Programa Nacional de Epidemiología Veterinaria CORPOICA-CEISA
Noticias Epidemiológicas.
Volúmen 2, N° 7.
IDENTIFICACION DE BACTERIAS PATOGENAS
MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE GASES, (HEAD-SPACE).
Seminario
presentado por: Liliana
Margarita Cabarcas Oñoro.
Fuente: H.S.H. Seifert, S. Gierke-Sygussch & H. Böhnel.
(1990). En: “Analytical Microbiological Methods” (A. Fox, S.L. Morgan, L:
Larsson & G. Odham, eds.). Plenum Press, New York. pp. 125-136.
Resumen
La cromatografía de gases utilizando el método
Head-Space (del inglés, espacio frontal), también conocida como Head Space Gas
Chromatography (HSGC) es un método establecido para la identificación de
bacterias anaerobias por medio de la detección de sus productos volátiles de
fermentación. Las características metabólicas de las bacterias son una pauta
bien conocida para su identificación; un criterio bastante preciso para este
propósito puede ser obtenido mediante el análisis por cromatografía de gases de
los productos metabólicos: alcoholes, ácidos grasos de cadena larga y corta, y
de sus componentes celulares. Para el desarrollo de una Cromatografía de Gases
tradicional (CG), usualmente el medio y/o las bacterias lavadas requieren de un
proceso previo a la CG para extraer los componentes volátiles; además, el
proceso de extracción a menudo conduce a la pérdida de varios alcoholes y
ácidos grasos de cadena corta debido a su alta volatilidad. En comparación con
esta situación, la HSGC, permite un aumento significativo de la repetibilidad y
una identificación mucho más segura de cepas bacterianas. Para la HSGC, se
utiliza tan sólo 10 ml (microlitros) de muestra la que es
mezclada con 10 ml de NaHSO4 y luego almacenada en un vial,
el que es sellado y luego sometido a calor mediante termostato. Cuando se
alcanza equilibrio entre la fase líquida de la muestra y la fase gaseosa que
está sobre ella, el tubo de ensayo es automáticamente presurizado con N2
y entonces una pequeña cantidad de la fase de vapor es introducida en el
cromatógrafo de gases. Esto evita desperdiciar tiempo en la preparación de la
muestra y la eventual pérdida de materiales volátiles como sucede con la
extracción con éter. El muestreo del espacio frontal (Head Space) puede ser
considerado como una extracción gaseosa, en la que sólo se recolectan los
constituyentes volátiles, mientras los residuos no vaporizables permanecen en
el vial de muestreo. La muestra bacteriológica es calentada a 125°C por 2
horas, a esta temperatura el material orgánico es vaporizado totalmente y la estructura
celular de la bacteria ha sido expuesta a una baja temperatura de
carbonización. Bajo estas condiciones el análisis también incluye compuestos
volátiles de la pared y del contenido celular. El nuevo sistema de análisis
permite que los alcoholes sean también determinados, al contrario de las
técnicas antiguas donde sólo pocos ácidos grasos - los metabolitos formado por
las bacterias - eran considerados. Estos alcoholes también son formados como
metabolitos del crecimiento de Clostridios en un medio de cultivo
estandarizado. La concentración de
metanol, ,etanol, isopropanol, butanol y pentanol produce seis variables
adicionales que contribuyen a una fácil identificación. El número de criterios relevantes es
suficiente para permitir una diferenciación e identificación estadística
confiable. Alta precisión adicional se ha obtenido mediante automatización de
la metodología.
Este trabajo es altamente relevante para EpiVet gracias a su aporte vital como alternativa mucho más rápida, eficaz y confiable para la tipificación microbiológica de cepas de Clostridium spp. provenientes de campo y de muestras clínicas. Ya los profesionales del laboratorio de bacterias anaerobias del programa buscan las estrategias para iniciar actividades utilizando esta nueva técnica.