Czimbalmos-Kozma Ferenc

csecsemõ és gyermekgyógyász szakorvos

Mecseknádasd, Házi Gyermekorvosi Praxis

Mecseki Zöldkereszt KFT. Mecseknádasd 

Ügyvezetõ Dr. Czimbalmos-K. F.

ELÕZETES BESZÁMOLÓ EGY ÚJ MÓDSZERRÕL A NEM-HIDROSZOLUBILIS ALIMENTÁRIS KOMPONENSEK IMMUNOLÓGIAI VIZSGÁLATA TERÉN

RÖVID KIVONAT

Az immunpatogenézisû gasztroenterologiai betegségek problematikája egyre inkább elõtérbe kerül vártnál nagyobb incidenciájuk kapcsán, ami a legutóbbi epidemiológiai adatokból derült ki. Annak ellenére, hogy sok esetben részletesen ismert úgy a trigger élelmiszer mint az ilyen kórképek autoimmun patomechanizmusa (pl. a cöliákia esetén) mégis indokolt a nagyszámú, az említett kórképekben esetlegesen immunologiai szereppel bíró alimentáris komponens további vizsgálata. Az alimentáris komponensek egy része vizes közegben oldhatatlan és ezért immunológiai szempontból nehezen vizsgálható. Az alábbiakban ismertetünk egy módszert, amely az elõzetes eredmények alapján alkalmasnak tûnik a szerves oldószerekben oldódó alimentáris komponensek immunológiai vizsgálatára és amelynek segítségével nagy tisztaságú elkülönített frakciók nyerhetõk olyan mennyiségben ami akár szûrõvizsgálatokhoz alkalmas kittek készítését is lehetõvé teszi. A módszert a cöliákiában etiológiai szereppel bíró búza és részben a zab vizsgálatával mutatjuk be. Jelen elõzetes beszámolóban szerzõ felvázolja búzaliszt anyagainak szerves oldszerekkel történõ kivonását és ezen kivonatokkal végzett spektrofotometriai méréseinek egyes eredményeit. Ismertetésre kerül egy eljárás, amelynek segítségével a szerves oldószeres extrakcióval nyert és beszárított búzakivonatok felodhatók elektroforézises szeparáció végzésére alkalmas közegben, frakciók nyerésével . A továbbiakban bemutatásra kerül egy szerves oldószeres közegben végzett nem-HPLC oszlopkromatográfiás eljárás, amelynek segítségével kellõ mennyiségben nyerhetõk igen tisztán és elkülönítve a vízben teljességgel oldhatatlan gabonaösszetevõk. Az eljárás a botanikában és mezõgazdaságban fajtaazonosításra is alkalmas lehet.Bemutatjuk a búza és zab kromatogrammjai közti külömbséget, tekintettel a kérdés jelentõségére a cöliákia diétás kezelésében. Az említett, különválasztott frakciók vizsgálatára szerzõ létrehozott egy külön az ilyen anyagok vizsgálatára alkalmas, módosított ELISA eljárást. A különválasztott búzaösszetevõket ezen ELISA módszerrel vizsgáltuk . Az elõzetes eredmények, kevés minta alapján is már azt mutatják, hogy nagyságrendi különbség van az egészséges és beteg szérumának reaktivitásában és a cöliákiás betegek reaktivitása is eltérõ ami a diéta betartásáról is informálhatja a kezelõorvost. Jól látható módon a cöliákiás beteg széruma nemcsak egy komponenssel reagál. A kromatográfia jelentõs különbséget mutat búza és zab közt, a búza egyik anyaga a zabból hiányzik. A bemutatásra kerülõ anyag hangsúlyozottan egy elõzetes beszámoló, célja a kidolgozott módszerek ismertetése és a know-how továbbadása, annak reményében, hogy ezen módszerek segítségével egy késõbbi vizsgálatsorozat végül közelebb vihet a gabonaantigének indukálta kórképek megbízhatóbb kórismézéséhez és egy monitoring rendszer kialakításához amely a különbözõ termõhelyû és évjáratú étkezési gabonák és olajos magvak tisztaságának , fajtaazonosságának és prognosztizálható immunológiai tulajdonságainak követését is lehetõvé tenné és hosszabb távon akár a vékonybélbiopszia visszaszorítását eredményezné a laboratóriumi vizsgálat javára.

KULCSSZAVAK

immunpatogenezisû gasztroenterologiai kórképek, cöliákia, gluténfrakciók, gliadin, kromatográfia, elektroforézis, ELISA.

ABSTRACT in english

Nowadays, gastroenterological diseases are coming into prominence, because recent epidemic data have shown unexpected, increasing incidence of them. Despite both the trigger food and the autoimmune pathomechanism of the diseases are well known (e .g. in celiac disease) it seems reasonable to make further efforts to identify the large number of potentially immunogenic alimentary components. A portion of these components is insoluble in water, therefore, they are difficult to analyse. In this paper a new method is published that, according to preliminary results, seems to be useful in immunological testing of the alimentary components soluble only in organic solvents. The method is suitable for obtaining highly purified separated fractions even in s uc h an amount that immunological kits might be produced of them. The method is demonstrated on the example of wheat and (in part) oat, both playing major ethiological role in celiac disease. This preliminary communication presents an outlined description of the extraction of wheat flour with organic solvents and publishes some spectrophotometric results. A procedure for the preparation of a solution suitable to be subjected an electrophoretic separation of the organic extract is reported. Furthermore, a non -H PLC chromatographic method is described in which an organic eluent is used for very effective separation of the non-polar components of corn on larger scale. The method may be adapted in botany and agriculture for identification of species. The difference between the chromatograms of wheat and oat extracts is also presented. A modified ELISA procedure has been developed to investigate the separated fractions. Though based on a relatively few samples analysed, the preliminary results show that there is a c on siderable difference in the reactivity between the serum of the healthy and that of the ill patients. The serum of the celiacal patients also exhibit remarkable differences and this may be informative for the family doctor whether the patient has kept to his/her diet. It can be seen, that the serum of the celiacal patient reacts with more than one component of the extract. The chromatographic investigations showed, that there is a difference in the composition of the wheat and oat extracts. There is a com po nent present in the wheat extract but absent from that of oat. It should be emphasised that the present paper is only a preliminary communication. Our goal is to report the methods developed in a hope that application of them would help and initiate furth er investigations on diagnostics of corn-antigen-induced diseases. Our methods also may facilitate the creation of a follow-up monitoring system to evaluate the purity, identity and potential immunogenic properties of corn and oil-seed from different habi ta ts and vegetation periods, and even enable the laboratory testing to substitute the duodenal biopsy. The current, widely used methods involve enzymatic hydrolysis of the water-insoluble alimentary components prior to separation. As a result, a large numbe r of fractions is obtained and there is a little or no information about the composition of the original food. To avoid the above difficulties it is proposed to apply the separation by the presented method prior to the enzymatic hydrolysis for the sake of better recognition of the immunomechanism.

KEYWORDS

gastroenterological diseases, celiac disease, fractions of the gluten, gliadin, cromatography, electrophoresis, ELISA, autoimmunity.

BEVEZETÕ

Az immunpatogenézisû gasztroenterologiai betegségek, mint pl. a cöliákia (15,16) problematikája egyre inkább elõtérbe kerül vártnál nagyobb epidemiologiai jelentõségük kapcsán.Ezek a betegségek több gyermeket és fõleg több felnõttet érintenek mint ezt a legutóbbi idõkig gondoltuk. Legutóbb az Orvosi Hetilap közölt nagy összefoglaló cikket a témáról (48/2000 nov. 26, Juhász, M., Zágoni, T., Tóth, M., Tulassay, Zs., : A coeliakia napjainkban : a bõvülõ ismeretek áttekintése). (1,3,6,11,21.) Annak ellenére, hogy sok esetben részletesen ismert úgy a trigger élelmiszer mint az ilyen kórképek autoimmun patomechanizmusa (pl. a cöliákia esetén) (2,8,12,24) vagy a genetikai predispozíció(13), mégis indokolt a nagyszámú, az említett kórképekben esetlegesen immunologiai szereppel bíró alimentáris komponens további vizsgálata. A colitis ulcerosa és a Crohn-betegség esetén például nem ismert a kiváltó ok ami akár alimentáris is lehetne, ezért nem is kezelhetõ diétával úgy mint a cöliákia, amelyet viszont a fent említett két betegséghez hasonlóan szintén steroiddal és immunszupresszívumokkal kellene kezelni, ha nem ismernénk a glutén szerepét. Az alimentáris komponensek egy része viszont vizes közegben oldhatatlan és ezért immunológiai szempontból nehezen vizsgálható. Fehérjék, lipidek, lipoproteinek, glikoproteinek, stb. taroznak ide és antigénként, hapténként, toxinként vagy egyéb módon szerepük lehet az immunpatomechanizmusú gasztroenterológiai kórképek kiváltásában és fenntartásában. Egyes nem hidroszolubilis anyagok, pl. proteinek részleges hidrolízise járható út de nagyszámú frakció és esetleges denaturálódás nehezíti az ilymódon vizes közegben feloldott molekularészletek további vizsgálatát. Az alábbiakban ismertetünk egy módszert, amely az elõzetes eredmények alapján alkalmasnak tûnik a szerves oldószerekben oldódó alimentáris komponensek immunológiai vizsgálatára és amelynek segítségével nagy tisztaságú elkülönített frakciók nyerhetõk olyan mennyiségben ami akár szûrõvizsgálatokhoz alkalmas kittek készítését is lehetõvé teszi. A módszert a cöliákiában etiológiai szereppel bíró búza és részben a zab vizsgálatával mutatjuk be. A szakirodalom szerint a cöliákia immunpatogenézisében a folyamat triggere a búzafehérje gluténfrakciójának alkohololdékony komponense, a gliadin. Ez klasszikus tankönyvi adatnak felel meg, miként az is, hogy a gliadint elsõ sorban 70(-os alkoholban lehet feloldani, vízben nem. Pontosan a búza vízben oldhatatlan, különleges konzisztenciát kölcsönzõ anyagainak köszönhetõ, hogy a liszt tésztává keleszthetõ és belõle kenyeret lehet sütni. A búzaliszt sikértartalmát a sütõiparban, a napi gyakorlatban, adott mennyiségû liszt vizes csirizzé gyúrásával majd folyó víz alatti mosásával és az így nyert rugalmas sárgás labdacs lemérésével határozzák meg, ettõl függ a felhasználandó élesztõmennyiség, dagasztási és sütési idõ, stb. Könnyen belátható, hogy ez a mosott és vízben teljességgel oldhatatlan lisztmaradék is egy bonyolult anyagkeverék. A gabonamagvak minél nagyobb számú komponensének vizsgálata hozhat még felszínre új adatokat a gabonaantigének terén. A továbbiakban új megközelítésbõl próbáljuk az idevonatkozó kérdéseket és kételyeket megfogalmazni. A gabona összetevõi közül a vízben oldhatatlan komponensek úgynevezett „normál” vagy „fiziológiás” körülmények (37( C, vizes közeg, 0,9% NaCl tartalom, 7-es pH, normál légköri nyomás, felületaktív anyagok és poláros oldószerek hiánya, stb.,) között a dolgok természetébõl következõen egész egyszerûen vizsgálhatatlanok. Az eddigi vizsgálatok többsége esetén mintegy az emésztés folyamatát reprodukálva enzimatikus hidrolízisnek vetették alá a gabonakomponenseket.(25,29,30). Ez járható út, de igen nagyszámú frakció keletkezik, több mint amennyi a gabonában valóban van és ezért nehezen vizsgálhatók, illetõleg nem vizsgálhatók maguk az eredeti molekulák és egyes immunológiailag érdekes molekularészletek denaturálódhatnak. A cöliákia kapcsán a gliadin kutatása során eleinte fõleg a proteolitikus eljárások és az aminosav- szekvencia vizsgálatok kerültek elõtérbe , majd a cöliákia immunpatogenézisének tisztázásáé lett a fõszerep, elterjedt az autoantitestek vizsgálata, (4,5,9,10,18,19,20,22,23,26,27,31,32) , bizonyos esetekben biopszia nélkül ellenõrizhetõ a compliance, (14,17,28) nagy vonalakban tisztázottnak tekintik a kiváltó ok kérdését,(7) de mind mai napig semmi nem szorította ki a vékonybél biopsziát a diagnosztikából az elsõ helyrõl mert valójában hiányzik egy megbízható laboratóriumi eljárás, elsõsorban a folyamat kiinduló fázisának nem teljes ismerete miatt . A diagnosztikus lehetõségek bõvítésének céljából próbáltunk gabonaösszetevõket enzimatikus hidrolízis nélkül szétválasztani és tovább vizsgálni. Esetlegesen patogenetikus szereppel bírhatnak ezen anyagok közül bizonyos fehérjék mint antigének, esetleg más molekuláknak haptén szerepe lehet, de a gabonán élõsködõ számtalan gomba mikotoxinja vagy akár a gabona saját, evolúciós csökevényként jelenlévõ toxinjai is érdekesek lehetnek számunkra ( legutóbbi fölvetés Prof. Dr. Módy Jenõ ( publikálatlan közlése alapján ). Ami leginkább kételyeket támaszthat aziránt, hogy a cöliákia bonyolult folyamatát a gliadin adott aminosavszekvenciával jellemezhetõ darabja egymagában indítja el, az egyrészt az, hogy a folyamat kiváltására szintén képes az árpa, rozs és zab, ezek mindenike tartalmaz gliadinszerû anyagokat, de közülük a zabot a gluténmentes diétát tartó cöliákiások egy része késõbb boholyatófia és relapsus nélkül mégis jól tûri (betegség-altípusok ? multifaktoriális patogenezis ?) , másrészt az, hogy a folyamat kiváltásában szerepet játszó anyag vagy anyagok a fehérjéknél igen szokatlan fizikai és vegyi ellenállóképességrõl tesznek tanubizonyságot : õrlés, élesztõs fermentáció (dagasztás), 200 C( feletti hõmérséklet (sütés), nyál amiláz (rágás) majd gyomor-sósav, pepszin, savas közeg, utána lúgos közeg, epe, hasnyál (duodénum), végül bélnedv erõteljes hatása után sem denaturálódnak és képesek egy autoimmunfolyamatot aktiválni. Konvencionálisan lezártnak tekintjük ugyan a cöliákia etiopatogenézisének kérdését , mégsem érdektelen további vizsgálatokat végezni a pontosítás érdekében az összes elérhetõ gabonakomponens bevonásával.

SPEKTROFOTOMETRIA

180 és 1000 nm tartományban abszorbciós spektrofotométerrel vizsgáltuk biotermesztésû, teljes kiõrlésû búzaliszt kivonatait. Ehhez étert, normál-hexánt, acetont, kloroformot, metanolt, 70 %-os etanolt, metanol:kloroform 1:1 arányú keverékét alkalmaztuk. Szembetûnõ az, hogy éppen a klasszikus adatként szereplõ 70%- os etanol adja a legegyszerûbb spektrumot, a többi oldószer esetén több csúcs látható. 400 és 600 nm között abszorbciót mutató anyagok láthatók a fent említett többi, nem etanolos extractumnál, ez a tartomány különben nem jellemzõ a proteinekre ( az extractumok jellegzetes sárga színûek). A továbbiakban a metanol:kloroform 1:1 keverékkel dolgoztunk a kromatográfiás elválasztások során mivel ez az eluens feloldotta a többi szerves oldószeres kivonatból beszárított anyagokat és egy technikailag jól kezelhetõ és kipróbált oszlopkromatográfiás rendszerben használható.

ELEKTROFORÉZIS

Elõkísérletek azt mutatták, hogy a merkaptoetanol tartalmú puffer feloldja a metanol:kloroform 1:1 keverékével búzából kivont majd liofilizált vagy egyszerûen csak szárított anyagot, a kapott oldat elektroforézissel szétválasztható.

1/a.ábra. Elektroforézises lemez

1/b.ábra A fenti elektroforézises lemez részlete

Az ábrákon látható, hogy legalább 9 frakció különíthetõ el, amelyiknek akár mindenike bírhat immunológiai szempontból etiopatogenetikai jelentõséggel, de ennek bizonyítása vagy cáfolata céljából megítélésünk szerint célszerûbb a frakciók nagyobb mennyiségben történõ elõállítása - az elektroforézissel elkülönített anyagok a kevés mennyiség miatt nehezebben vizsgálhatók, habár jól elkülönülnek .

OSZLOPKROMATOGRÁFIA

Sephadex LH-20 gélen metanol:kloroform 1:1 keverékével , pumpával biztosított konstans átfolyó eluensáramban, normál nyomáson, nem HPLC körülmények közt , viszonylag nagyméretû oszlopon ( D = 10 mm, L=300 mm ) végzett, lassú áramú (0,8 ml/min ) , hosszas (100-120 perces) szeparációkkal lehetett 0,5-1 ml - ben feloldott 30-35 mg lisztkivonatot reprodukálható módon szeparálni, átfolyó küvettán 250 nm-en végzett spektrofotometriás mérés és görbe felvétele mellett, a rendszer elvi vázlata a következõ:

2.ábra. Oszlopkromatográfia elve.

3.Ábra. A kromatográfiás berendezés.

A szeparációk során feltûnõ különbségek láthatók a búza és zab kromatogrammjai közt, de az egyes búzafajták vagy ugyanazon minta különbözõ napokon készített kromatogrammjai között is (bomlás). A módszer érzékenysége folytán fajtaazonosításra is alkalmas lehet.

4.Ábra. Zab (balról) és teljes kiõrlésû biobúza-liszt (jobbról) kromatogrammja.

ELISA-MÓDSZER

A szerves oldószeres gabonakivonatok könnyen kötõdnek küvetták, ELISA lemezek mélyedéseinek, stb. belsõ felére, kiváló felületet képezve immunreakciók számára. Az ilyen módon készült antigénfelületek alkalmasnak tekinthetõk ELISA és egyéb reakciók számára, tekintettel a bevezetõben említett nagyfokú ellenállóképességükre a denaturáló tényezõkkel szemben. A szerves oldószerben oldott frakciók az oldószer elpárolgása után kötõdnek a reakcióedény falára majd kiszárítás után az alkalmazott vizes fázisokban a létrejött felületek duzzadnak , de nem mosódnak le. Az ilyen módon a falára kötött antigént tartalmazó mélyedésbe kerül a beteg széruma amelybõl az antitestek az antigénfelülethez kötõdnek, és az öblítés ellenére ottmaradnak. A továbbiakban polivalens antihumán savó és az ELISA módszernél alkalmazott színreakció segítségével mutatjuk ki az esetleg jelenlevõ ellenanyagmennyiséget. A következõkben bemutatjuk azt, hogy ugyanazon búzakivonat két mintájából kis eltolódásokkal szedett frakciók Elisa lemezen hogyan reagálnak a kontroll ill. cöliákiás betegek vérének ellenanyagaival.

5. ábra . Két szeparáció ugyanazon búzakivonatból, a frakcók jelölésével.

6. ábra. Az 5. ábrán látható frakciók az ELISA lemezeken .

A színreakció intenzitása a kötõdõ antitestmennyiséggel arányos, a színtelen küvetták a vakpróbák. A lemezek leolvasása a következõ eredményt mutatja :

7.Ábra. A 6.ábrán látható ELISA lemezek kiértékelése.

Az S1 a kontroll, az S2, 3, 4 a betegek görbéi. A frakciók és a kromatogrammok viszonyát az ELISA teszt eredményével összevetve látható, hogy a betegek vére nem csak egy anyaggal reagál a búzakivonat szétválasztott összetevõi közül. Fontos megjegyezni, hogy igen nagy a frakciókat alkotó molekulák közti mólsúlykülönbség. A frakciókat alkotó molekulák mibenlétének meghatározása érdekes lenne esetleges immunológiai szerepük miatt. A fent ismertetett kromatográfiás eljárással a további vizsgálatokhoz elegendõ mennyiségben nyerhetõk tisztán és elkülönítve az egyes frakciókat alkotó anyagok.

ÖSSZEFOGLALÓ

Gabonakomponensesek közül a szerves oldószerekben a lisztbõl kioldódó keverékeket vizsgáltunk spektrofotometriával, illetõleg választottunk szét elektroforézissel és oszlopkromatográfiával. A kapott frakciókat ELISA lemezen egészséges kontroll és ismert cöliákiások vérének ellenanyagaival reagáltattuk. A reakciók érzékenynek bizonyultak és a frakciók közül nem csak egy anyag mutatott immunológiai aktivitást. A frakcókat alkotó anyagok (gliadin és még más egyebek) pontos kémiai azonosítása és a leírt eljárás nagy esetszámon történõ megismétlése akár új, pontosító adatokat is szolgáltathat a cöliákia témakörében. A negatív eredmény, az immunreakciót biztosan nem adó anyagok azonosítása is értékes, tisztázó jellegû adat. A cikk anyag hangsúlyozottan csak egy elõzetes beszámoló, figyelemfelkeltõ célzattal készült és jó alkalom lehet módszerek ismertetésére és továbbadására, annak reményében, hogy ezen módszerek segítségével közelebb juthatunk a gabonaantigének indukálta kórképek megbízhatóbb kórismézéséhez, a gabonamagvak nagyszámú komponense közül minél többnek a kémiai azonosításához és egy monitoring rendszer kialakításához amely a különbözõ termõhelyû és évjáratú étkezési gabonák és olajos magvak tisztaságának , fajtaazonosságának és prognosztizálható immunológiai tulajdonságainak követését is lehetõvé tenné. Fontos lenne minél több alimentáris antigén szétválasztása és vizsgálata a fenti módszerrel. Colitis ulcerosában, Crohn-betegségben és más gasztroenterológiai betegségben szenvedõ beteg szérumának reakciója ilyen frakciókkal újabb adatokat szolgáltathatna ezen betegségek patomechanizmusának mélyebb megértéséhez.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szerzõ, aki gyakorló falusi körzeti házi gyermekorvos, köszönetet mond mindazon intézet és osztályvezetõknek, akik munkájában támogatták és intézetükbe oldataival, kémcsöveivel és lombikjaival együtt (-az egyre sokasodó laboratóriumi edény- „veszélyt” vállalva -) befogadták, dolgozni engedték és értékes tanácsokkal segítették:

(ábécé sorrendben)

Dr. Baranyai Mária fõorvos (Baranya Megyei Kerpel-Fronius Ödön Gyermekkórház, Laboratórium)

Prof. Dr. Kilár Ferenc (PTE ÁOK Központi Kutatólaboratórium),

Prof. Dr. Németh Péter (PTE ÁOK Immunológiai Intézet),

Dr. Ohmacht Róbert egyet. docens ( PTE ÁOK Klinikai Kémiai Intézet),

Prof. Dr. Pap Zoltán (III. sz. Gyermekklinika , Marosvásárhely, O.Gy. E.),

Prof. Dr. Sulyok Endre (Baranya Megyei Kerpel-Fronius Ödön Gyermekkórház),

Prof. Dr. Szabó László Gyula (PTE Botanika Tanszék) ,

Dr. Varga Levente fõorvos (Baranya Megyei Kerpel-Fronius Ödön Gyermekkórház, Fertozo Osztály)

valamint minden kedves segítõjének az említett intézetek munkatársai közül.

IRODALOM :

1. The controversial epidemiology of coeliac disease. Troncone,-R; Greco,-L; Auricchio,-S Department of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Acta-Paediatr. 2000 Feb; 89(2): 140-1 2. Immunohistological findings in the jejunal mucosa of patients withceliac disease Arató, A., Hacsek , G., Savilahti, E. Scand. J. Gastroenterol. 1998, 228 (Suppl.), 3-10. 3. High prevalence of silent celiac disease in preschool children screened with IgA/IgG antiendomysium antibodies. Korponay-Szabó, I. R., Kovács, J. B., Czinner, A., et al. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 1999, 28, 26-30. 4. Endomysium-ellenanyag coeliakiás gyermekekben: a gluten-sensitivitás okozta vékonybél-boholyatrófia specifikus szerológiai markere. Korponay-Szabó, I., Kovács, J., Lõrincz M., és mtsai. Orvosi Hetilap, 1991, 132, 929-931. 5. Recombinant human tissue transglutaminase ELISA for the diagnosis of glutensensitive enteropathy. Sárdy, M., Odenthal, U., Kárpáti, S., et al. Clin. Chem., 1999, 45,2142-2149. 6. Autoimmune enteropathy and villous atrophy in adults. Corazza, G. R., Biagi, F., Volta, U., et al. Lancet,1997, 350, 106-109. 7. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Dietrich, W., Ehnis, T., Bauer, M., et al. Nat. Med., 1997, 3, 797-801. 8. HLA-DR53 molecules are associated with susceptibility to celiac disease and selectively bind gliadin-derived peptides. Clot,-F; Gianfrani,-C; Babron,-M-C; Bouguerra,-F; Southwood,-S; Kagnoff,-M-F; Troncone,-R; Percopo,-S; Eliaou,-J-F; Clerget-Darpoux,-F; Sette,-A; Greco,-L Laboratoire de Genetique Moleculaire Humaine, Universite de Versailles, 25 avenue des Etats-Unis, 78000 Versailles, France. Immunogenetics. 1999 Aug; 49(9): 800-7 9. Quantitative antigliadin antibody measurement in clinical practice: an Italian multicentre study. SIGEP Working Group on Quantitative AGA Standardization. Catassi,-C; Fabiani,-E; Gasparin,-M; Troncone,-R Paediatric Department, University of Ancona, Italy. Ital-J-Gastroenterol-Hepatol. 1999 Jun-Jul; 31(5): 366-70 Italian-journal-of-gastroenterology-and-hepatology 10. IgA antibodies to tissue transglutaminase: An effective diagnostic test for celiac disease. Troncone,-R; Maurano,-F; Rossi,-M; Micillo,-M; Greco,-L; Auricchio,-R; Salerno,-G; Salvatore,-F; Sacchetti,-L Department of Pediatrics, University Federico II, Naples, Napoli, Italy. J-Pediatr. 1999 Feb; 134(2): 166-71 Journal-of-pediatrics,-The 11. Coeliac disease in the year 2000. Auricchio,-S; Troncone,-R; Maurano,-F Department of Paediatrics, University Federico II, Naples, Italy. [email protected] Ital-J-Gastroenterol-Hepatol. 1999 Nov; 31(8): 773-80 Italian-journal-of-gastroenterology-and-hepatology 12. Majority of gliadin-specific T-cell clones from celiac small intestinal mucosa produce interferon-gamma and interleukin-4. Troncone,-R; Gianfrani,-C; Mazzarella,-G; Greco,-L; Guardiola,-J; Auricchio,-S; De-Berardinis,-P Department of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Dig-Dis-Sci. 1998 Jan; 43(1): 156-61 Digestive-diseases-and-sciences 13. Genome search in celiac disease. Greco,-L; Corazza,-G; Babron,-M-C; Clot,-F; Fulchignoni-Lataud,-M-C; Percopo,-S; Zavattari,-P; Bouguerra,-F; Dib,-C; Tosi,-R; Troncone,-R; Ventura,-A; Mantavoni,-W; Magazzu,-G; Gatti,-R; Lazzari,-R; Giunta,-A; Perri,-F; Iacono,-G; Cardi,-E; de-Virgiliis,-S; Cataldo,-F; De-Angelis,-G; Musumeci,-S; Clerget-Darpoux,-F; et-al. Department of Pediatrics, University of Federico II, Naples, Italy. Am-J-Hum-Genet. 1998 Mar; 62(3): 669-75 American-journal-of-human-genetics 14. Compliance to a gluten-free diet in adolescents, or "what do 300 coeliac adolescents eat every day?". Greco,-L; Mayer,-M; Ciccarelli,-G; Troncone,-R; Auricchio,-S Department of Paediatrics, Federico II University of Naples, Italy. Ital-J-Gastroenterol-Hepatol. 1997 Aug; 29(4): 305-10 Italian-journal-of-gastroenterology-and-hepatology 15. Gluten-sensitive enteropathy. Troncone,-R; Greco,-L; Auricchio,-S Department of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Pediatr-Clin-North-Am. 1996 Apr; 43(2): 355-73 Pediatric-clinics-of-North-America 16. History of coeliac disease. Auricchio,-S; Troncone,-R Department of Paediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Eur-J-Pediatr. 1996 Jun; 155(6): 427-8 European-journal-of-pediatrics 17. Latent and potential coeliac disease. Troncone,-R; Greco,-L; Mayer,-M; Paparo,-F; Caputo,-N; Micillo,-M; Mugione,-P; Auricchio,-S Department of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Acta-Paediatr-Suppl. 1996 May; 41210-4 Acta-paediatrica.-Supplement 18. Diagnostic value of various serum antibodies detected by diverse methods in childhood celiac disease. Sacchetti,-L; Ferrajolo,-A; Salerno,-G; Esposito,-P; Lofrano,-M-M; Oriani,-G; Micillo,-M; Paparo,-F; Troncone,-R; Auricchio,-S; Salvatore,-F AD: Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Universita Frederico II, Napoli, Italy. Clin-Chem. 1996 Nov; 42(11): 1838-42 Clinical-chemistry 19. Immunologic and intestinal permeability tests as predictors of relapse during gluten challenge in childhood coeliac disease. Troncone,-R; Caputo,-N; Micillo,-M; Maiuri,-L; Poggi,-V Dept. of Pediatrics, University Federico II, Naples, Italy. Scand-J-Gastroenterol. 1994 Feb; 29(2): 144-7 Scandinavian-journal-of-gastroenterology 20. Autoantibodies to tissue transglutaminase are sensitive serological parameters for detecting silent coeliac disease in patients with Type 1 diabetes mellitus. Kordonouri,-O; Dieterich,-W; Schuppan,-D; Webert,-G; Muller,-C; Sarioglu,-N; Becker,-M; Danne,-T Department of Paediatrics, Charite, Humboldt University, Berlin, Germany. Diabet-Med. 2000 Jun; 17(6): 441-4 Diabetic-medicine 21. A beta-turn rich oats peptide as an antigen in an ELISA method for the screening of coeliac disease in a paediatric population. Ribes-Koninckx,-C; Alfonso,-P; Ortigosa,-L; Escobar,-H; Suarez,-L; Arranz,-E; Mendez,-E Hospital La Fe, Valencia, Spain. Eur-J-Clin-Invest. 2000 Aug; 30(8): 702-8 European-journal-of-clinical-investigation 22. Determination of anti-omega-gliadin antibodies in serologic tests for coeliac disease. Chirdo,-F-G; Rumbo,-M; Carabajal,-P; Mavromatopulos,-E; Castagnino,-N; Anon,-M-C; Fossati,-C-A Dept. of Immunology and Centre for Investigation and Development in Food Cryotechnology (CIDCA), School of Exact Sciences, UNLP, La Plata, Argentina. Scand-J-Gastroenterol. 2000 May; 35(5): 508-16 Scandinavian-journal-of-gastroenterology 23. Tissue transglutaminase antibodies in celiac disease: assessment of a commercial kit. Sugai,-E; Selvaggio,-G; Vazquez,-H; Viola,-M; Mazure,-R; Pizarro,-B; Smecuol,-E; Flores,-D; Pedreira,-S; Maurino,-E; Gomez,-J-C; Bai,-J-C Clinical Department, Gastroenterology Hospital, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentina. Am-J-Gastroenterol. 2000 Sep; 95(9): 2318-22 American-journal-of-gastroenterology,-The 24. Intravenous or intranasal administration of gliadin is able to down-regulate the specific immune response in mice. Rossi,-M; Maurano,-F; Caputo,-N; Auricchio,-S; Sette,-A; Capparelli,-R; Troncone,-R Institute of Food Science and Technology, CNR, Avellino, Italy. Scand-J-Immunol. 1999 Aug; 50(2): 177-82 Scandinavian-journal-of-immunology 25. Analysis of anti-gliadin antibodies by immunoblot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay using gliadin fractions as antigens. Chirdo,-F-G; Rumbo,-M; Carabajal,-P; Castagnino,-N; Mavromatopulos,-E; Cirincione,-V; Anon,-M-C; Fossati,-C-A Centro de Investigacion y Desarrollo en Criotecnologia de Alimentos (CIDCA), Catedra de Inmunologia, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, La Plata, Argentina. J-Pediatr-Gastroenterol-Nutr. 1999 Aug; 29(2): 171-7 Journal-of-pediatric-gastroenterology-and-nutrition 26. Antibodies to gliadin, endomysium, and tissue transglutaminase for the diagnosis of celiac disease. Vitoria,-J-C; Arrieta,-A; Arranz,-C; Ayesta,-A; Sojo,-A; Maruri,-N; Garcia-Masdevall,-M-D Department of Pediatrics, Hospital de Cruces and Basque University School of Medicine, Bilbao, Spain. J-Pediatr-Gastroenterol-Nutr. 1999 Nov; 29(5): 571-4 Journal-of-pediatric-gastroenterology-and-nutrition 27. Diagnostico serologico de la enfermedad celiaca: anticuerpos anti-peptidos de sintesis de gliadina y anti-transglutaminasa de tejido. [Serological diagnosis of celiac disease: anti-gliadin peptide antibodies and tissue anti-transglutaminase] Piaggio,-M-V; Demonte,-A-M; Sihufe,-G; Garcilazo,-S; Esper,-M-C; Wagener,-M; Aleanzi,-M Catedra de Bioquimica Basica, INTEBIO, Facultad de Bioquimica y Ciencias Biologicas, Universidad Nacional del Litoral, Santa Fe, Argentina. Medicina-(B-Aires). 1999; 59(6): 693-7 Medicina- 28. Anti-gliadin and anti-endomysium antibodies in children with celiac disease consuming a gluten free diet. Barna,-M; Pinter,-E Central Institute for Infectious Diseases, Budapest, Hungary. Z-Ernahrungswiss. 1998; 37 Suppl 1103-5 Zeitschrift-fur-Ernahrungswissenschaft 29. An innovative sandwich ELISA system based on an antibody cocktail for gluten analysis. Sorell,-L; Lopez,-J-A; Valdes,-I; Alfonso,-P; Camafeita,-E; Acevedo,-B; Chirdo,-F; Gavilondo,-J; Mendez,-E Division de Inmunotecnologia y Diagnostico, Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia, La Habana, Cuba. 30. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric micro-analysis: the first non-immunological alternative attempt to quantify gluten gliadins in food samples. Camafeita,-E; Alfonso,-P; Mothes,-T; Mendez,-E Unidad de Analisis Estructural de Proteinas, Centro Nacional de Biotecnologia, CSIC, Madrid, Spain. J-Mass-Spectrom. 1997 Sep; 32(9): 940-7 31. Estudo do anticorpo serico antigliadina da classe immunoglobulina-A na doenca celiaca. [Study of serum antibody antigliadin of the immunoglobulin-A class in celiac disease] Romaldini,-C-C; Barbieri,-D Unidade de Gastroenterologia, Instituto da Crianca Prof. Pedro de Alcantara, Faculdade de Medicina da Universidade de Sao Paulo. Arq-Gastroenterol. 1997 Oct-Dec; 34(4): 254-61 Arquivos-de-gastroenterologia 32. Evaluation of six anti-gliadin antibody assays. Berger,-R; Schmidt,-G Department of Microbiology and Immunology, University Children's Hospital, Basel, Switzerland. J-Immunol-Methods. 1996 May 10; 191(1): 77-86 Journal-of-immunological-methods.

CÍM:

DR. CZIMBALMOS-KOZMA FERENC

7695-MECSEKNÁDASD PF. 24.

TEL. 06 20 9 455 041 ÉS 06 72 463 638

www.geocities.com/drcfhu

email: [email protected]

PÉCS, 2001 május 23.