte o fibre muscolari.

I batteri sono BGP bastoncelli gram positivi con le estremità rotonde, la crescita in brodo mostra cellule corte e coccoidi e in colture vecchie possono presentarsi filamenti.

La produzione di lecitinasi , in Agar uovo-yoghurt e la fermentazione del latte , è una caratteristica di questa specie .

Clostridium septicum , è conosciuto come un patogeno animale, ma è stato incontrato negli esseri umani negli ultimi anni, frequentemente associato a malignità.Si accredita che il tratto intestinale è la sorgente del microorganismo , e la maggior parte degli isolati provengono da emo colture. Nell’agar solido, C. septicum , frequentemente cresce come un film trasparente , e puo’ essere non visto a meno che le piastre siano esaminate attentamente molto da vicino.Colonie isolate possono essere ottenute piastrando su agar “duro” (4%).

XVI  - TEST DI SENSIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI:

Il successo  del trattamento delle infezioni da anaerobi associata all’antibiotico terapia, dipende non solo da una antibiotico terapia adeguata, ma anche dalla rimozione dei batteri con il drenaggio dell’ascesso, eliminazione dei corpi estranei, pulizia del tessuto necrotico.

            Il metodo della eluizione del disco in brodo e del disco in Agar diffusione non sono raccomandate , secondo la Bibliografia, soltanto l’agar diluizione sono metodi standardizzati dall’NCCLS .

Possono essere necessarie 24-72 ore per osservarsi una crescita nel test di sensibilità.

Il controllo continuo e l’attività di monitoraggio degli antibiotici contro gli anaerobi sono necessari perchè è risaputo che la sensibilità cambia con il tempo e l’uso di antibiotici.Per esempio ,negli ultimi anni, molti ceppi di Bacteroides  fragilis sono diventati piu’ resistenti alle tetracicline. Puo’ essere che un cambiamento puo’ avvenire anche rispetto ad altri antibiotici.Da qui la necessità di controllo continuo.

In passato , i medici erano poco consapevoli della importanza degli elementi anaerobi e dirigevano la terapia ai tradizonali colpevoli, come i microorganismi coliformi e enterococchi. L’attuale peso della evidenza suggerisce, pero’ che queste infezioni anaerobie “non trattate” danno  una alta mortalità.Per esempio, la negligenza benevolente a Bacteoides fragilis , in infezioni miste è associatacon una mortalità del 60%, in quanto che il trattamento antimicrobico appropriato in alcuni studi ha ridotto il risultato fatale a solamente il 15%.

Le infezioni anaerobie frequentemente contano una collezione di batteri che varia nella sua sensibilità all’ossigeno e nel suo potenziale patogeno.Decisioni terapeutiche razionali per le infezioni anaerobie coinvolgono nuovi aspetti della patogenesi e dell’efficacia antimicrobica.Storicamente , i medici hanno appreso il concetto della “monoeziologia microbica”. Un unico microorganismo (come Pneumococco) causa una sindrome specifica trattata specificamente con Penicillina. Pero’, nella realtà, le infezioni anaerobie seguono una serie differente  di regole relazionate piu’ da vicino a sinergia microbica :cio’ significa , vari microorganismi agendo insieme per riprodurre un processo patogeno.

Le infezioni dell’addome e del tratto genitale femminile, frequentemente producono come media cinque specie distinte , generalmente tre tipi di anaerobi e due forme aerobiche.In queste circostanze , le combinazioni di antibiotici potrebbero essere necessarie per coprire i vari patogeni potenziali.

In vista del fatto che i batteri anaerobi, con poche eccezioni, dimostrano un quadro uniforme di sensibilità agli antibiotici, diventa possibile al medico selezionare un antibiotico appropriato basandosi sulla identificazione presumibile del microorganismo.Oltre a cio’ , vari saggi clinici hanno dimostrato la efficacia di certi antibiotici nelle infezioni anaerobie cliniche.

Penicilline: molti batteri clinicamente importanti sono sensibili a livelli facilmente attingibili di penicillina G. Gli anaerobi associati con la flora orale come   Fusobacterium, P. Melaninogênicus e streptococchi anaerobi sono esempi di ceppi altamente sensibili.Questi batteri sono responsabili di infezioni polmonari , ascessi cerebrali e infezioni della testa e del collo.La maggior parte dei ceppi di clostridi è altamente sensibile alla penicillina.La principale eccezione al quadro è Bacteroides fragilis , dato che una grande percentuale di questi ceppi o sono resistenti o richiedono alte dosi per ottenere una soppressione nella crescita.Alcuni ceppi di B. fragilis , contengono penicillinasi , un enzima che distrugge questo antibiotico .Per questi ceppi , anche dosi molto alte di Penicillina probabilmente saranno clinicamente inefficaci.La sensibilità in vitro alla ampicillina è paragonabile a quella della penicillina G.

Cefalosporine : Con referenza agli anaerobi , la cefalotina ha uno spettro di attività comparabile a quella della penicillina . La maggioranza dei ceppi di Bacteroides fragilis, è resistente e alcuni ceppi producono cefalosporinasi.Una classe piu’ nuova di questi antibiotici, la cefazolina, ha un indice di attività piu’ alto contro i batteri anaerobi. Pero’ non esistono saggi clinici disponibili per indicare se le dosi alte di cefazolina siano soddisfacenti nel controllo della sepsi da anaerobi.

Cloramfenicolo:Una grande varietà di batteri anaerobi hanno una eccellente risposta alla sua attività.Alcuni medici dimostrano pero’ riluttanza nell’usare il cloramfenicolo dovuto ai suoi effetti secondari ematologici molto ben diffusi.

Clindamicina : ha una buona attività contro la maggior parte degli anaerobi, incluso B. fragilis .Piu’ del 97% degli isolati clinici sono sensibili ai livelli ottenibili di clindamicina alle dosi raccomandate.Si sono avute delle relazioni di certi Fusobatteri, Peptostreptococcus e specialmente Clostridi che sono resistenti alla clindamicina.La clindamicina è stata usata con successo nelle infezioni pleuropolmonari severe , infezioni intra-addominali severe, setticemia e infezioni severe della pelvi femminile, specialmente quelle che coinvolgono B. fragilis. Guarigioni cliniche sono state ottenute in una alta percentuale di pazienti che ricevono questo antibiotico.

Eritromicina: I batteri anaerobi esibiscono vari gradi di sensibilità alla eritromicina.Dovuto alla difficoltà nella somministrazione di questo antibiotico per via parenterale, la via orale è frequentemente usata. Pero’, saranno raggiunti livelli ematici relativamente bassi.Soltanto 40-50% dei ceppi di  B. fragillis, Fusobacterium  e streptococchi anaerobi sono sensibili ai livelli raggiunti per via orale.

Tetracicline:Questa classe di antibiotici fu considerata un tempo di scelta per le infezioni anaerobie. Pero’ studi recenti di diversi laboratori dimostrano un alto grado di resistenza specialmente nei riguardi di B. fragilis streptococchi anaerobi .La incidenza dei ceppi resistenti varia dal 30% a 50% degli isolati  clinicamente significanti.

Aminoglicosidi: questa classe include gentamicina, kanamicina, neomicina e streptomicina e quasi tutti dimostrano , consistentemente, una bassa attività contro batteri anaerobi.

Tabella di sensibilità agli antibiotici degli anaerobi

Bacteroides fragilis group  è il batterio anaerobio piu’ isolato. L’antibiogramma di questo batterio è particolarmente importante dovuto alla crescente resistenza agli antibiotici:le penicilline e i suoi analoghi, varie cefalosporine incluse quelle di 3ª generazione, tetracicline, aminoglicosidi e chinoloni.