Pancreas

Insieme degli organi e dei tessuti del corpo che liberano sostanze chiamate ormoni. Le ghiandole endocrine sono prive di dotti e riversano le loro secrezioni direttamente nel sangue, mentre le ghiandole esocrine le liberano su tessuti di rivestimento esterni come la pelle o interni come la mucosa gastrica e la mucosa dei dotti pancreatici. Gli ormoni liberati dalle ghiandole endocrine regolano la crescita, lo sviluppo e il funzionamento di molti tessuti e coordinano i processi metabolici che si svolgono nel corpo. L'endocrinologia è lo studio delle ghiandole endocrine, delle sostanze ormonali da esse prodotte, dei loro effetti fisiologici e dei disturbi e delle malattie conseguenti al loro cattivo funzionamento.

I tessuti produttori di ormoni possono essere suddivisi in tre gruppi: ghiandole endocrine pure, che hanno l'unica funzione di produrre ormoni, ghiandole endocrine-esocrine che, oltre agli ormoni, producono altri tipi di secrezioni, e alcuni tessuti non ghiandolari, che producono sostanze di tipo ormonale.

Ormoni e sostanze di tipo ormonale sono prodotti anche da altri tessuti del corpo. I reni secernono la renina, una sostanza che attiva l'angiotensina (un ormone prodotto nel fegato che fa innalzare la pressione sanguigna), e l'eritropoietina, un ormone che stimola il midollo osseo a produrre i globuli rossi. Il tubo digerente elabora molte sostanze che regolano le funzioni dell'apparato digerente, tra cui la gastrina, che viene secreta dallo stomaco e stimola la secrezione di acidi gastrici nel tubo alimentare, la secretina e la colecistochinina, che vengono liberate dalla parte alta dell'intestino e stimolano la secrezione dei succhi e degli ormoni digestivi da parte del pancreas. La colecistochinina provoca anche la contrazione della colecisti. Negli anni Ottanta si è scoperto che anche il cuore secerne un ormone, il fattore natriuretico atriale, coinvolto nella regolazione della pressione sanguigna e dell'equilibrio idrosalino.

Definire il sistema endocrino dal punto di vista funzionale è diventato più complesso da quando si è scoperto che molti ormoni sono presenti in sedi in cui non agiscono come sostanze endocrine. La noradrenalina si trova, ad esempio, nelle terminazioni nervose dove agisce da trasmettitore degli impulsi nervosi. Alcuni componenti del sistema renina-angiotensina sono stati individuati nel cervello, dove svolgono una funzione sconosciuta. La gastrina peptidica intestinale, la colecistochinina, il peptide intestinale vasoattivo (vasointestinal peptide, VIP) e il peptide gastroinibente (gastric inhibitory peptide, GIP) si trovano anche nel cervello. L'endorfina è presente nell'intestino mentre l'ormone della crescita si trova nelle cellule delle isole di Langerhans. Sempre nel pancreas, gli ormoni della crescita sembrano svolgere un'azione locale inibendo la liberazione di insulina e di glucagone da parte delle cellule endocrine.

Ghiandola mista, avente cioè funzioni sia esocrine che endocrine. Il pancreas è localizzato nella porzione superiore della cavità addominale, dietro allo stomaco, in posizione trasversale. Tale ghiandola ha una forma allungata (misura circa 15-20 cm); il suo peso si aggira intorno agli 80 g.

Nel pancreas si possono riconoscere tre tratti, che prendono il nome di testa, corpo e coda; vi sono due condotti, il dotto di Wirsung e il dotto di Santorini, che convogliano il succo pancreatico verso l'intestino.

La funzione esocrina del pancreas si esplica con la produzione del succo pancreatico, in cui sono presenti numerosi tipi di enzimi; tale secreto viene riversato nell'intestino, a livello del duodeno, nel corso della digestione. La parte esocrina di questa ghiandola è formata da strutture acinose.

La funzione endocrina si caratterizza per la produzione di due importanti ormoni, l'insulina e il glucagone. Le cellule endocrine nel pancreas sono raggruppate in strutture che prendono il nome di isole di Langerhans. I due ormoni vengono riversati direttamente nel sangue, dal quale vengono trasportati alle cellule. Essi risultano essenziali per la regolazione del metabolismo degli zuccheri.

Il pancreas svolge sia funzioni digestive che ormonali. Costituito principalmente da tessuto esocrino, secerne e riversa nell’intestino tenue diversi enzimi per la demolizione di grassi, carboidrati e proteine. Le isole di Langerhans, ammassi di cellule endocrine pancreatiche, producono il glucagone e l’insulina, ormoni coinvolti nella regolazione della concentrazione di glucosio nel sangue (glicemia).

Le malattie del pancreas non sono frequenti, ma gravi. La pancreatite acuta si verifica quando la ghiandola tende ad autodigerirsi, per azione degli enzimi da essa stessa prodotti. In tal caso, si manifestano vomito, dolore molto intenso nella parte superiore sinistra dell'addome, aumento della glicemia (concentrazione del glucosio) e presenza di alcuni enzimi del pancreas nel sangue; può verificarsi paralisi intestinale e, se non si interviene tempestivamente, la patologia può risultare letale. I sintomi dell'infiammazione del pancreas possono essere confusi con quelli della peritonite. La pancreatite viene affrontata in modo da favorire nel paziente il flusso dei succhi digestivi, con flebo per ripristinare l'equilibrio degli zuccheri e dei liquidi nel sangue; con antibiotici per eliminare eventuali batteri che possono essere i resposabili dell'infiammazione; con intervento chirurgico, per eliminare la parte di ghiandola che è stata danneggiata e per fermare eventuale emorragia.

La pancreatite cronica può svilupparsi in soggetti alcolisti o in pazienti colpiti da colecistite (infiammazione della cistifellea); può determinare senso di nausea, dimagrimento per cattivo assorbimento delle sostanze nutritive, limitata tolleranza per i grassi.

Essa richiede un tipo di alimentazione particolare, che limita l'apporto di grassi, e la terapia di eventuali affezioni della cistifellea (in particolare, la presenza di calcoli), che sono in relazione con le infezioni del pancreas.

Una grave patologia ereditaria che colpisce il pancreas (ma anche altri organi, tra cui i polmoni) è la mucoviscidosi, caratterizzata dalla produzione di secreti eccessivamente densi; tale patologia si manifesta già nei neonati con malassorbimento delle sostanze nutritive, diarrea o, per contro, ostinate occlusioni intestinali. Un tempo letale, attualmente presenta buone probabilità di sopravvivenza; i malati devono però seguire un particolare trattamento per tutta la vita, che comprende, fra l'altro, una particolare dieta, ricca di proteine e a basso contenuto di lipidi, e utilizzare preparati con estratti del pancreas.

Il pancreas è il responsabile, anche se indirettamente, dell'insorgenza del diabete mellito. Tale patologia, infatti, è causata dall'insufficiente produzione di insulina da parte delle cellule endocrine della ghiandola. Questa forma di diabete viene oggi trattata con la somministrazione per iniezione sottocutanea di insulina; altri approcci terapeutici comprendono il trapianto di pancreas o di isole di Langerhans. Tuttavia, i pazienti che finora si sono sottoposti a questo tipo di intervento, molto complesso dal punto di vista tecnico, non sono sopravvissuti a lungo.

Questa immagine ottenuta al microscopio ottico rappresenta una sezione di pancreas umano. Al centro si distingue una delle isole di Langerhans, piccoli agglomerati di cellule specializzate che secernono insulina. Quest'ultima, prelevata dai vasi sanguigni che nella foto appaiono in blu e bianco, viene veicolata in tutto il corpo per regolare la metabolizzazione di zuccheri e grassi. Il diabete mellito è la patologia legata alla carenza di insulina.

Malattia causata da un difetto del metabolismo dei carboidrati e caratterizzata da valori della quantità di zucchero nel sangue (vedi Glicemia) e nelle urine (vedi Glicosuria) eccessivi. Il diabete mellito colpisce all'incirca l'1-2% della popolazione. Può provocare danni a occhi, reni, cuore e arti, e costituire un fattore di rischio nel caso di una eventuale gravidanza.

Il diabete (dal greco: passare attraverso) mellito probabilmente è la malattia umana più comune oggigiorno, e la sua incidenza aumenta in maniera impressionante. Ogni giorno circa duemila nuovi casi di diabete sono diagnosticati solamente negli USA; moltiplicando questo numero per dieci si ottiene la figura approssimativa della crescita giornaliera mondiale del diabete. Cosicché, ogni anno molti milioni di nuovi casi di diabete vanno ad aumentare il numero attuale di circa 135 milioni di persone affette dal diabete sulla terra.

Il diabete è rimasta una malattia relativamente rara sinché lo zucchero non è diventato un genere alimentare a basso costo (circa nella seconda metà del presente secolo).

Da almeno quattromila anni, però, la condizione patologica del diabete è conosciuta in campo medico, e la prima evidenza storica è riportata nel papiro egizio di Ebers, scritto intorno al 1550 Avanti Cristo. Successivamente, testi indiani risalenti al 800-600 Avanti Cristo riportano casi di diabete, mentre la malattia era ben conosciuta nelll'antichità classica greca e romana. La conoscenza del diabete nell'antichità classica fu sintetizzata nei lavori del medico ellenistico Areteo di Cappadocia (120-200 Dopo Cristo), che scrisse un trattatello "Sul diabete". Questo lavoro rimase un classico testo per l'insegnamento e la pratica medica del diabete sino al milleottocento. Infatti, l'illustre medico italiano Giovan Battista Morgagni (1682-1771) scrisse nel 1761 vari capitoli dedicati alla descrizione, diagnosi, terapia e persino le cause (patogenesi) della malattia diabetica nelle sue varie manifestazioni.

Il diabete mellito viene di solito classificato in due tipi. Il tipo I, o diabete mellito insulino-dipendente (IDDM) (insulin-dependent diabetes mellitus), detto anche diabete giovanile poiché colpisce i bambini e i giovani, costituisce il 10-15% dei casi di diabete mellito ed è classificato tra le malattie autoimmuni. Si manifesta precocemente e progredisce rapidamente. Il diabete mellito di tipo II, o non insulino-dipendente (NIDDM) (non-insulin-dependent diabetes mellitus), detto anche diabete mellito dell'adulto poiché in genere colpisce gli adulti oltre i 40 anni, ha invece uno sviluppo più lento. Spesso non è accompagnato da alcun sintomo clinico e viene diagnosticato attraverso l'individuazione di livelli elevati di glucosio nel sangue e nelle urine.

È d'uopo ricordare che tale classificazione basata sulla terapia dell'insulina è scientificamente molto vaga, poiché molti pazienti col NIDDM in realtà richiedono iniezioni di insulina per stabilizzare la loro salute, mentre vari casi di IDDM "latente" (ora chiamati LADA: Latent Autoimmune Diabetes in the Adults) vengono diagnosticati inizialmente come NIDDM.
Negli ultimi trenta anni si è riconosciuto che molti casi di IDDM sono di natura autoimmunitaria. Tuttavia, fu solo nel 1988 che un gruppo di ricercatori medici italiani guidati da Michele Solimena identificò la proteina principalmente responsabile della reazione autoimmunitaria che distrugge le cellule delle isole del Langerhans che producono insulina. Questa proteina si chiama glutamic acid decarboxylase (GAD) ed è pure implicata nella stiff-man syndrome, un' altra malattia immunitaria, ma molto più rara del diabete. Successivamente, la stessa insulina è stata identificata come un fattore fondamentale nella patologia immunitaria dell' IDDM, sottolineando ancora una volta come la storia del diabete sia indissolubilmente interconnessa alla ricerca sull'insulina.

Nei diabetici l'ingresso del glucosio viene impedito a causa di un deficit di insulina o dell'alterazione dei recettori di quest'ormone presenti nelle cellule. Di conseguenza, lo zucchero si accumula nel sangue e viene escreto nelle urine. Nel diabete di tipo I, il problema consiste di solito in una grave o totale riduzione della produzione di insulina; nel diabete di tipo II, il pancreas produce una considerevole quantità di insulina, ma ciò non è sufficiente per le necessità dell'organismo, soprattutto perché i tessuti sono spesso resistenti agli effetti dell'ormone. In alcuni soggetti che presentano quest'ultimo tipo di diabete, tale resistenza è dovuta a prolungata obesità. Un alto livello di glicemia rende inattivi i recettori bersaglio dell'insulina, presenti nelle cellule dell'organismo.

Il diabete di tipo I è accompagnato da sete intensa, calo ponderale e affaticamento. Poiché l'organismo non ricava sufficiente energia dal glucosio nei tessuti, inizia a utilizzare il grasso di riserva. Ciò causa un aumento, nel sangue, di composti detti corpi chetonici (Acetone) che rendono il sangue acido e interferiscono con la respirazione. Se non trattato, questo tipo di diabete risulta letale; la morte da coma diabetico rappresenta l'inevitabile conclusione della malattia, se non viene seguita la terapia insulinica (vedi più avanti).

In entrambe le forme di diabete, il protrarsi per molti anni di una condizione in cui i livelli di glicemia si mantengono moderatamente alti può alla fine causare malattie ai reni, compromissione della vista (per la rottura dei vasi sanguigni della retina), l'opacizzazione del cristallino (cataratta diabetica); inoltre, la riduzione del flusso ematico agli arti, con disturbi come l'intorpidimento degli stessi e la perdita della funzionalità, che in casi gravi può richiederne l'amputazione; ancora, alterazioni della sensibilità (polineuropatia diabetica).

Altre patologie connesse con il diabete sono un aumento del rischio di attacco cardiaco e ictus. Nel caso di una gravidanza, il diabete è associato a mortalità elevata del feto e ad anomalie congenite. L'aspettativa di vita dei diabetici trattati in modo inadeguato è ridotta di circa un terzo.

L'individuazione del diabete di tipo II in assenza di sintomi inizia dalla misurazione del livello di glucosio nelle urine. Se viene individuato un livello alto, viene effettuata la misurazione del livello di glicemia dopo una notte di digiuno. Un valore alto indica la presenza della patologia, mentre i soggetti che presentano un livello normale possono sottoporsi a un test orale di tolleranza al glucosio, in cui viene misurata la quantità di glucosio nel sangue dopo l'ingestione di una grande quantità di zucchero.

Per il diabete di tipo I o di tipo II con produzione di insulina scarsa o assente, la terapia comporta iniezioni di insulina (terapia insulinica) e cambiamenti nella dieta. Grazie all'apporto di ormone dall'esterno, gran parte dei malati mantiene i livelli di glicemia entro limiti normali o quasi normali; ciò permette lo svolgimento di una vita normale e la prevenzione di alcune conseguenze a lungo termine della malattia. La dieta prevede la distribuzione di pasti e spuntini in tutto l'arco della giornata, in modo che l'apporto di insulina non venga superato dalla quantità di glucosio, nonché l'assunzione di cibi che contengono polisaccaridi invece che zuccheri semplici (i polisaccaridi, infatti, devono essere scomposti nello stomaco prima di essere assorbiti, e pertanto provocano un aumento della glicemia molto più lento). Vedi Metabolismo degli zuccheri.

Per i diabetici di tipo II, la maggior parte dei quali è almeno moderatamente sovrappeso, i punti fondamentali della terapia sono il controllo della dieta, la riduzione del peso e l'esercizio fisico. La diminuzione di peso sembra ridurre almeno in parte la resistenza all'insulina nei tessuti. Il medico può prescrivere iniezioni di insulina nei casi in cui la glicemia continui a restare alta; nei casi meno gravi, per abbassarla è invece possibile somministrare un farmaco orale (sulfanilurea).

Attualmente, una modalità terapeutica è rappresentata dalle pompe di insulina, piccoli dispositivi che vengono applicati al corpo dei pazienti e che rilasciano insulina in momenti e in quantità prestabiliti. Tali pompe migliorano il controllo dei livelli glicemici, nonostante talvolta provochino complicanze come la chetoacidosi e l'infezione del punto in cui avviene l'inoculazione dell'ormone.

Condizione in cui la concentrazione nel sangue del glucosio (glicemia) risulta inferiore al valore normale di 80 mg per decilitro. Può causare debolezza, tremore, nervosismo, ansia, malessere, svenimento e, nei casi più gravi, anche coma (coma glicemico).

La sindrome ipoglicemica, o iperinsulinismo, è una grave forma patologica indotta da una concentrazione eccessiva dell'ormone insulina nel sangue e si verifica negli individui affetti da diabete mellito. Le persone affette da questa patologia non sono in grado di sintetizzare autonomamente insulina nella quantità necessaria, e sono costretti ad assumerla mediante iniezioni in dosaggi molto precisi, immediatamente prima dei pasti; l'iperinsulinismo e la conseguente ipoglicemia possono in questi casi essere causati da un sovradosaggio di insulina, cioè dall'inoculazione di un quantitativo dell'ormone che non viene compensato da una sufficiente ingestione di carboidrati.

Altre condizioni patologiche provocano la condizione di iperinsulinismo per sovrapproduzione di insulina endogena da parte dell'organismo, cui consegue sempre l'ipoglicemia.

Il tipo più comune di ipoglicemia è, tuttavia, quella reattiva o funzionale. Anch'essa è dovuta a una iperproduzione di insulina, che può verificarsi, in genere, da tre a cinque ore dopo i pasti, ma presenta sintomi più lievi di quelli prodotti dalla sindrome ipoglicemica dei diabetici; è possibile tenerla entro limiti accettabili aumentando l'apporto di carboidrati.

Se il corpo produce troppo ormone ipofisario o troppa poca insulina, la concentrazione di zucchero nel sangue si innalza in modo eccessivo, anche fino a quattro volte al di sopra della norma, portando a una condizione, nota come iperglicemia. L'iperglicemia di per sé non è letale, ma è sintomo di una grave malattia, il diabete mellito, causato da fattori diversi, tra cui l'interferenza con la funzionalità delle isole di Langerhans, le cellule del pancreas responsabili della produzione di insulina.

I malati di diabete non muoiono di iperglicemia, ma se non ricevono iniezioni di insulina esogena possono morire per l'accumulo nell'organismo di sostanze tossiche prodotte dall'alterato metabolismo dei grassi, in quanto, non essendo in grado di utilizzare gli zuccheri, consumano i grassi al loro posto.

La quantità di insulina esogena iniettata dev'essere, tuttavia, controllata in modo estremamente preciso e rigoroso, poiché un eccesso di questo ormone può determinare una riduzione della concentrazione di glucosio nel sangue a un livello pericolosamente basso (ipoglicemia), seguita da shock da insulina.

In un individuo sano la quantità di zucchero in eccesso nel sangue è rimossa dai reni ed escreta nell'urina. La presenza di zucchero nell'urina è detta glicosuria e, sebbene sia un grave sintomo di diabete, non si trova sempre nei pazienti diabetici, mentre può comparire anche in individui sani subito dopo un pasto abbondante. Il test diagnostico più importante per i pazienti diabetici non è, pertanto, l'individuazione di iperglicemia, né di glicosuria, ma la tolleranza al glucosio: dopo aver ingerito dello zucchero vi è sempre un aumento della concentrazione di glucosio nel sangue; questa, tuttavia, nei pazienti diabetici rimane alta, mentre nei soggetti sani si abbassa, poiché in presenza di insulina l'eccesso di glucosio viene assorbito dalle cellule e convertito rapidamente in glicogeno.

Insieme di reazioni chimiche mediante le quali l'organismo ottiene energia dagli zuccheri. Gli zuccheri sono carboidrati e, insieme a lipidi e proteine, rappresentano uno dei tre costituenti fondamentali degli alimenti alla base della dieta media di ciascun individuo. Il prodotto finale della digestione e dell'assimilazione di qualunque carboidrato è uno zucchero semplice, il glucosio. Anche il metabolismo dei grassi e di alcune proteine porta talvolta alla produzione di glucosio, che è il principale combustibile di muscoli e cervello. Il glucosio si trova in tutte le cellule e in quasi tutti i fluidi corporei e la sua concentrazione e distribuzione sono fra i più importanti parametri controllati dalla fisiologia umana. Oltre al glucosio, altri zuccheri relativamente importanti sono il fruttosio e il lattosio.

Carboidrati come l'amido, la destrina, il glicogeno, il saccarosio, il maltosio e il lattosio vengono decomposti nel canale alimentare in zuccheri semplici a sei atomi di carbonio, che passano facilmente attraverso la parete intestinale. Il fruttosio e il glucosio, già a sei atomi di carbonio, non vengono, invece, demoliti, ma assorbiti come tali. La cellulosa si trova comunemente in molti alimenti e per alcuni animali, soprattutto per i bovini e le termiti, è un importante principio nutritivo; per la specie umana la cellulosa non ha alcun valore nutritivo, anche se le sue fibre svolgono un importante ruolo digestivo, poiché fanno massa e favoriscono la peristalsi.

La digestione dei carboidrati avviene a opera di numerosi enzimi diversi. L'amilasi si trova nella saliva e nell'intestino e demolisce l'amido, la destrina e il glicogeno in maltosio, uno zucchero a 12 atomi di carbonio. Altri enzimi presenti nell'intestino tenue degradano gli zuccheri a 12 atomi di carbonio in molecole a 6 atomi di carbonio. La maltasi scinde il maltosio in glucosio; l'invertasi, il saccarosio in glucosio e fruttosio; la lattasi, il lattosio in glucosio e galattosio.

Gli zuccheri a 6 atomi di carbonio, che sono i prodotti finali della digestione dei carboidrati, attraversano la parete dell'intestino tenue e passano nei capillari sanguigni, da cui raggiungono la vena porta e quindi il fegato. Qui possono essere convertiti in glicogeno, immagazzinato come riserva energetica e all'occorrenza riconvertito in glucosio e liberato nella circolazione sanguigna. Nei muscoli uno dei prodotti finali del metabolismo del glucosio è l'acido lattico, che viene trasportato dal sangue al fegato e quindi parzialmente riconvertito in glicogeno.

Enzimi e ormoni

La conversione da glucosio a glicogeno e viceversa è catalizzata da numerosi enzimi differenti. La fosforilasi è responsabile della reazione di rilascio del glucosio-1-fosfato dal glicogeno, regolata dall'azione degli ormoni adrenalina e glucagone. Il glucosio-1-fosfato viene quindi convertito da un enzima detto esochinasi in glucosio-6-fosfato, che, a seconda dello stato energetico dell'organismo, può essere convertito in glucosio e immesso nella circolazione sanguigna oppure metabolizzato. Nel primo caso, l'assunzione del glucosio da parte del sangue all'interno delle cellule è stimolata dall'insulina. Nel secondo caso, invece, il glucosio-6-fosfato può essere metabolizzato nel fegato e nei muscoli o convertito in uridindifosfoglucosio. Da quest'ultimo composto il glucosio è incorporato nel glicogeno, con una reazione catalizzata dall'enzima glicogeno sintetasi e stimolata dall'insulina. Altri composti coinvolti nella regolazione del metabolismo degli zuccheri sono gli ormoni corticoidi e ipofisari e la tiroxina.

· Il Futuro e la Ricerca nel Diabete

Il futuro del diabete è assai allarmante. Considerando i trends attuali di aumento di incidenza associati ai cambiamenti di tenore di vita, ed il continuo miglioramento economico di grandi nazioni asiatiche come la Cina, si prospetta oggi che per l'anno 2010 ci saranno ben 240 milioni di casi di diabete sulla terra. E’ interessante sottolineare come in USA finanziamenti alla ricerca sul diabete sono circa dieci volte inferiori a quelli sull'AIDS, anche se quest'ultimo morbo incide su meno di un decimo delle persone affette da diabete. Un aspetto fondamentale che potrà cambiare le prospettive poco allegre del diabete in futuro è la crescita generale dell'attenzione ed interesse pubblico, che richiede molta informazione e maggiore educazione. Ogni bambino a scuola, ed i suoi genitori, dovrebbero sapere esattamente i rischi alla salute, specialmente per il diabete, che derivano dalla dieta ricca in zuccheri e proteine, dal sovrappeso, ed dalla mancanza di esercizio fisico.

Il futuro dell'attuale ricerca diabetologica è proiettato soprattutto verso il diabete tipo I. Le speranze di prevenzione primaria del diabete risiedono negli studi immunologici che tendono a identificare con precisione i meccanismi causali che conducono alla malattia e ad individuare le modalità con le quali arrestarne il decorso. Le speranze di una cura risolutiva del diabete già instaurato consistono nella possibilità verosimilmente, ancora lontana nel tempo - di ripristinare integralmente la funzione pancreatica, che è stata gravemente compromessa dalla malattia.
In questo senso si profilano le tre principali linee di ricerca, oggi in atto:

I pazienti che ricevono questo tipo di trapianto diventano completamente insulino indipendenti fin dal primo giorno post-operatorio e mantengono questo stato per molti anni. Un altro dei vantaggi di questa tecnica chirurgica è il controllo delle complicanze degenerative del diabete. Mentre la retinopatia tende a stabilizzarsi e non a migliorare, la neuropatia, la nefropatia e la macroangiopatia mostrano un evidente tendenza al miglioramento nei pazienti sottoposti a trapianto li rene e pancreas, miglioramento che non si osserva in quei pazienti diabetici insulino dipendenti sottoposti a solo trapianto renale ed ancora in terapia insulinica.

Un discorso a parte merita il trapianto di pancreas isolato. Questa tecnica pur presentando molte potenzialità per i pazienti diabetici insulino indipendenti che non riescano ad ottenere un buon controllo metabolico con le terapie tradizionali, mostra ancora alcuni limiti. I due limiti principali sono il rischio chirurgico (40% dei pazienti sottoposti al trapianto di pancreas presentano delle complicanze chirurgiche nel post operatorio) ed il rischio legato alla terapia immunosoppressiva. È in particolare questo ultimo aspetto che va valutato con molta attenzione dal medico che propone il trapianto pancreatico isolato al paziente diabetico e che va ben conosciuto da parte del paziente diabetico che si sottopone a questa procedura, affinché siano valutati con correttezza i vantaggi ed i rischi di questa tecnica. I rischi legati alla terapia immunosoppressiva consistono in un'aumentata probabilità di contrarre infezioni nei primi mesi post operatori e, più importante, nel rischio di sviluppare tumori a distanza di anni dal trapianto. Studi recentemente pubblicati hanno mostrato come pazienti sottoposti a terapia imnunosoppressiva abbiano un rischio del 10-12% di sviluppare tumori entro dieci anni dall'insorgenza della malattia (la popolazione generale presenta un rischio del 6%,). È evidente che in un paziente diabetico gravemente sconpensato, nel quale ogni sforzo terapeutico sia risultato vano allo scopo di ottenere valori di emoglobina glicata accettabili, questo tipo di procedura possa essere considerata proponibile e accettabile nel rapporto rischio/beneficio, visti i danni in cui il paziente va incontro nel lungo periodo se la glicemia non risulta ben compensata.

Questo tipo di approccio chirurgico, operativo negli Stati Uniti già da molti anni, è stato recentemente introdotto anche nel nostro paese, con risultati non sempre incoraggianti.

Tra i diabetici è abbastanza diffuso l'uso dei misuratori automatici della glicemia. Confrontando i valori ottenuti in casa con quelli prodotti dalle macchine usate in laboratorio si scopre che, malgrado la differenza non dovrebbe superare il 15 per cento, secondo le raccomandazioni dell'Associazione Americana per il Diabete, che detta legge in questo campo, tutte le macchinette esaminate hanno fornito scarti maggiori.

Lo Studio
I pazienti erano tutti in ipoglicemia, ovvero in carenza di zuccheri, non avendo mangiato da 14 ore. Una situazione che i diabetici affrontano frequentemente perché, non avendo, un buon controllo del loro metabolismo, se si iniettano troppa insulina o si muovono più di quanto non facciano abitualmente, consumano improvvisamente la quota di zuccheri che hanno in circolo.
I glucometri domiciliari non sono accurati come i dati di, ma questi non sono diagnostici, perché il diabetico già sa di esserlo. Devono solo fornire indicazioni dl massima su come comportarsi. In questo senso non cambia molto sapere se si ha una glicemia di 40 piuttosto che di 30 milligrammi per decilitro, dal momento che si tratta comunque di valori molto bassi e che il comportamento da attuare per porvi rimedio, ovvero assumere zuccheri a rapido assorbimento, è lo stesso".
Le variazioni sono dovute anche al fatto che il laboratorio misura il glucosio nel sangue venoso, mentre il glucometro testa il sangue capillare. Inoltre, mentre il primo analizza la concentrazione nel plasma, il secondo lo fa sul sangue intero: differenze tecniche che giustificherebbero i diversi risultati.

I valori dei modelli
Sono stati messi a confronto sei modelli di misuratori domiciliari di glicemia, di cui quattro in vendita anche in Italia e che coprono la maggior parte del mercato.

Due sono i sistemi di misurazione della concentrazione di glucosio nel sangue. Il primo, più diffuso, si basa sulla capacità dei colori di assorbire la luce. In pratica il diabetico si punge il dito con un apposito apparecchio, il pungidito, e deposita una goccia di sangue su una striscia imbevuta di un reagente enzimatico. La striscia cambia colore a seconda della concentrazione di zucchero nel sangue e viene posta nella macchinetta, dove un raggio di luce la attraversa. Poiché i diversi colori assorbono la luce in quantità variabile, un dispositivo speciale è in grado di misurare la quantità di luce assorbita dalla striscia e trasformarla in un valore preciso di glicemia. Per ottenere un risultato è necessario un tempo di attesa variabile da uno a due minuti. Il secondo metodo richiede anch'esso l'uso di una striscia reattiva su cui deporre una goccia di sangue, ma la concentrazione di zucchero viene misurata con un metodo elettrochimico, ovvero analizzando la variazione di cariche elettriche nel sangue. I tempi di attesa per la risposta sono minori, ma a scapito dell'accuratezza.
Ecco ora alcune caratteristiche dei quattro glucometri analizzati in vendita nel nostro Paese. Ricordiamo che il costo della macchinetta è a carico del diabetico, mentre le strisce reattive e le lancette o gli aghi usa e getta per i pungidito sono forniti gratuitamehte dall'SSN.

Nella tabella 1 sono riassunte le caratteristiche tecniche e i prezzi dei glucometri segnalati da Diabetes Care. Alcune case produttrici forniscono anche un numero verde a disposizione del paziente o del medico per informazioni e aiuto.
Tra le caratteristiche da segnalare, vi è anche la possibilità di memorizzare, nei modelli Reflolux e One Touch, i valori delle ultime glicemie effettuate.
Quest'ultimo apparecchio è in grado di tenere in memoria fino a 250 glicemie, oltre a piccole annotazioni, come attività fisiche anormali o deroghe alla dieta.

nome casa produttrice	prezzo (lire)	accuratezza	metodo	tipo di errore	n° tel
Reflolux Boehringer Mannheim	100.000 solo glucometro	***	colorimetrico	sottostima	167822189
Accutrend Alpha Boehringer Mannheim	90.000 con pungidito	***	colorimetrico	sottostima	167822189
Glucometer Elite Bayer Diagnostica	120.000 con custodia e batterie	*	elettrochimico	sovrastima	02/39211486
One Touch I LifeScan	80.000 solo glucometro 150.000 con consolle e pungidito	***	colorimetrico	sovrastima	167822000
Hemocue Angelholm	non in commercio in Italia	***	colorimetrico	sovrastima	-
Companion II Medisense	non in commercio in Italia	*	elettrochimico	sovrastima	-

I GIUDIZI
La tabella riporta anche i giudizi di accuratezza secondo la rivista americana. Tre stelle corrispondono a una variabilità rispetto al laboratorio tra il 15 e il 20 per cento, e quindi a una buona prestazione. Due modelli ottengono una sola stella, pari a una variabilità superiore al 30 per cento

Il dispositivo dalle dimensioni appunto di una penna misura il glucosio in modo estrememente semplice: basta pungersi la punta di un dito e mettere la goccia di sangue sulla superficie di una striscetta metallica che è stata preventivamente fissata ad una estremità della penna. Si schiaccia un pulsante dopo aver atteso 30 secondi appare il valore della concentrazione del glucosio in mg/dl. Il principio di questa analisi sviluppato in Gran Bretagna ad Oxford e Cranfield (Green e Hill 1982) è basato sulla seguente reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi:

Glucosio + Ione Ferricinio >> Acido gluconico + Ferrocene

il ferrocene, essendo un mediatore elettroattivo, viene ossidato a ione ferricinio sotto la superficie di un elettrodo opportunamente scelto nel modo seguente:

2 Ferrocene >> 2 Ione ferricinio + 2 e

La corrente prodotta da questa ossidazione anodica è proporzionale alla concentrazione di glucosio nel sangue. Tutte queste reazioni sono state "condensate" grazie alla tecnologia dei biosensori, sopra una striscetta metallica e tutta la strumentazione racchiusa dentro il volume di una penna.

Attualmente oltre al ferrocene sono allo studio molti altri mediatori per aumentare il numero di analisi cliniche con queste tecniche utilizzando altri enzimi.

Un settore molto promettente è lo sviluppo dei sensori a fibre ottiche che consistono nella immobilizzazione di uno strato biocatalitico sulla punta di una fibra ottica. In presenza del bioanalita si genera un segnale luminoso che viene misurato e messo in relazione con la concentrazione del bioanalita. Sono già stati realizzati sensori a glucosio, urea, ed a NADH e con quest'ultimo è stato possibile determinare l'etanolo ed il lattato (Arnold 1987). Il vantaggio di usare fibre ottiche consiste nel fatto che essendo il segnale analitico di tipo luminoso il rivelatore non deve essere necessariamente in contatto con l'analita. Questo è indubbia mente un grosso vantaggio specie nelle misure di campioni biologici; inoltre le fibre ottiche sono estremamente maneggevoli e facili da usare, sono molto adatte ad essere miniaturizzate quindi idonee per analisi in vivo.

Il maggior interesse che suscita la ricerca e la applicazione medica dei biosensori è la miniaturizzazione di essi per analisi di monitoraggio in vivo. Ricercatori giapponesi , francesi ed inglesi stanno lavorando alla realizzazione di sensori "ad ago"; sono già stati realizzati sistemi per la misura del glucosio utilizzando sensori ad ago ed un sistema telemetrico di rivelazione funzionante sino a 20 metri (Shichiri e al. 1988). Sebbene i risultati siano molto promettenti, non sono stati risolti ancora quelli della biocompatibilità del sensore impiantato, della stabilità e durata nel tempo e dell'aumento della linearità di risposta per alcuni metaboliti come il glucosio.

I biosensori possono andare oltre i correnti limiti di velocità e sensibilità di analisi, inoltre si prestano molto bene alla realizzazione di metodi che hanno un basso costo per analisi. Una delle migliori opportunità per l'uso dei biosensori è la capacità che essi offrono per analisi "in loco" specie nei laboratori medici, o nelle analisi d'urgenza. Questo eliminerebbe l'invio dei campioni negli ospedali o nei laboratori di analisi.

I biosensori troveranno una larga applicazione nello sviluppo degli organi e delle protesi artificiali. Sia il diabete che le malattie renali sono purtroppo ai primi posti delle classifiche nei paesi industrializzati. L'aver sviluppato sensori per glucosio, urea, e creatinina significa aver fatto un decisivo passo avanti verso la realizzazione di un pancreas o di un rene artificiale. I ricercatori sperano di poter sviluppare un sistema che misuri glucosio od insulina nel sangue e ne corregga il bilancio automaticamente allo stesso modo del pancreas; prima di realizzare questo si dovranno risolvere problemi di biocompatibilità e di stabilità del sistema impiantato in quanto è impensabile reimpiantarli ogni 1 o 2 settimane.

· Test della glicemia senza sangue

Dispositivi non invasivi per il monitoraggio della glicemia dei diabetici

Bucarsi le dita per controllare i livelli della glicemia è un rituale troppo comune per i diabetici, il cui organismo non è in grado di produrre abbastanza insulina per metabolizzare lo zucchero. Purtroppo, visto il disagio della puntura sul dito, molti diabetici non si controllano regolarmente come dovrebbero, mettendo a rischio la salute dei loro occhi e dei reni. Tuttavia, si stanno studiando molti nuovi strumenti che non richiedono l'uso del sangue. Siccome però i nuovi dispositivi sono molto costosi e data la riluttanza delle società di assicurazioni a coprire le spese per il controllo della glicemia, possono essere usati solo da pochissime persone.

Il primo sensore di glicemia al mondo non invasivo, il Diasensor 1000, recentemente ha ricevuto l'approvazione per la commercializzazione dall'Unione Europea. Utilizza una sonda in fibra ottica ad emissione di luce infrarossa, che attraversa la pelle fino al sangue. La luce viene riflessa nuovamente verso il sensore ed analizzata dal calcolatore del Diasensor. L'ideatore della macchina, la Biocontrol Technology di Pittsburgh, sta lavorando con la Food and Drug Administration dal 1994 per ottenere che il Diasensor venga approvato per il consumo interno, ma nel 1996 una Commissione di Revisione della FDA ha ritardato l'approvazione chiedendo maggiori informazioni, che Biocontrol ha già presentato.

Altri sensori non invasivi del glucosio sono in varie fasi di sviluppo. La Cygnus di Redwood, California, per esempio, sta finendo le prove cliniche per il suo GlucoWatch, che può essere portato come un orologio da polso. Il dispositivo usa la corrente elettrica a basso voltaggio per estrarre il glucosio in maniera indolore e farlo assorbire da un'apposita striscia reattiva.

Un approccio differente viene invece usato da SalivaSac, della Pacific Biometrics, di Lake Forest, California. È stato realizzato per migliorare l'uso diagnostico della saliva "ultrafiltrandola" - cioè estraendone gli enzimi, gli alimenti ed altri agenti inquinanti. La Pacific Biometrics è attualmente in una fase iniziale di verifica del suo dispositivo e non pensa di poterlo introdurre sul mercato per almeno due anni.

Andando più avanti nel futuro, la George S. Wilson della Università del Kansas sta sviluppando un impianto per il monitoraggio continuo delle glicemie e l'emissione di un allarme quando si rendesse necessaria l'insulina. Il sensore, circa tre volte lo spessore di un capello, può essere impiantato facilmente sotto la pelle con un ago. La National Applied Science in Portland, Oregon, detiene i diritti di commercializzazione del sistema, che è a circa cinque anni dall'approvazione della FDA.

· Pompe per infusione sottocutanea continua di insulina (CSII)

Questa metodica permette di mimare nella maniera migliore la normale secrezione d’insulina e ha il grande vantaggio di utilizzare insulina pronta. Utilizzando solo questo tipo d’insulina, grazie anche alla formazione di piccoli depositi sottocutanei d’insulina, si ottiene un assorbimento più rapido e meno variabile rispetto all’insulina intermedia.

La pompa per insulina, detta anche microinfusore, è un piccolo dispositivo elettro-meccanico di precisione che libera insulina nell'organismo tramite un sottile tubicino di plastica (infusore o infusion set). La pompa può essere sistemata in un marsupio o in una cintura. L'infusore è un lungo, sottile tubo di plastica che connette la pompa a un piccolo, flessibile ago o cannula inserito attraverso la pelle nel punto di infusione (infusion site), solitamente nella zona addominale. L'infusore rimane inserito per circa tre giorni, dopodiché deve essere spostato in una nuova posizione. Tutta l'insulina viene liberata tramite infusore.

Quasi tutte le pompe odierne hanno diverse velocità basali programmabili in base agli eventuali cambiamenti di sensibilità all’insulina, come durante l’attività fisica o durante la notte quando l’infusione può essere ridotta per evitare ipoglicemie notturne, o essere aumentata per contrastare il "fenomeno-alba" che determina iperglicemia al risveglio. Con questo tipo di somministrazione il plateau dell’insulina plasmatica, a partire dall’inizio dell’infusione viene raggiunto in ritardo e cioè solo dopo che nel sito d’infusione si è formato un accumulo di insulina la cui grandezza è inversamente proporzionale al flusso di sangue nei tessuti. Peraltro ciò permette un certo margine di sicurezza nel caso di chiusura voluta o causale del CSII.

Le variazioni d’insulina assorbita da un giorno all’altro, sono molto più basse (3%) rispetto a quelle dovute ad iniezioni d’insulina intermedia con siringa in cui possono raggiungere il 50% della dose giornaliera iniettata. Il microinfusore risulta più frequentemente usato dal sesso femminile, in quanto l’ottimizzazione del controllo glicemico durante la gravidanza rappresenta una motivazione importante per la scelta di questa terapia.

Il microinfusore non è un pancreas artificiale, cioè un apparecchio in grado di autodefinire il dosaggio di insulina in base alle rilevazioni glicemiche. È un apparecchio di precisione, controllato da un piccolo computer programmabile, che libera insulina regolare (rapida), prelevandola da un apposito serbatoio, in quantità estremamente precisa, secondo l'ammontare precedentemente programmato. È possibile programmare la pompa a rilasciare insulina in qualsiasi momento lo si desideri. Tuttavia, si deve controllare la propria glicemia più volte al giorno. Utilizzare un microinfusore può richiedere molto più impegno ed attenzione da parte del paziente rispetto ai sistemi tradizionali di iniezione.

Il microinfusore contiene un piccolo serbatoio di insulina regolare, una piccola pompa a batteria, ed un computer che controlla l'intero sistema. Le dimensioni sono ridotte (meno di un portafoglio). Alcuni sono impermeabili, altri devono essere inseriti in appositi contenitori plastici.

1. Il modo basale (basal) e il modo pre-pasto (bolus). Nel modo basale viene liberata una quantità minima di insulina in maniera uniforme per tutta la giornata che mantiene sotto controllo la glicemia nei periodi tra un pasto e l'altro e durante la notte. È possibile programmare differenti dosaggi basali durante la giornata, per esempio liberando meno insulina di notte piuttosto che durante il giorno.

2. Il modo pre-pasto copre invece i fabbisogno insulinico durante i pasti. Può essere riprogrammato in qualsiasi momento, permettendo una grande flessibilità nell'orario dei pasti. Se per esempio decidete di pranzare in ritardo, potete spostare l'orario programmato più tardi.

1. Flessibilità. La prima ragione per prendere in considerazione l'uso del microinfusore è la flessibilità. Dal momento che il microinfusore utilizza solo insulina regolare, ci si libera dalla necessità di mangiare ad orari precisi per coprire l'effetto delle insulina a lunga azione, come le intermedie, che si è somministrata ore prima.

2. Precisione. La pompa libera insulina con una precisione che non può essere raggiunta con la siringa, e ancor meno con la penna. Possono infatti essere programmate a passi di un decimo di unità.

3. Miglioramento dei controlli metabolici. Chi usa i microinfusori afferma di aver migliorato i propri controlli rispetto ai precedenti regimi, anche a iniezione multipla. Dicono anche di dover sottostare ad un inferiore numero di ipoglicemie dovute sia alla maggiore predittività delle insuline regolari rispetto alle lente, sia al controllo più preciso dell'insulina iniettata.

4. Convenienza. Col microinfusore basterà un'iniezione ogni tre giorni (la puntura dell'infusore) unita al fatto si avere sempre l'insulina con sé.

1. Flessibilità. Al posto del microinfusore si può ottenere la stessa flessibilità con un regime tre iniezioni di insulina regolare ed una ad effetto prolungato.

2. Sicurezza. La pompa potrebbe per qualsiasi ragione andare in blocco (batterie scariche, guasto, ecc.). Non essendovi un'insulina basale già nell'organismo, se non vi accorgete del guasto, si rischia di incorrere in iperglicemie.

3. Sport, bagni e momenti intimi. Tali situazioni richiedono particolare attenzione. Seppure la maggior parte degli apparecchi siano provvisti di un sistema di sgancio molto semplice e veloce senza dover rimuovere l'infusore, è comunque bene pensare prima anche a queste situazioni.

4. Ingombro. Pur essendo minimo, l'ingombro dell'apparecchio è pur sempre un fatto ineludibile. Particolari professioni, sport o stili di vita potrebbero indurre a scartare il microinfusore (agricoltori, atleti, ecc.).

Vennero adattate in principio da pompe utilizzate per la somministrazione di eparina e per la chemioterapia. Queste pompe avevano l’inconveniente di una velocità d’infusione costante ma il pregio della semplicità e della ricarica automatica della pressione, mediante compressione del gas freon contenuto in una camera della pompa tutte le volte che veniva riempito il serbatoio dell’insulina.

Oggi comunque sono state studiate pompe programmabili a distanza con diverse velocità d’infusione basale e possibilità di boli prima dei pasti. Mentre in principio era utilizzata più spesso la somministrazione intravenosa, oggi si ricorre di più alla somministrazione intraperitoneale. Tra le controindicazioni osservate ricordiamo:
dolore nella sede d’impianto della pompa, infezione, ostruzione dei cateteri.
La pompa è generalmente posizionata sottocute nel quadrante sinistro della parete addominale sotto la linea ombelicale. Dagli studi fatti finora, risulta nei pazienti trattati con pompa sottocutanea che:

1) Il numero di morti non eccede quello di una popolazione diabetica similare.
2) Gli episodi di chetoacidosi sono rari e non superiori a quelli visti con la terapia tradizionale.
3) Gli eventi ipoglicemici gravi non sembrano più frequenti rispetto ai soggetti con terapia insulinica tradizionale e possono essere inferiori rispetto ai soggetti con terapia insulinica intensiva.
4) Le preparazioni più recenti di insulina e le pompe hanno mostrato sicurezza e attività prolungata, quantunque la durata del catetere sia più breve, in media 2.5 anni.

L’impianto di pompe sottocutanee con erogazione d’insulina in peritoneo o in vena è utile nei pazienti che presentano insulino resistenza sottocutanea e in quelli con diabete instabile.

Peraltro l’adozione di tale sistema, oltre agli inconvenienti già descritti, può creare molti problemi legati al costo elevato dell’intervento, alla cicatrice chirurgica, alla sporgenza della pompa nell’addome, ed all’anestesia locale o peridurale indispensabile per l’impianto.

Attualmente le ditte che vendono dispositivi monouso basati su trasduttori di segnale elettrochimico sono riportate nella Tabella 2 :

Un biosensore è definito come un dispositivo analitico contenente un sistema biologico reattivo in intimo contatto con un trasduttore di segnale. I sistemi biologici utilizzati possono essere enzimi, anticorpi, membrane biologiche, batteri, cellule, tessuti animali o vegetali; questi interagiscono direttamente o indirettamente con il metabolita da determinare e sono responsabili della specificità del sensore. In base al tipo di reazione il trasduttore di segnale può essere di tipo elettrochimico, ottico, calorimetro od acustico.

Allo stato attuale i biosensori maggiormente utilizzati sono quelli di tipo elettrochimico per la versatilità, il basso costo della strumentazione e reagenti, sensibilità e rapidità di misura. Tra i vari tipi di biosensori sono stati sviluppati e caratterizzati analiticamente biosensori elettrochimici per la determinazione delle transaminasi, della lattico deidrogenasi, del salicilato, dell'alanina, del glutatione.

Anche se lo sviluppo di un dispositivo di pompaggio di insulina da trapiantare è a buon punto, non esiste ancora un sensore di glucosio trapiantabile efficace, in grado di funzionare in modo continuativo e dotato di stabilità a lungo termine. Le pompe attualmente in fase di sperimentazione clinica rilasciano insulina a seguito di un comando esterno indotto dal medico o dal paziente oppure si basano su un ciclo pre-programmato in funzione della dieta del paziente. La chiusura del circuito mediante un sensore del glucosio determinerà con un meccanismo retroattivo la quantità esatta di insulina necessaria in ogni momento e collegherà questi sistemi di rilascio di insulina all'interno di un pancreas artificiale.

· Ragioni dello sviluppo di sensori di glucosio

È stato dimostrato che riuscire a regolare il livello di glucosio nel sangue affinché rimanga all’interno dell’ intervallo di 110 mg/dL ± 25 mg/dL, può evitare ai diabetici pericolose complicazioni.

Questa è stata la principale spinta allo sviluppo di una serie di dispositivi per la misurazione del glucosio nei fluidi fisiologici sia in vivo che in vitro e alla ricerca di sensori di glucosio impiantabili a corto e lungo termine. Un monitoraggio continuo del glucosio può servire sia nel trattamento intensivo dei diabetici per la prevenzione di complicazioni sia in fase di ricerca. Il monitoraggio può essere sia esterno che interno. Nel primo caso i campioni di liquido fisiologico vengono estratti dal paziente ed analizzati, nel secondo il sensore è in diretto contatto con il fluido in vivo. Il monitoraggio continuo permetterebbe di realizzare un feedback sulla pompa di insulina e mantenere in questo modo nel diabetico la normoglicemia. Nel caso in cui sia la pompa sia il sensore e la sua circuiteria fossero impiantabili si realizzerebbe un vero e proprio pancreas artificiale. I dispositivi “indossabili”, attaccabili cioè al corpo del paziente (braccia,gambe), vengono usati nella ricerca per il monitoraggio del glucosio a breve termine durante i cambiamenti di glicemia, nello sviluppo di dispositivi impiantabili e prevedono sviluppi anche per l’uso domestico.

Caratteristiche richieste ad un sensore di glucosio

Indipendentemente dal tipo di sensore impiegato per la misura della concentrazione di glucosio e dal principio fisico su cui si basa il suo funzionamento, è necessaria la risposta a certi requisiti, consistenti in:

1. Risposta rapida: il cambiamento nella concentrazione di glucosio deve essere riscontrabile entro 1-5 minuti a seconda della specifica applicazione.

2. Accuratezza: la presenza di specie interferenti o di cambiamenti nei parametri fisiologici non devono comportare errori superiori a 10 mg/dL.

3. Sensibilità: il rapporto segnale rumore deve essere elevato per poter apprezzare cambiamenti dell’ordine di 2 mg/dL.

4. Range: Devono essere misurabili concentrazioni comprese tra 20 mg/dL e 600 mg/dL.

5. Stabilità: Le caratteristiche del sensore devono variare il meno possibile durante il suo impiego nella misurazione.

Classificazione di sensori di glucosio in base ai principi di misurazione

I metodi per la misurazione possono essere divisi in due grandi classi in dipendenza dall’ interazione tra dispositivo di analisi e corpo del paziente: invasivi e non-invasivi.

Parlando dei primi, c’è un contatto tra l’elemento sensibile e i fluidi o tessuti biologici, per cui è necessario il prelievo di campioni che possono consistere in piccole quantità di sangue o siero.

Si pongono perciò problemi legati al prelievo dei campioni dal paziente tra i quali il rischio di infezioni, il danneggiamento dei tessuti e il fastidio recato al paziente. I metodi invasivi hanno un’accuratezza ancora non raggiunta da quelli non-invasivi. Quest’ultimi consistono nello sfruttare le proprietà termiche, elettro-magnetiche ottiche e spettrali del glucosio o nel misurare il suo livello in campioni di saliva, sudore, lacrime o urina. Il problema in questo caso è che non c’è una buona correlazione tra il livello di glucosio nel sangue e in questi liquidi. È stato proposto un metodo che consiste nella spettroscopia a NIR (Near Infrared),cioè quella regione dello spettro elettromagnetico compresa tra i 700 nm e i 2500 nm. Senza andare troppo nel dettaglio, i progressi tecnologici e l’affinamento di tecniche d’analisi multivariata, permettono di distinguere specie biochimiche in base al loro spettro NIR e in particolare è stata stabilita una correlazione tra assorbenza e

concentrazione di glucosio in fluidi corporei. Purtroppo, questa tecnica soffre di bassa sensibilità e quindi di bassa accuratezza.

La misurazione del glucosio richiede, nella costruzione di un sensore elettrochimico, l’uso di un enzima, incorporato come parte del sensore stesso. Nel caso del glucosio, l’enzima generalmente impiegato è il GOD (Glucosio Ossidasi). Il processo enzimatico è a due stadi e tipico della classe delle ossidasi. Questo processo consiste nella ossidazione del glucosio da parte dell’enzima e di un cofattore con la formazione di un composto intermedio che viene idrolizzato nel mezzo acquoso dando vita ad acido gluconico.

I biosensori elettrochimici possono essere di tipo amperometrico se basati sulla misura di correnti dovute a reazioni di ossidoriduzione alle interfacce o possono misurare variazioni locali di pH dovute all’acido gluconico prodotto nelle reazioni sopra descritte.Queste variazioni vengono solitamente misurate con sensori potenziometrici quali elettrodi iono-selettivi (ISE) o con ISFET.

Il principale svantaggio di questa ultima tipologia di sensori (ISE e ISFET) è l’interferenza sulla misura di alcuni componenti biologici presenti insieme al glucosio. Altre limitazioni sono date dal fatto che hanno una risposta

logaritmica che comporta una bassa sensibilità .(Le concentrazioni di glucosio nei liquidi fisiologici non variano mai più di un ordine di grandezza) e che i materiali semiconduttori (per gli ISFET) sono soggetti a corrosione a contatto con i liquidi fisiologici, cosa che ne limita le possibilità di applicazione in vivo a lungo termine.

I vantaggi degli ISFET consistono nelle piccole dimensioni, nella risposta rapida e nell’integrazione su singolo chip dei circuiti periferici. Un’ultima cosa da dire è che il processo limitante nella generazione del segnale, non deve essere la reazione enzimatica, che provocherebbe un andamento non lineare in accordo alla cinetica di Michaelis-Menten ,ma piuttosto il processo di diffusione.

Tra gli sviluppi degni di nota cito qui di seguito tre tipi di biosensori di glucosio trapiantabili. I biosensori hanno molti aspetti in comune: ad esempio, tutti utilizzano l'enzima glucosio ossidasi e sono tutti costruiti con materiali biocompatibili platino, argento, Teflon, silicon, polipropilene e vetro. Ma le somiglianze finiscono qui:

1. I ricercatori dell'Universityof Kansas stanno lavorando a un biosensore percutaneo flessibile con le dimensioni e la forma di un ago fine in grado di misurare il glucosio presente nel fluido intercellulare.

Dopo avere impiantato il biosensore sotto la pelle dell'avambraccio, i ricercatori congiungono l'estremità del filo uscente con i fili che portano a un dispositivo esterno di monitoraggio. Il gruppo di ricercatori ha dimostrato che questo sensore funziona per 24 ore in test su volontari non diabetici sottoposti a un test di tolleranza orale al glucosio e che i portatori del biosensore possono sostituirlo rimuovendo l'estremità del filo e inserendone uno nuovo.

2. Anche i ricercatori dell'University of New Mexico stanno sviluppando un biosensore percutaneo.

Il gruppo di ricercatori stà soprattutto cercando di risolvere i problemi relativi alla durata del sensore. I ricercatori riempiono il sensore con una miscela di glucosio ossidasi e polvere di grafite.

Dato che l'enzima è chimicamente legato al carbonio, ha una vita maggiore (circa tre mesi). Inoltre, i ricercatori affermano che l'enzima inattivo può essere sostituito da ulteriore enzima mediante iniezione di questo in un piccolo tubo sporgente dalla pelle. Attualmente, il gruppo di ricerca inserisce il sensore rigido, più piccolo di un granello di riso, sotto la pelle del paziente dopo aver praticato un'incisione. In questa fase di sviluppo, i ricercatori collegano il biosensore a un monitor esterno. La ricerca futura prevede però la messa a punto di una sistema telematico. I ricercatori impianteranno il sensore, privo di fili sporgenti dal corpo, interamente sotto la pelle e i portatori del biosensore potranno riempirlo attraverso una membrana posta appena sotto la pelle. Con questo approccio si apre la possibilità di costruire biosensori adatti ad essere impiantati nel corpo, efficienti e caratterizzati da una lunga durata (superiore a parecchi mesi).

3. I ricercatori dell'University of California stanno sviluppando un biosensore e un trasmettitore radio combinati da impiantare sotto la pelle.

In questo sistema la punta del sensore è inserita direttamente dentro un vaso sanguigno e una ricevente esterna preleva i segnali radio provenienti dalla trasmittente interna. (La trasmittente ha le dimensioni di una monetina, e il sensore flessibile collegato a questa ha le dimensioni di una graffetta distesa)

Questo dispositivo differisce dai due sensori precedentemente descritti per il fatto che contiene due enzimi: glucosio ossidasi e catalasi. La presenza anche dell'enzima catalasi aumenta la vita della glucosio ossidasi. Ad esempio, il gruppo di ricercatori ha dimostrato che il biosensore può lavorare per 100 giorni, con la potenzialità di operare per almeno un anno.

Gli sforzi della ricerca nel campo dei sistemi di monitoraggio del glucosio sono diretti verso la semplicità di utilizzo, la non-invasività, il minimo fastidio possibile per il paziente e la possibilità di realizzare monitoraggio

continuo a lungo termine. In risposta a questi problemi è stata sviluppata una tecnica per la raccolta dei

campioni, attraverso la pelle. Ciò che si raccoglie viene chiamato tecnicamente SEF (Suction Effusion Fluid). L’unità di campionamento del SEF, indipendentemente dalle caratteristiche costruttive e dai materiali è

costituita da una cella di raccolta e da una pompa per il vuoto (fig.4 e 5). La cella di raccolta deve essere molto leggera (dati riportati:20g) perché deve essere applicata mediante un bracciale sul braccio del paziente. La cima della cella è connessa con la pompa a vuoto che vi applica una pressione negativa (400 mmHg). Questo sistema permette un monitoraggio quasi continuo e non invasivo. L’applicazione della cella di raccolta avviene dopo una preventiva rimozione dello strato corneo dall’epidermide, (che agirebbe altrimenti da barriera) con delle strisce di nastro adesivo. Il paziente non prova dolore ma solo un arrossamento della pelle durante il trattamento ripetuto con nastro adesivo, mentre la suzione comporta solo un arrossamento della zona con

Il basso vuoto applicato e l’area di suzione di circa 7 cm², consentono di estrarre piccoli volumi di SEF e ciò costituisce un problema risolvibile solamente usando un sensore ISFET. (Il volume del campione ottenibile in 10 min. tenendo conto di una velocità media di suzione di circa 12 uL/h/cm²è di circa 14 uL). Il SEF consiste (fig.6) in fluido interstiziale del tessuto subcutaneo e sangue filtrato dalle pareti dei capillari. È stato rilevato,che i cambiamenti della concentrazione di glucosio nel SEF, seguono quelli che si hanno nel siero con un ritardo di circa 10-20 min, inoltre nel SEF il livello di glucosio è inferiore di circa 19-33%. La concentrazione di proteine è quasi la metà di quella presente nel siero. Quest’ultimo aspetto rende il SEF adatto al monitoraggio di glucosio a lungo termine, poiché l’adesione proteica al biosensore è solitamente il maggior fattore limitante al suo “tempo di vita”.

Caratteristiche del biosensore ISFET

Per la misurazione dei piccoli volumi ottenibili con la cella di raccolta precedentemente descritta, è quasi d’obbligo l’impiego di un biosensore ISFET, causa le sue ridotte dimensioni e gli ulteriori vantaggi (già elencati)

rispetto agli altri biosensori. Per realizzare l’ISFET e` stato impiegato un wafer di tipo SOS (Silicon-On-Sapphire). E` stato impiegato anche un metodo per la fabbricazione e la deposizione della membrana enzimatica chiamato Lift-Off method tipico dei processi di fabbricazione dei semiconduttori, che permette di controllare lo spessore e il pattern della deposizione. La regione sensibile e` mostrata in fig.7 . Entrambe le membrane sono immobilizzate sulla regione di gate. Il sensore, come si vede dal disegno della sua sezione trasversale e` composto da un ENFET (Enzime Field Effect Transistor) e un ISFET di riferimento (REFET). La membrana sull’ENFET consiste in due strati. Quello inferiore e` una membrana con l’enzima immobilizzato, spessa 1 um deposta con Spin-coating e composta da una miscela di GOD, albumina di siero bovino (BSA) e soluzione di glutaraldeide. Lo strato superiore e la membrana del REFETsono composti dalla stessa miscela ma senza il GOD. In questo modo l’ENFET riesce a rilevare cambiamenti di pH dovuti alla reazione enzimatica mentre il REFET non li rileva mancando del GOD nella membrana. Misurando l’uscita differenziale tra l’ENFET e il REFET si ottiene una risposta dovuta solamente all’ossidazione del glucosio. Il sensore viene montato sulla punta di un connettore a nastro (fig 7).

Lo strato di membrana superiore consente di estendere la regione di funzionamento lineare del sensore e di impedirne la saturazione ottenendo una buona linarita` fino a concentrazioni di circa 400 mg/dl consentendone

l’utilizzo in vivo e questo perche` la membrana limita la dissusione di glucosio rispetto a quella di ossigeno.

Il funzionamento di questo tipo di sensore e` stato testato per ricavare curve glicemiche durante tests OGGT ed e` stato in grado di effettuare misure di concentrazione in volumi di circa 5 uL e i risultati ottenuti sono stati

comparati con quelli provenienti da altri metodi di misura. In fase di studio e di sperimentazione il SEF e` stato prelevato mediante un dispositivo a siringa ed analizzato in condizioni particolari, ma sembra possibile anche

L'alanina è un analita molto importante nel metabolismo del glucosio poiché è uno dei maggiori precursori gluconeogenetici. E' stato riportato in letteratura che la concentrazione di alanina in pazienti con diabete mellito insulino-dipendente è inferiore rispetto a soggetti normali probabilmente per un maggior utilizzo del metabolita nel processo gluconeogenetico.
Il trattamento con insulina riporta i valori alla normalità. Al contrario in soggetti non insulino-dipendenti è stata trovata una concentrazione più alta del normale. La determinazione di alanina viene effettuata con metodiche fluorimetriche o in HPLC; recentemente sono stati sviluppati anche sensori ottici ed elettrochimici per la determinazione in continuo del metabolita. Di seguito si riportano notizie su di un biosensore che presenta il vantaggio di una maggiore semplicità in quanto le reazioni enzimatiche coinvolte nella misura sono due ed inoltre necessita di un solo cofattore in aggiunta al tampone di lavoro: l'a-chetoglutarato.

Determinazione dell'alanina
La determinazione dell'alanina è stata effettuata sulla base delle seguenti reazioni:

La prima reazione è catalizzata dalla ALT, la seconda dalla glutammato ossidasi. Entrambi gli enzimi sono stati immobilizzati su una membrana di policarbonato utilizzando la glutaraldeide come agente bifunzionale per la formazione di legami crociati tra i gruppi amminici proteici liberi. Il biosensore è stato assemblato ponendo questa membrana enzimatica su un elettrodo ad H₂O₂.
Se nel tampone di misura (Dulbecco) è presente una concentrazione costante di a-chetoglutarato la variazione di corrente registrata dall'elettrodo ad acqua ossigenata è proporzionale alla concentrazione di alanina in soluzione.

In Figura 8 è mostrata la curva di calibrazione per l'alanina dopo l'ottimizzazione di parametri quali pH (7.4), temperatura (25°C) e concentrazione di a-chetoglutarato (1 mmol/L).

Il limite di rilevabilità è di 2 x 10^-6 mol/L con una linearità di risposta fino a 10^-3 mol/L. Il Coefficiente di Variazione (CV) è intorno al 10% con un tempo di risposta intorno ad 1 minuto. Se utilizzato in modo continuo il biosensore perde il 50% della sensibilità dopo 15 giorni, questo a causa della inattivazione della ALT immobilizzata. La risposta al glutammato invece, rimane pressoché costante durante questo periodo.

I principali interferenti per la misura nel siero sono il glutammato e la glutammina presenti nel sangue a concentrazioni intorno a 4 x 10^-5 e 5 x 10^-4mol/L, rispettivamente.
Per eliminare l'interferenza della glutammina è stato deciso di effettuare le misure in un tampone di lavoro in cui fosse presente glutammina ad una concentrazione superiore a 2 x 10^-4 mol/L; a questo valore, infatti, la risposta del biosensore a variazioni di glutammina è nulla poiché è stata raggiunta la saturazione.
L'interferenza dovuta alla presenza di glutammato è stata invece eliminata ponendo sul sensore una seconda membrana enzimatica sulla quale sono stati immobilizzati gli enzimi glutammato ossidasi e catalasi. In questo modo il glutammato che arriva alla superficie del sensore reagisce con la glutammato ossidasi presente sulla membrana esterna al contrario dell'alanina che la attraversa per essere processata a livello della seconda membrana. L'H₂O₂ prodotta esternamente viene eliminata dalla catalasi presente anch'essa sulla membrana esterna.
La determinazione di alanina è stata quindi effettuata su 3 campioni di siero (Tab. 3) e confrontata con quella ottenuta utilizzando una metodica in HPLC; i risultati ottenuti sono in buon accordo e mostrano come sia possibile misurare l'alanina nel siero con questo biosensore.

I primi microelettrodi realizzati erano ottenuti inserendo un filo di Pt del diametro di 50-100 mm e ricoperto da una sottile guaina isolante di Teflon, nel lume di un ago ipodermico, che veniva poi riempito di resina epossidica. Il filo di Pt veniva in seguito saldato al filo centrale di un cavo coassiale, mentre l'avvolgimento esterno del medesimo cavo veniva saldato all'acciaio dell'ago in modo che esso potesse servire da elettrodo di riferimento. Per ottenere la selettività necessaria verso le sostanze interferenti presenti nei fluidi biologici (essenzialmente acido ascorbico ed urico), un primo strato di acetato di cellulosa veniva depositato sulla punta del sensore ad ago mediante immersione dell'ago nella relativa soluzione e successiva asciugatura.
Con la stessa procedura un secondo strato di enzima glucosio ossidasi veniva depositato sulla punta dell'ago; tuttavia per ottenere la linearità necessaria a misurare il glucosio "in vivo" nel range normale e patologico, è stato necessario depositare un terzo strato di membrane che riuscivano a ridurre l'accesso di glucosio allo strato enzimatico senza però ridurre il passaggio dell'ossigeno necessario allo svolgimento della reazione enzimatica.

Questa membrana esterna è stata realizzata sia attraverso la deposizione di uno strato di poliuretano, sia fissando sulla punta dell'elettrodo un pezzetto di membrana di policarbonato reperibile commercialmente ma opportunamente silanizzata per aumentarne la biocompatibilità e la linearità della risposta.

In fig. 9 si può vedere un esempio del primo tipo di biosensore ad ago realizzato. Con questo tipo di geometria del sensore, i risultati più affidabili sono stati ottenuti usando come terzo strato la membrana di policarbonato; con questa configurazione sono stati effettuati esperimenti "in vivo" su animali di laboratorio.

Il procedimento di inserzione del biosensore ad ago era il seguente: un ago catetere di Teflon veniva inserito sottocute sul dorso di un coniglio per alcuni centimetri, poi l'ago di acciaio interno veniva rimosso e sostituito con il biosensore preparato con lunghezza tale che la punta sporgesse di 1-2 mm dall'ago di Teflon (fig. 10).

I due aghi venivano bloccati insieme tramite l'attacco a baionetta presente sui due, poi fissato sul dorso dell'animale con un pezzo di cerotto adesivo. Il biosensore veniva poi collegato allo strumento di misura e la corrente, prodotta dall'ossidazione del glucosio sottocutaneo in prossimità della membrana enzimatica dell'elettrodo, misurata e registrata.

In fig. 11 viene riportato il risultato di uno di questi esperimenti effettuato per un periodo di tempo di 4 ore su un coniglio non anestetizzato: si può notare come all'inizio il sensore misuri la concentrazione basale del glucosio sottocutaneo del coniglio e come essa non venga depleta dallo svolgersi della reazione enzimatica. Al tempo marcato come A e D nella figura al coniglio veniva somministrato un carico orale di glucosio, seguito dopo alcuni minuti da un corrispondente aumento del glucosio sottocutaneo misurato dal sensore (fig.11).

Figura 11. Esperimento in vivo su un coniglio non anestetizzato: ai punti marcati come A e D sul coniglio è stato effettuato un carico di glucosio per via orale; dopo circa 30 minuti si raggiunge nel tessuto sottocutaneo un massimo (punti B e E, pari ad una concentrazione di circa 12,5 e 7,8 mM). I punti indicati come C ed F rappresentano valori di glucosio basale pari a circa 4,2 mM.

Nel tentativo di migliorarne le caratteristiche, è stato in seguito realizzato un secondo tipo di biosensore ad ago, questa volta flessibile, e di conseguenza più biocompatibile e meno doloroso. Esso era realizzato intrecciando tra loro tre fili isolati di cui due di Pt, rispettivamente l'elettrodo di lavoro e l'elettrodo ausiliario, ed uno di Ag clorurato, l'elettrodo di riferimento; la dimensione finale del biosensore era all'incirca di 300 mm.

Sulla punta del sensore sono stati deposti i tre strati di membrane, necessari alla misura del glucosio "in vivo" e, al contrario dei sensori realizzati precedentemente, sono stati ottenuti risultati riproducibili anche usando il poliuretano come strato esterno limitante l'accesso di glucosio al sensore.

Prove di laboratorio mostravano un'ottima stabilità del biosensore durante 24 ore di misura continua di glucosio standard per cui, per valutarne le caratteristiche in presenza di fluidi biologici, sono state effettuate misure di glucosio in sieri umani ricostituiti.

Come riportato internazionalmente da tutti gli autori che effettuano ricerche sullo stesso argomento, in presenza di fluidi biologici, questi biosensori mostrano una diminuzione di sensibilità rispetto alla misura in soluzione standard, che in tal caso si è rivelata essere pari al 50% nei sieri diluiti 1:1 e all'80% nel caso di sieri non diluiti.

Questa diminuzione di sensibilità era in ogni caso reversibile, cioè ricalibrando il sensore in tampone fisiologico dopo la misura in siero, esso recuperava integralmente la iniziale sensibilità.

Una possibile spiegazione di questo comportamento potrebbe essere l'adesione allo strato esterno del sensore da parte delle proteine presenti nei fluidi biologici.

In ogni caso, anche se ridotta, la sensibilità del microbiosensore era ancora sufficiente per permettere misure "in vivo", per cui esso è stato usato in esperimenti di misura del glucosio sottocutaneo in ratti anestetizzati.

Il procedimento di inserzione sottocute è simile al precedente con la modifica che in questo caso solo il sensore rimane sottocute poiché anche la cannula guida di Teflon viene rimossa dopo l'inserzione.

Il risultato di uno di questi esperimenti è mostrato nella fig. 12: dopo circa 30 minuti, necessari a che il sensore raggiunga un segnale stabile, il ratto è stato sottoposto ad un carico endovenoso di glucosio infuso lentamente per una durata di 5 minuti. Dopo un solo minuto dall'inizio del carico endovenoso si può notare come anche il glucosio sottocutaneo si innalza, come mostrato dal biosensore, e raggiunge il picco massimo dopo circa 9 minuti.

Figura 12. Misura del glucosio sottocutaneo di un ratto anestetizzato tramite un microbiosensore di seconda generazione. Le frecce rappresentano una infusione endovenosa di glucosio, la linea continua la misura sottocutanea, i punti rappresentano i corrispondenti valori di glucosio ematico misurati con il sistema di riferimento.

Per avere delle misure di controllo, ogni 15 minuti aliquote di sangue venivano prelevate dalla coda del ratto e misurate con un sistema di riferimento e i relativi valori sono riportati come punti nella figura. Il primo valore di glucosio ematico misurato col sistema di riferimento è stato imposto uguale al valore di glucosio sottocutaneo misurato con il microbiosensore, dopo di che si è assunta una relazione lineare tra la corrente misurata dal sensore e la concentrazione di glucosio nell'intervallo di misura (calibrazione ad un punto).

Si può notare come le variazioni di glucosio nel sangue e quelle nel sottocute nel ratto siano in accordo con i due procedimenti. Questi risultati mostrano quindi come ci siano buone possibilità per questi dispositivi per la misura in continuo ed "in vivo" del glucosio (fig. 12).

Recentemente sono stati introdotti sul mercato dell'analisi strumentale sistemi automatici per l'infusione di insulina con un meccanismo di "feedback" regolato dalla concentrazione di glucosio nel sangue del paziente. Sebbene questi strumenti rappresentino un importante miglioramento in terapia, non normalizzano completamente le alterate concentrazioni dei metaboliti legati al glucosio come per esempio il lattato e il piruvato. Il monitoraggio di questi due metaboliti insieme al glucosio utilizzando tre biosensori specifici per i rispettivi substrati è stata la più recente applicazione dei biosensori in diabetologia.

Figura 13. Schema del pancreas artificiale "Betalike" modificato aggiungendo una cella contenente i sensori a lattato e piruvato.

Un sensore a lattato ed uno a piruvato assemblati sono stati inseriti nel sistema a flusso continuo di un nuovo pancreas artificiale chiamato "Betalike". Il betalike dializza il sangue diluito con una soluzione fisiologica a pH 7.4, reinfonde le cellule nel flusso sanguigno del paziente, mentre analizza il dializzato per conoscere la concentrazione del glucosio. Aggiungendo i nuovi sensori per il lattato e piruvato al Betalike si è misurato glucosio, lattato e piruvato in continuo, in tempo reale in un dializzato libero da proteine avente la stessa viscosità di una soluzione acquosa. In figura 13 è illustrato lo schema del pancreas artificiale betalike modificato aggiungendo i sensori per il lattato e piruvato.

Poichè il sensore a piruvato necessita di alcuni cofattori per ottimizzare la risposta una pompa peristaltica tramite una connessione a T introduceva nel flusso del dializzato una soluzione concentrata di cofattori. Nella figura 14 sono mostrati i risultati di una determinazione in vivo dei tre metaboliti in un soggetto nondiabetico di 23 anni sottoposto a trattamento con il pancreas artificiale.

Figura 14. Misura in continuo del glucosio, lattato e piruvato in vivo durante un esperimento con il pancreas artificiale "Betalike". st=Soluzioni standard di lattato e piruvato per la calibrazione dei sensori. Al tempo indicato con cal il sensore a glucosio del "Betalike" e' stato calibrato. Al tempo indicato con Ex e' stato chiesto al paziente di eseguire un breve esercizio fisico che e' stato fermato al tempo indicato con Stop ex. Al tempo indicato con Inf glu e' stata rapidamente infusa una quantita' di glucosio pari a 50 g. Meal indica il periodo in cui il paziente ha consumato il pasto.

Il sangue prelevato dal paziente tramite un catetere a doppio lume viene eparinizzato e diluito 10 volte con la soluzione fisiologica, poi viene dializzato tramite il filtro da dialisi. Il dializzato viene pompato verso il sensore a glucosio con una velocità di flusso di 0.5 ml/min, poi attraverso la cella a flusso che contiene i sensori a lattato e piruvato. Ogni 15-20 minuti venivano effettuati dei prelevamenti di sangue dal paziente e ne veniva analizzato spettrofotometricamente il contenuto di lattato e piruvato.

I risultati, rappresentati dalle linee tratteggiate in figura 14 illustrano il confronto dei risultati dell'analisi tra i due metodi. L'ottima relazione tra i due metodi esclude la possibilità che vi sia una reciproca interferenza. Inoltre è da escludere anche una possibile interferenza dovuta al consumo di ossigeno da parte del glucosio durante la reazione enzimatica. Il consumo di ossigeno calcolato dalla misura di corrente all'elettrodo a glucosio mostra una diminuzione di poche nanomoli per litro assolutamente trascurabile.

Come illustrato in figura 14 queste variazioni inducono a considerare lo sviluppo di nuovi e più complessi algoritmi per l'infusione di insulina, algoritmi che appunto tengano presenti anche le variazioni dei metaboliti del glucosio. L'affidabilità dei biosensori quindi darà un contributo decisivo a questa ricerca.

Un'altra applicazione molto importante in campo diabetico e strettamente correlata alla precedente è l'utilizzazione della tecnica del "glucose clamp" per scopi diagnostici e terapeutici.

Nell'uomo esiste un opposto e simultaneo feedback tra la concentrazione di glucosio e la secrezione di insulina, vale a dire che al variare di una delle due variabili corrisponde una opposta variazione dell'altra. Questo feedback così complesso e integrato può essere rotto facilmente usando sistemi in vitro dove il pancreas o tessuti individuali possono essere isolati ed esposti a differenti concentrazioni di glucosio o di insulina. A causa di questa complessa interazione tra glucosio ed insulina o di entrambi i tessuti periferici e le cellule beta, diventa importante sviluppare un sistema in cui le variabili interessate possono essere manipolate indipendentemente.

Questo obiettivo è stato raggiunto la prima volta da De Fronzo ed al. nel 1979. In seguito si sono sviluppate altre tecniche di glucose clamp e sono apparse numerose pubblicazioni nella letteratura specializzata.

Utilizzando invece il pancreas artificiale Betalike modificato opportunamente dal produttore, si è eseguita la tecnica del glucose clamp in modo automatico mediante un algoritmo sviluppato dalla ditta che commercializza la macchina, inoltre sono stati connessi in serie al sensore di glucosio due sensori per la misura in continuo del potassio e lattato. Sono stati effettuati clamp su sangue venoso della durata di 6 ore, con glicemia di clamp di 130 mg/dl ed insulinemia di circa 200 U/ml su tre soggetti normali e quattro diabetici, di sesso femminile, di età compresa tra 45 e 65 anni.

I soggetti diabetici erano in terapia con dieta ed ipoglicemizzanti orali di associazione. Venivano effettuati prelievi ogni mezz'ora per il confronto dei valori misurati con metodi di riferimento tradizionali. I sensori a glucosio e lattato erano quelli usati nei precedenti lavori, il sensore a potassio invece è un elettrodo a flusso costruito con un tubo di gomma al silicone biocompatibile e di alto affidamento.

I risultati mostrano che la strumentazione adoperata presenta un'estrema maneggevolezza ed affidabilità nel raggiungere e mantenere la glicemia di clamp a ±3% automaticamente; le glicemie misurate avevano un coefficiente di correlazione di 0.98 confrontate con il metodo di riferimento.

Anche le rilevazioni di latticidemia sono state accurate mostrando un lieve incremento durante la fase iniziale (priming) nei soggetti diabetici. Il potassio aveva invece una tendenza opposta, con una rapida riduzione della concentrazione ematica in corrispondenza del priming con ritorno a valori basali ed una successiva lenta diminuzione dei livelli misurati (fig.15).

Da un punto di vista analitico è da notare la riproducibilità delle calibrazioni dei due sensori prima e dopo l'esperimento.

Figura 15. Misura in continuo del lattato e potassio in vivo durante un esperimento di "glucose clamp" con il pancreas betalike. La freccia con le lettere "cal" indica le calibrazioni per l'elettrodo a potassio e per il sensore a lattato prima ed alla fine dell'esperimento.

We report the features of a sensor for determining L-lactate. An oxygen sensor, coupled to a nylon net with chemically bound L-lactate oxidase (EC 1.1.3.2), is inserted into an artificial pancreas (Biostator, Miles) "downstream" from the glucose sensor. We used the sensor to continuously monitor the L-lactate concentration in blood after a "glucose clamp" experiment with a diabetic patient. L-Lactate determinations in blood drawn from the patient every 15 min agreed well with results obtained by use of the L-lactate sensor.

A major problem in development of a glucose sensor for use in an implantable artificial pancreas is the lack of reproducibility in signals from sensor to sensor. Each glucose sensor fabricated with currently used methods has a unique response to varying levels of glucose concentration and thus needs to be individually calibrated before use. We have adapted microchip manufacturing techniques for the fabrication of electrochemically based glucose sensors with standardized and reproducible function. Scanning electron microscopic study of the resulting electrode surfaces shows them to be smooth and featureless at all levels of magnification. X-ray diffraction analysis of the electrodes indicates preferential exposure of the [1,1,1] crystal interface. Cyclic voltammetry evaluation of initial sensor response to varying glucose concentrations shows excellent sensor to sensor reproducibility for all sensors made with the same underlayment. Sensors made with titanium underlayment appear to be more differentiated and thus more sensitive to variations in glucose concentration than are sensors with chromium underlayment. Although the initial response of microchip glucose sensors appears to be standardized and reproducible, additional development of an appropriate electrical insulation material is required before long-term study of signal stability is feasible.

The main factor mitigating against the realization of a hypodermically inserted glucose sensor for an artificial pancreas is the change in response current due to fibroblast adhesion and protein adsorption to the sensor surface. To overcome this problem, we have developed a method whereby the activity of glucose oxidase (GOD) fixed on the membrane of the sensor surface is switched on and off, and measurements are made during a transient state in which the glucose concentration gradient within the GOD membrane is small. Measuring in a transient state while GOD activity is being controlled, a correlation was observed between glucose concentration and response current in a phosphate buffer solution. Calibration curves of response current against glucose concentration in aqueous solutions of human serum albumin and in phosphate buffer solution were then compared using the transient method and a steady state method without control of GOD activity. In addition, glucose concentration was measured in bovine plasma for 480 min, and the time courses of the response currents for the transient and steady state measurements were compared. It was found that in both experiments the response current decreased greatly under steady state measurement as a result of protein adsorption, but during the transient measurement, response current was virtually unchanged. By measuring glucose concentration in the transient state while controlling GOD activity, it is possible to inhibit the effects of protein adsorption.

INSERM Unite 341, Department of Diabetology, Hotel-Dieu Hospital, Paris, France.

The goal of this study was to determine whether porcine islets encapsulated in hollow fibers made of AN69 copolymer can correct hyperglycemia in diabetic mice and provide normal tolerance to a glucose challenge. In vitro perifusion of hollow fibers demonstrated the rapid kinetics of insulin release in response to glucose. Two fibers containing islets were transplanted into the peritoneal cavity of each of 17 streptozotocin induced diabetic mice. In 11 mice, diabetes was reversed within 3 days with plasma glucose levels decreasing from 19.7 +/- 0.9 (mean +/- SEM) before implantation to 10.9 +/- 0.8 mmol/L. Intraperitoneal glucose tolerance tests were performed in transplanted (n = 7), nondiabetic (n = 15), and diabetic mice (n = 6). A normal glucose pattern was observed in the transplanted diabetic mice. This was achieved in the presence of plasma insulin levels lower than those observed in control nondiabetic mice, suggesting the presence of a state of hypersensitivity to insulin, which was demonstrated in this model by exogenous insulin tolerance tests. In conclusion, encapsulation of islets suspended in ultraculture medium in biocompatible membranes of AN69 can provide xenograft survival, and complete normalization of glucose tolerance can be achieved.

Immunoisolation is a potentially important approach to transplanting islets without any immunosuppressive therapy. This study was designed to investigate whether complement penetrates into the diffusion chamber that we developed for a bioartificial endocrine pancreas (Bio-AEP). The results showed that within 12-24 h, when a Nuclepore membrane (Nuclepore Corp., California) was the sole barrier, complement permeated 100%. However, the Nuclepore membrane used together with a mixed matrix prevented complement penetration. Also, the complement become inactivated during penetration through both the mixed matrix and the Nuclepore membrane with a pore size of 0.1 microm. In conclusion, immunoisolation of cells by a mixed matrix and a Nuclepore membrane of 0.1 microm pore size is a particularly effective method for transplanting xenogeneic cells. Thus, the clinical application of our Bio-AEP shows promise for long-term xenotransplantation without an immunosuppressant.

Medical Research Institute and Department of Surgery III, Tokyo Women's Medical University, Japan.

Recently, we described a diffusion chamber for a bioartificial endocrine pancreas (Bio-AEP). Pancreatic islet cells in the Bio-AEP device were isolated from the immune system of the host by an artificial barrier, while nutrients, electrolytes, oxygen, and bioactive secretory products were exchanged across this barrier. This experiment was designed to evaluate whether the diffusion chamber could be useful as a Bio-AEP in the treatment of diabetes. Six streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats each received a diffusion chamber containing 8 x 10(6) MIN6 cells as a xenograft Bio-AEP. In the STZ diabetic rats with Bio-AEPs, a return to normoglycemia was observed up to 30 weeks after implantation, without the use of any immunosuppressant. A gradual increase in the body weight of the rats was also observed. In three STZ diabetic rats, diffusion chambers without MIN6 cells were implanted as a sham operation. The fasting blood glucose levels in these three rats remained higher than 600 mg/dl, after implantation, and they lost weight. Thirty-five weeks after implantation, the pancreata were removed from the rats that underwent xenoimplantation, those that had the sham operation, and the normal control rats. In the sham-operated animals, the exocrine tissues of the pancreata were vacuolated and pancreatic B cells were not seen in the islets. In contrast, in the pancreata from the xenoimplantation, the exocrine tissues were normal, and a few pancreatic B cells were seen in the islets. These results indicated that xenoimplantation using the Bio-AEP might retard the progress of diabetes.

Immunoisolation is a potentially important approach to transplanting islets without any immunosuppressive therapy. The concept of immunoisolation is outlined in systems in which the transplanted tissue is separated from the immune system of the host by an artificial barrier. We previously described a diffusion chamber as a bioartificial endocrine pancreas (Bio-AEP), which was constructed by placing pancreatic endocrine cells, trapped in a mixed matrix, in the center of a ring holder sandwiched between nucleopore membranes, which were shielded by silicone. This experiment was designed to evaluate a suitable pore size for the nucleopore membrane to ensure immunoisolation during xenoimplantation of the Bio-AEP in vitro and in vivo. A nucleopore membrane of pore size 0.1 microm or 0.2 microm was employed as the semipermeable membrane which provided a mechanical barrier between the endocrine pancreas graft and the host immune system. The protective effect of the Bio-AEP from humoral immunity was determined in vitro, using sensitized sheep erythrocytes (EAs). A complement protein did not destroy the cell membranes of the EAs in the diffusion chamber containing the mixed matrix with the nucleopore membrane of 0.1 microm pore size. In an in vivo experiment, 6 streptozotocin (STZ) induced diabetic rats were implanted with Bio-AEPs constructed with nucleopore membranes of pore size 0.1 microm and containing MIN6 cells in the mixed matrix. In the STZ diabetic rats with Bio-AEPs, a return to normoglycemia was observed up to 50 weeks after implantation without the use of any immunosuppressant. Also, the body weights of the rats gradually increased. During the observation, when the Bio-AEPs were removed from the STZ diabetic rats, the blood glucose immediately returned to preimplantation levels, and the body weights of the rats also decreased. The membranes of the Bio-AEPs removed from the STZ diabetic rats showed a very thin layer of fibroblastic cells on the outer surfaces. The results indicated that the Bio-AEP, in which pancreatic endocrine cells were trapped in a mixed matrix and with a 0.1 microm pore size membrane, should be useful for xenoimplantation into diabetic animals and may open a new field in the therapy of human diabetics.

School of Chemical Engineering and P. H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology, Atlanta, Georgia 30332, USA.

Tissue-engineered pancreatic constructs based on immunoisolated, insulin-secreting cells are promising in providing an effective, relatively inexpensive, long-term treatment for type I (insulin-dependent) diabetes. An in vitro characterization of construct function under conditions mimicking the in vivo environment is essential prior to any extensive animal experimentation. Encapsulated cells may experience hypoxic conditions postimplantation as a result of one or more of the following: the design of the construct; the environment at the implantation site; or the development of fibrosis around the construct. In this work, we studied the effects of 3- and 4-day-long hypoxic episodes on the metabolic and secretory activities and on the levels of intracellular metabolites detectable by phosphorus-31 nuclear magnetic resonance ((31)P NMR) of alginate/poly-L-lysine/alginate entrapped betaTC3 mouse insulinomas continuously perfused with culture medium. Results show that, upon decreasing the oxygen concentration in the surrounding medium, the encapsulated cell system reached a new, lower metabolic and secretory state. Hypoxia drove the cells to a more anaerobic glycolytic metabolism, increased the rates of glucose consumption (GCR) and lactate production (LPR), and reduced the rates of oxygen consumption (OCR) and insulin secretion (ISR). Furthermore, hypoxia reduced the levels of intracellular nucleotide triphosphates (NTP) and phosphorylcholine (PC) and caused a rapid transient increase in inorganic phosphate (P(i)). Upon restoration of the oxygen concentration in the perfusion medium, all parameters returned to their prehypoxic levels within 2 to 3 days following either gradual unidirectional changes (ISR, NTP, PC) or more complicated dynamic patterns (OCR, GCR, LPR). A further increase in oxygen concentration in the perfusion medium drove OCR, ISR, NTP, PC, and P(i) to new, higher levels. It is concluded that (31)P NMR spectroscopy can be used for the prolonged noninvasive monitoring of the bioenergetic changes of encapsulated betaTC3 cells occurring with changes in oxygen tension. The data also indicate that the oxygen-dependent states might be related to the total number of viable, metabolically active cells supported by the particular oxygen level to which the system is exposed. These findings have significant implications in developing and non-invasively monitoring a tissue-engineered bioartificial pancreas based on transformed beta cells, as well as in understanding the biochemical events pertaining to insulin secretion from betaTC3 insulinomas. Copyright 1999 John Wiley & Sons, Inc.

Department of Materials Science and Engineering, Kwangju Institute of Science and Technology, 572 Sangam-dong, Kwangsan-ku, Kwangju 506-712, South Korea

On the basis of an overview of the current methodologies used for biohybrid artificial pancreas (BAP) and a critical analysis of the problems in designing the BAP devices, especially macrocapsule systems, a new type of refillable BAP is proposed. The following highlights the unique features of this design: (1) use of a thermally reversible synthetic hydrogel made of N-isopropylacrylamide based copolymer as an extracellular matrix facilitates the recharge of the encapsulated islets whenever necessary; (2) use of a pouch system composed of an inert processable immunoprotective membrane with appropriate mechanical, chemical and transportation properties makes it easy to fabricate the BAP device; (3) introduction of an oxygen carrying polymer ensures an adequate supply of oxygen to maintain high viability and function of the islets; (4) incorporation of biospecific polymers within the matrix to stimulate insulin secretion from islets may decrease the number of islets required, consequently resulting in reduced implant volume. The design concept and technology may also be utilized to deliver cells to treat other hormone deficiency syndromes. This paper also discusses the future development of BAPs.

BACKGROUND: Considering the difficulties in pancreas transplantation, the development of an artificial pancreas would be of great value. We have established a transkaryotic artificial beta-cell line, CHO/I, produced by transfecting the human proinsulin gene into the Chinese hamster ovary (CHO) cell line. The present study was designed to assess the value of an artificial pancreas using a diffusion chamber containing CHO/I cells. MATERIALS AND METHODS: Wistar rats rendered diabetic by 90% pancreatectomy were treated by implanting a diffusion chamber containing CHO/I cells cultured on microcarrier beads. RESULTS: The diffusion chamber containing microcarrier beads produced 100-folds more CHO/I cells than the chamber alone, as calculated from the secreted IRI in vitro. When diffusion chambers containing CHO/I cells on microcarrier beads were implanted into the peritoneal cavity of the 90% pancreatectomized rats, the fasting serum IRI level increased and the fasting blood glucose decreased to the normal level for 12 weeks. An intraperitoneal glucose tolerance test demonstrated, however, that the diffusion-chamber-implanted rats did not respond to glucose loading. CONCLUSION: An artificial pancreas using a diffusion chamber containing human proinsulin gene transfected cells might be a promising model for future clinical application.

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4) M.Mascini, D.Moscone, R.Pilloton, Pyruvate and lactate electrochemical sensors with immobilized enzyme for control in artificial pancreas, Annali di Chimica (87), 813-24 vol 77, No 9-10

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14)Roberto Pilloton, Julia Mela, Loris Marradini, Screen printed electrochemical biosensors on ceramic and polymeric substrates, Presented at CIMTEC98 held in Florence 1998 June 14-19

15) E. Di Fabrizio, M. Gentili, P Morales., R Pilloton, J. Mela, S. Santucci, A. Sese, MICROLITOGRAPHIC TECHNIQUES FOR LASER ASSISTED FABRICATION OF BIOELECTRONIC DEVICES, Applied Physics Letters 1996 Nov 18;69(21):3280-3282 - (C) 1996 American Institute of Physics.

16) Autori vari, a cura di R.Pilloton, Biosensori: Giornata di studio (22.01.93) Atti. ENEA RT INN(94)

17) L.Mosiello R.Pilloton, Biosensori: prospettive per le misure in campo ambientale, Presented at "Prima Conferenza Nazionale delle Agenzie Ambientali", Torino 10-12 Marzo 1997

18) Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care 21 (Suppl. 1): S5-S19, 1998; Proceedings of the 4th International Workshop-Conference on Gestational Diabetes Mellitus. Diabetes Care 21 (Suppl. 2): B1-B167, 1998.

Trapianto di isole pancreatiche	Pancreas endocrino artificiale	Tecniche di manipolazione genetica
L'impianto di nuove isole integre in sostituzione di quelle danneggiate da un'aggressione autoimmune, costituisce in apparenza il metodo ideale per riportare il diabetico ad uno stato di normalità. L'ostacolo fondamentale al trapianto di isole è dato dalla reazione di rigetto. Per ovviare al rigetto sono allo studio tecniche di immunoisolamento che consistono essenzialmente nell'incapsulamento delle isole pancreatiche all'interno di un organulo bioartificiale costituito di membrane semi-permeaili che consentono la funzione di secrezione insulinica delle isole e al tempo stesso, le proteggono dall'aggressione immunitaria.	Durante gli anni Settanta è stato elaborato e reso disponibile uno strumento - il pancreas endocrino artificiale - capace di erogare automaticamente l'insulina adeguandone le quantità alla necessità del momento. Scopo della ricerca è quello di trasformare l'attuale apparato, che oggi è utilizzabile solo al letto del paziente, in un dispositivo miniaturizzato impiantabile. Ostacola il progetto l'attuale non disponibilità di un sensore del glucosio. Varie teconologie-informatica, enzimatica, elettronica ed ottica - sono sottese a realizzarlo.	Queste, particolarmente interessanti, sono tuttora in fase estremamente pionieristica. Loro scopo, comunque, è quello di modificare il genoma di alcune linee cellulari, introducendovi il gene responsahile della sintesi di insulina umana.

Modello	Industria	Analita	Intervallo di misura

ExacTech	MediSense (U.S.)	Glucose	1.1-33.3 mM
Satelite G		Glucose	2.0-33.3 mM
Glucometer Elite	Bayer Diagnostic (Germany)	Glucose
i-STAT PCA	i-STAT Corp. Princeton (U.S.)	Glucose	2.9-23.6 mM
Mediasensor 2001	MedTest Systems (U.S.)	Glucose
BSE	ORION Anal. Technol. Inc. (U.S.)	Glucose	1.6-16.0 mM
	/ DOSIVIT (France)	Sucrose	1.6-16.0 mM
		Lactose	1.6-16.0 mM

Siero	Biosensore (mol/L l 10-4)	CV% (biosensore)	HPLC (mol/L l 10-4)	E%
1	4.4	4.5	4.3	2.3
2	5.2	2.3	5.2	0.0
3	5.5	4.0	5.3	3.8